生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_酵素の安定化方法および組成物 |
| 出願番号： | 2003345233 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12N 9/96,C12N 9/12 |
特許情報キャッシュ
中村 義之 木全 伸介 岡 正則 JP 4565311 特許公報(B2) 20100813 2003345233 20031003 酵素の安定化方法および組成物 東洋紡績株式会社 000003160 中村 義之 木全 伸介 岡 正則 JP 2002291491 20021003 20101020 C12N 9/96 20060101AFI20100930BHJP C12N 9/12 20060101ALI20100930BHJP JPC12N9/96C12N9/12 Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９ ＰｕｂＭｅｄ ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ） 特開平０４−０６６０８７（ＪＰ，Ａ） 国際公開第９９／０５５８５０（ＷＯ，Ａ１） 特開平１０−１７９１９５（ＪＰ，Ａ） 特表２０００−５０８５３０（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−０５６６９４（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−２３３３６２（ＪＰ，Ａ） 特開平１１−０６９９７３（ＪＰ，Ａ） 特開昭６２−１７４２９９（ＪＰ，Ａ） 特表平１０−５０７７５０（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−１８７０９５（ＪＰ，Ａ） 特開平０９−０５２８４５（ＪＰ，Ａ） 2 2004141162 20040520 8 20060907 伊達 利奈 本発明は酵素の安定化方法およびその組成物に関する。特に臨床診断に用いられる生体成分測定試薬に用いられる酵素の安定化方法およびその組成物に関する。 近年、臨床検査用試薬は液状化が主流となっている。そのため、臨床検査用試液を長期保存する場合、試液中への防腐剤の添加は不可欠である。このような目的で使用される防腐剤としては種々のものが挙げられるが、イソチアゾリン系化合物はｐＨが中性付近の溶液中に於ける防腐効果に優れ、酵素反応系への影響も少ない、等の利点を有する事から、上記した試液に添加される。しかしながら、チアゾリン系化合物は他方に於いて一部の酵素を失活させる作用を有しており、試液の保存期間も必然的に短くならざるを得ない。その為、イソチアゾリン系化合物を防腐剤として含む溶液中での酵素の効果的な安定化方法が望まれている現状にある。 本発明が解決しようとする課題は、防腐剤を含む溶液中において長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有した酵素溶液を提供することにある。 本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、イソチアゾリン系化合物と酵素の混合試液中に糖類を共存させることにより、酵素を液状状態で長期間安定に保つことを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は以下のようなものである。（１）安定化剤として糖類を共存させることを特徴とする、防腐剤共存下における酵 素の安定化方法。（２）防腐剤としてイソチアゾリン系化合物を用いる請求項１記載の酵素の安定化方 法。（３）糖類の添加濃度が防腐剤に対して０．０５〜５００倍量（Ｗ／Ｗ）である請求 項１または２記載の酵素の安定化方法。（４）安定化剤として糖類を共存させることを特徴とする、防腐剤共存下における酵 素の安定化組成物。（５）防腐剤としてイソチアゾリン系化合物を用いた請求項４記載の酵素の安定化組 成物。（６）糖類の添加濃度が防腐剤に対して０．０５〜５００倍量（Ｗ／Ｗ）である請求 項４または５記載の酵素の安定化組成物。 本発明においては、防腐剤を含む溶液中において糖類を共存させることで、長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有した酵素溶液を提供できる。 本発明の一実施態様は、安定化剤として糖類を共存させることを特徴とする、防腐剤共存下における酵素の安定化方法である。 本発明に用いる防腐剤は、試薬を保存している間の微生物の増殖を抑制することを目的として、試薬に添加される物質をいう。本発明における防腐剤としては特に限定されないが、中でもイソチアゾリン系防腐剤は酵素の失活が大きく効果が期待できる。イソチアゾリン系化合物としては、例えば２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＭＩＴ）、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＣＭＩＴ）、１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン（ＢＩＴ）等が挙げられる。また、一般に市販されているものとしては、混合物としてプロクリン１５０（スペルコ製、シグマアルドリッチジャパンより入手）、プロクリン３００（スペルコ製、シグマアルドリッチジャパンより入手）、アクチサイドＭＢＳ（ソー・ジャパン製）、単一製品としてアクチサイドＢ２０（Ｎ）（ソー・ジャパン製）、ＭＩＴ（ロシュ製、シグマ製）等が挙げられる。 防腐剤として抗生物質を使用する場合、微生物が比較的容易に、当該物質の膜透過性を抑制したり、当該物質を分解し無毒化する能力を獲得することができるため、耐性菌の発生を招き、実質的に試薬の防腐効果を失うことがよくあると考えられる。一方、Ｎ−メチルイソチアゾロン（N-Methylisothiazolone、略称ＭＩＴ）および／またはその誘導体などは、蛋白質のＳＨ基やアミノ基に直接作用することができるため、微生物が耐性を得ることが難しいと考えられる点でより好ましく、今後汎用されていく可能性が高い。 しかし、このような蛋白質に直接作用する防腐剤は当然、共存する酵素蛋白質にも作用するため、蛋白質の構造によっては不安定化を招く可能性がある。このように、防腐剤に対する耐性は、その防腐剤の作用機構と蛋白質の構造の両面に起因すると考えられる。 防腐剤の添加濃度は、防腐剤の種類や添加する試薬の組成などによって異なるのは当然であり、適当な添加濃度の決定は当業者が適宜実施できることである。十分な防腐能を有し診断薬用途に用いられる濃度範囲であれば特に限定されないが、例えば溶液中の下限濃度として０．０００１％、好ましくは０．００１％、更に好ましくは０．０１％である。上限濃度として１％、好ましくは０．５％、更に好ましくは０．１％である。 本発明における糖類は、単糖、二糖、オリゴ糖、環状オリゴ糖などの中から適宜選択され、特に限定されるものではない。例えばキシロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、メリビオース、リビトース、イノシトール、ズルシトール、グルシトール、グルコノ−１，５−ラクトン、Ｇ２−β−サイクロデキストリン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノコレート等が挙げられる。中でもシュークロースを骨格とする化合物、例えばシュークロース、ラクトシュークロース、ラフィノース、イヌロオリゴ糖類、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノコレート等が好適に用いられる。いずれも、市販のものなどを使用することができる。 本発明における糖類の添加濃度は防腐剤に対して、０．０１倍量（Ｗ／Ｗ）以上であり、好ましい下限は０．０５倍量（Ｗ／Ｗ）、好ましい上限は５００倍量（Ｗ／Ｗ）である。 糖類の濃度は種々の公知の方法で測定することができる。一般的に用いられる糖類の測定方法として、ソモジー法に代表される還元法やアンスロン法に代表されるフルフラール発色法、ガスクロマトグラフィー法やＨＰＬＣ法に代表されるクロマト法等が挙げられる。（参考文献１：石井暢編 臨床検査技術全書 第６巻 臨床化学検査 第１版第２刷、１９８０、医学書院、参考文献２：分析化学便覧 改定五版、２００１、社団法人 日本分析化学会） 防腐剤の濃度は種々の公知の方法で測定することができる。たとえば、イソチアゾリン系化合物は、ＨＰＬＣ分析により測定することができる。図１にその一例を示す。 本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、典型的には、５0mM HEPES (pH7.5)緩衝液中に、３Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼとイソチアゾリン系化合物とを共存させたとき、３５℃１４日間保存後の残存酵素活性が、調製直後と比較して、６７％以上、好ましくは８０％以上維持されていることをいう。なお、酵素活性測定法は、本願明細書記載の方法、市販品であればカタログ記載の方法、文献等に記載の方法などの中から当業者が適宜採用することができる。 本発明により安定化し得る酵素としては、通常の診断薬用途に用いられるものであれば特に限定される事はない。また、本発明により安定化されうる酵素の濃度は、通常臨床検査用試液に用いられる濃度範囲であれば特に限定されないが、本発明に好ましいものとして、イソチアゾリン系化合物により失活を受ける酵素が挙げられる。具体的には、グリセロールキナーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ等、が挙げられる。酵素は、いずれも、市販のものなどを使用することができる。 本発明の方法により安定化し得る溶液のｐＨとしては、酵素を不安定化する範囲でなければ特に限定されないが、好ましくは５．０〜９．０で選択される。このｐＨ範囲を維持する為には、適当な緩衝液が添加されるが、このような目的に添加される緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。なかでも、リン酸緩衝液、トリス緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。緩衝液は、いずれも、市販のものなどを使用することができる。 また、酵素溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。例えば中性脂肪測定試薬としては、一般にグリセロールキナーゼの他、リパーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有される。マグネシウム測定試薬としては、一般にグリセロールキナーゼの他、グリセロリン酸オキシダーゼ、グリセリン、ＡＴＰ、色源体が含有される。また、クレアチニン測定試薬としては、一般にザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼの他、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体などが含有される。また、クレアチン測定試薬としては、一般にザルコシンオキシダーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼの他、ペルオキシダーゼ、色源体などが含有される。これらの試薬類は、いずれも、市販のものなどを使用することができる。 グリセロールキナーゼの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。〈測定試薬〉（１）基質液 ０．３Ｍ グリセロール溶液（２）発色液１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９２ｍＭ ＡＴＰ１ｍＭ 塩化マグネシウム０．１ｇ／Ｌ フェノール０．２ｇ／Ｌ ４-アミノアンチピリン８ＫＵ／Ｌ グリセロリン酸オキシダーゼ５．５ＫＵ／Ｌ ペルオキシダーゼ〈測定条件〉（１）発色液３ｍＬをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に採り、酵素液０．１ｍＬを加え、 ゆるやかに混和後、３７℃で約５分間予備加温する。（２）グリセロール溶液０．０５ｍＬを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３７ ℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直 線部分から１分間当たりの吸光度を求める（ΔＯＤｔｅｓｔ）。（３）盲検は発色液３ｍＬに酵素溶液の代わりに酵素希釈液（２０ｍＭ Ｋリン酸緩 衝液、ｐＨ７．５）を０．１ｍＬ加え、上記同様に操作を行なって、１分間当たりの吸 光度変化を求める（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。（実施例１）グリセロールキナーゼ（東洋紡績製ＧＹＫ−３１１）３Ｕ／ｍＬ、各種糖類５ｇ／Ｌ含有し、防腐剤としてプロクリン３００（スペルコ製）を０．３ｍＬ／Ｌとなるように調製した下記試薬にて３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。（試薬の調製）下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５ グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ プロクリン３００ ０．３ｍＬ／Ｌ 各種糖類（名称は表に記載） ５ｇ／Ｌ結果 表１に示す。比較例では６６％まで活性が低下するのに対し、実施例では保存後も良好な安定性を示す。（実施例２）グリセロールキナーゼ（東洋紡績製ＧＹＫ−３１１）３Ｕ／ｍＬ、プロクリン３００（ロシュ製）０．３ｍＬ／Ｌ含有試薬に、シュークロース０〜５ｇ／Ｌとなるように添加濃度を変えて調製した試薬にて３５℃で１４日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。結果 表２に示す。０．０１％で安定化効果を認め、０．３％以上では更に良好な安定性を示す。（実施例３）グリセロールキナーゼ（東洋紡製ＧＹＫ−３１１）１２Ｕ／ｍＬ、プロクリン３００（スペルコ製）０．３ｍＬ／Ｌ、シュークロース５ｇ／Ｌ含有試薬を９℃にて６週間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合）を検討した。結果 表３に示す。比較例では６５％まで活性が低下するのに対し、実施例では低温保存下に於いても良好な安定性を示す。 本発明の防腐剤共存下における酵素の安定化方法は、防腐剤を含む溶液中において長期間安定な液状試薬として耐えうる等の特性を持つため、臨床検査分野で用いられる診断薬として優れており、産業界に寄与することが大である。イソチアゾリン系化合物のＨＰＬＣ分析方法の一例。イソチアゾリン系化合物の防腐剤の共存下におけるグリセロールキナーゼの安定化方法であって、安定化剤として０．１〜５．０ｇ／Lの、以下の（１）に示す群の中から少なくとも１種類以上の糖類を共存させることを特徴とする、酵素の安定化方法。（１）シュークロース、マルトース、イノシトール、グルシトール、グルコノ−１，５−ラクトン、シュークロースモノカプレートおよびシュークロースモノコレート イソチアゾリン系化合物の防腐剤の共存下におけるグリセロールキナーゼの安定化組成物であって、安定化剤として０．１〜５．０ｇ／Lの、以下の（１）に示す群の中から少なくとも１種類以上の糖類が共存していることを特徴とする、酵素の安定化組成物。（１）シュークロース、マルトース、イノシトール、グルシトール、グルコノ−１，５−ラクトン、シュークロースモノカプレートおよびシュークロースモノコレート