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出来尾 格 JP 2005040029 公開特許公報(A) 20050217 2003201185 20030724 嫌気性細菌を採取する方法、器具及びキット、ならびに嫌気性細菌を採取及び培養する方法及びキット 学校法人慶應義塾 899000079 間山 世津子 100098121 野村 健一 100107870 出来尾 格 7 C12N1/20 B01L1/00 C12M1/26 JP C12N1/20 Z C12N1/20 A B01L1/00 Z C12M1/26 5 1 ＯＬ 10 4B029 4B065 4G057 4B029AA02 4B029AA03 4B029AA08 4B029AA09 4B029BB02 4B029CC01 4B029CC02 4B029CC07 4B029DF10 4B029FA01 4B029GA02 4B029GA06 4B029GB05 4B029GB07 4B029GB08 4B029HA05 4B065AA01X 4B065BC05 4B065BC14 4B065BC39 4B065BC50 4B065BD50 4G057AB00 4G057AB34 4G057AC00 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、嫌気性細菌を採取する方法、器具及びキット、ならびに嫌気性細菌を採取及び培養する方法及びキットに関するものである。【０００２】【従来の技術】従来、ヒトの皮膚のような平面または柔軟な曲面に存在する細菌叢に含まれる嫌気性細菌を採取する場合、通常は非嫌気的条件下でサンプルを採取し、非嫌気的条件下でサンプルを希釈した上で培地に接種し、その後に嫌気的条件において培養を行っている。つまり採取から接種までの工程ではサンプルが酸素に触れてしまうが、この工程を嫌気的条件にて実施する場合には巨大な装置である嫌気チャンバー等が必要で、実用的ではなかった。【０００３】例えば従来ヒトの皮膚の細菌叢を採取する場合には、皮膚に円筒またはリングまたは穴の開いたシートを接着させて区分を作成し、その中を棒状の器具で削るか擦過する方法を取る。また採取したサンプルを培養する場合、界面活性剤を含む酸素を除去していない溶液にサンプルを懸濁して個々の菌体を分離した上で、嫌気環境下で数日間培養する（非特許文献１及び２）。この方法を用いて、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ等の嫌気性細菌を生菌の状態で、ある程度分離培養することができる。【０００４】【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｐ， Ｋｌｉｇｍａｎ ＡＭ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ４５： ４９８−５０３， １９６５【０００５】【非特許文献２】Ｋｅｙｗｏｒｔｈ Ｎ， Ｍｉｌｌａｒ ＭＲ， Ｈｏｌｌａｎｄ ＫＴ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２８： ９４１−３， １９９０【０００６】【発明が解決しようとする課題】しかし、嫌気度の高い嫌気性細菌は、酸素暴露後数秒から数十分で死滅することが知られている。そのため、細菌叢から嫌気度の高い嫌気性細菌を分離培養する場合や、嫌気性細菌をより多く分離培養する場合には、従来の採取・培養法をそのまま実施するだけでは限界がある。【０００７】そのため採取環境をできるだけ酸素のない状態にすることが望まれる。その場合、嫌気チャンバー内にサンプルを入れるか、酸素を含まないガスで採取面を密閉する必要がある。嫌気チャンバー内にサンプルを入れる場合、装置が大掛かりな上、大量のガスが検査対象のヒト・動物に悪影響を与える可能性がある。また、酸素を含まないガスで採取面を密閉する場合、密閉空間内で採取作業を行うために特殊な器具を開発する必要があるが、その実施の報告はまだない。【０００８】本発明は、このような従来の採取・培養法の問題点を解決しようとするもので、細菌叢の採取・培養のほぼ全工程を、比較的簡便かつ安全に嫌気的環境下で実施できるようにすることを目的とする。【０００９】【課題を解決するための手段】本発明者は、空気より比重の重い嫌気的ガスが下方へ移動する現象を利用して、円筒状の器具にガスを吹き込む操作により被採取面をガスで覆い、細菌叢の採取工程を比較的簡便かつ安全に嫌気的環境下で行い、かつ、界面活性剤を含む溶液から酸素を除去しガスで封入することにより、採取したサンプルを嫌気的に懸濁し培養することを実現させた結果、嫌気性細菌を取得することに成功し、本発明を完成させるに至った。【００１０】本発明の要旨は以下の通りである。［１］ 区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取し、酸素を除去した溶液に懸濁させることを含む、嫌気性細菌を採取する方法。［２］ 嫌気性細菌を採取するために用いられる、側面にガス吹き込み口を有する円筒状の器具。［３］ ［２］記載の器具を含む、嫌気性細菌を採取するためのキット。［４］ 区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取し、酸素を除去した溶液に懸濁させた後、嫌気的条件下で培養することを含む、嫌気性細菌の採取及び培養方法。［５］ ［２］記載の器具及び培地を含む、嫌気性細菌を採取及び培養するためのキット。【００１１】【発明の実施の形態】本発明の好ましい態様を図面を参照しつつ、説明する。本発明の嫌気性細菌を採取する方法の一例を図１に示す。被採取面１（例えば、ヒトの額、頬、腕、足、腹、背中、剃毛した頭などの皮膚など）を水平に配置して、これに円筒状の器具２を垂直に密着させた状態で手などにより固定し、吹き込み口３から嫌気的ガスを吹き込む（図１（ａ））。被採取面１を区切るために用いる器具は、円筒状の形状のものに限られるわけではなく、角柱状、円錐状、角錐状、半球状などいかなる形状の器具であってもよい。嫌気的ガスの例としては、二酸化炭素、窒素、二酸化炭素・窒素混合ガス、アルゴンなどを挙げることができる。この際に吹き込むガスの流量は３−５ ｍｌ ／ ｓｅｃとするのが好ましい。吹き込み開始から１０秒以上経過した後に、試験管４にゴム栓５を用いて封入されている１ ｍｌの溶液６（酸素が除去されている）の一部にて湿らせた滅菌綿棒７（図１（ｂ））を操作口８から静かに挿入し、被採取面１を滅菌綿棒７にて往復運動にて擦過する（図１（ｃ））。擦過する時間は２０−６０秒が好ましく、往復運動は５０回以上まんべんなく行うことが好ましい。以上の操作により、区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取することができる。ここで、「細菌叢」とは、被採取面の最外層に付着する生きた微生物と、被採取面の擦過により採取される細胞層に含まれる生きた微生物の、総体のことをいう。【００１２】その後速やかに、擦過溶液を含む滅菌綿棒７を溶液６の残りが入っている試験管に戻し（図１（ｄ））、滅菌綿棒７の先端部を、試験管４に挿入した上でこの口部で折り、試験管４に入れられた溶液６の中に落とし込む（図１（ｅ））。更に速やかにゴム栓５を試験管４にねじり込む（図１（ｆ））。これで採取は完了となり、ほぼ１ ｍｌの溶液６の中に被採取面１の擦過物と滅菌綿棒７の先端が入った状態になる。すなわち、採取された細菌叢は酸素を除去した溶液に懸濁されることになる。【００１３】溶液６は、嫌気性細菌を生菌の状態で一時的に保存し、かつ容易に個々の菌体を分離させるための溶液である。その内容は以下の通りであるが、本発明の目的が達成される限り、この組成を変更してもよい。細菌叢を懸濁させる溶液６は、界面活性剤を含むことが好ましい。以上を混和したものを、１ ｍｌずつ小試験管に分注し、試験管内の空気を嫌気性ガスにて置換してゴム栓をし、加圧加熱滅菌する。試験管内の空気を嫌気性ガスにて置換することにより、溶液６中の酸素が除去される。【００１４】本発明の嫌気性細菌を採取するために用いられる器具の一例を図２に示す。この器具は、側面にガス吹き込み口を有する円筒状の形状である。円筒の内径は２ 〜 ４ ｃｍ（例えば、２．５ ｃｍ）で、外径は２．５ 〜４．５ ｃｍ（例えば、２．９ ｃｍ）であり、高さは４ 〜 ６ ｃｍ（例えば、５ ｃｍ）であるとよい。材質としては、プラスチック、ガラス、銀鍍金された金属などが好ましい。ガス吹き込み口３は、内径が０．４〜 ０．７ ｃｍ（例えば、０．５ ｃｍ）で、外径が０．８ 〜 １．１ ｃｍ（例えば、０．９ ｃｍ）であり、長さが０．５ 〜 ２ ｃｍ（例えば、１ ｃｍ）のホース状の形状であるとよい。材質としては、プラスチック、ガラス、銀鍍金された金属などが好ましい。円筒とガス吹き込み口の材質は同じであることが好ましい。【００１５】本発明の嫌気性細菌を採取するためのキットを構成する要素の一例を図３に示す。１回の採取に必要な要素は、嫌気的ガスが封入されている小ガスボンベ、円筒状の器具２（図２に示したもの）、溶液６を封入して滅菌した試験管及び滅菌綿棒７である。これらの１回分または複数回分をまとめてキットとする。上記の要素以外のものとして、円筒状の器具２を接続するゴム管、滅菌ピペットなどが挙げられる。これらは比較的安価であるか、多くの実験室に常備されているものである。【００１６】図１に示した方法で採取した嫌気性細菌を培養する方法の一例を図４に示す。図１に示した方法で用いた溶液６、被採取面１の擦過物及び滅菌綿棒７の先端が入った試験管４を振とう混和する。振とう混和の際は、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて、２０秒から４０秒混和するのが好ましい。この混合液９の０．３ ｍｌを滅菌ピペットにて採取し、溶液１０の入った試験管１１のゴム栓１２を外して溶液１０の２．７ ｍｌに注入し、ゴム栓１２をねじ込んだ上で同様に振とう混和する。これにより１０倍希釈液３．０ ｍｌができる。以下同様に１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍希釈液を作る。【００１７】１０倍、１０３倍、１０５倍希釈液を各０．５ ｍｌ採取し、寒天培地（好気培養用）１３に接種する。これを好気培養装置に入れ、大気中で３７℃にて培養する。２日（１／２ 〜 １ 日前後してもよい）後、培養装置から取り出し、目視によるコロニー形態ごとのコロニー数を、コロニー形態と菌種名を対照したアトラスを参照して計数する。同様に、各０．５ ｍｌを寒天培地（嫌気培養用）１４に接種し、嫌気培養装置に入れ、嫌気性ガス下で３７℃にて培養する。７日（１ 〜３ 日前後してもよい）後、培養装置から取り出し、同様に計数する。寒天培地（好気培養用）１３の内容は以下の通りであるが、本発明の目的が達成される限り、この組成を変更してもよい。以上を混和し、シャーレに敷いたもの。なお、好気的培養に用いる培地は、寒天培地に限定されるわけではなく、他の固体培地、液体培地などであってもよい。【００１８】寒天培地（嫌気培養用）１４の内容は以下の通りであるが、本発明の目的が達成される限り、この組成を変更してもよい。以上を混和し、シャーレに敷いたもの。なお、嫌気的培養に用いる培地は、寒天培地に限定されるわけではなく、他の固体培地、液体培地などであってもよい。【００１９】嫌気培養装置を用いる代わりに、次の方法で代替とすることもできる。密閉できるタッパーウェアに酸素吸収剤を入れた上で嫌気性ガスを満たしたものを作成し、これに接種済みの寒天培地（嫌気培養用）を静置し、タッパーウェアごと好気培養装置に入れる。【００２０】これで培養は終了となる。この方法により好気培養・嫌気培養それぞれの菌種ごとの菌数が計数結果より逆算できる。また、それぞれのコロニーを微生物学的手法により釣菌し、単一コロニーに含まれる生菌を用いた追加実験をすることも可能である。【００２１】溶液１０は、溶液６と同様の製法により作成されるが、全量が２．７ ｍｌである点のみが溶液６と異なるものである。【００２２】本発明の嫌気性細菌を採取及び培養するためのキットを構成する要素の一例を図５に示す。１回の採取及び培養に必要な要素は、嫌気的ガスが封入されている小ガスボンベ、円筒状の器具２（図２に示したもの）、溶液６、溶液１０、滅菌綿棒７、酸素吸収剤（例えば、Ａｎａｅｒｏｐａｃｋ（登録商標）など）、寒天培地（好気培養用）１３及び寒天培地（嫌気培養用）１４である。これらの１回分または複数回分をまとめてキットとする。【００２３】上記の要素以外のものとして、ガスボンベと円筒状の器具２を接続するゴム管、嫌気培養装置として用いる密閉できるタッパーウェア、好気培養装置、コロニー形態と菌種名を対照したアトラス、Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ、滅菌ピペットなどが挙げられる。これらは比較的安価であるか、多くの実験室に常備されているものである。【００２４】【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。【００２５】１６人の健常人の前額部皮膚を対象として、二酸化炭素を嫌気性ガスとして用いた。すなわち１００ ％二酸化炭素を蔵するボンベ、１００ ％二酸化炭素により封入した溶液６・溶液１０を準備した。【００２６】被験者を座らせ、被採取面１である前額部皮膚を水平にするよう頭部を配置し、円筒状の器具２を垂直に密着させた。吹き込み口３から１００ ％二酸化炭素を３ ｍｌ ／ ｓｅｃで吹き込み、１０秒経過の後に、試験管４にゴム栓５を用いて封入されている１ ｍｌの溶液６の一部にて湿らせた滅菌綿棒７を操作口８から静かに挿入し、被採取面１を滅菌綿棒７にて３０秒間、６４回往復運動にて擦過した。その後速やかに、擦過溶液を含む滅菌綿棒７を溶液６の残りが入っている試験管に戻し、滅菌綿棒７の先端部を、試験管４に挿入した上でこの口部で折り、試験管４に入れられた溶液６の中に落とし込み、ゴム栓５を試験管４にねじり込んだ。これで採取は完了である。【００２７】試験管４をＶｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒを用いて、２５秒混和した。この混合液９の０．３ ｍｌを滅菌ピペットにて採取し、溶液１０の２．７ ｍｌに加え、同様に振とう混和した。これにより１０倍希釈液３．０ ｍｌができた。以下同様に１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍希釈液を作った。このうち１０倍、１０３倍、１０５倍希釈液を各０．５ ｍｌ採取し、ＴＳ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ ４０ ｇを、１０００ ｍｌの蒸留水に溶かして作成したもの）に接種した。これを好気培養装置（Ｅｙｅｌａ社製Ｖａｃｃｕｍ ｏｖｅｎ、ＶＯＳ−６００ＳＤ）に入れ、大気中で３７℃にて２日間培養し、目視によるコロニー形態ごとのコロニー数を、コロニー形態と菌種名を対照した自製のアトラスを参照して計数した。同様に、各０．５ ｍｌをＥＧ培地（Ｍｅｒｃｋ社製Ｅｇｇｅｒｔｈ Ｇａｇｎｏｎ Ａｇａｒ （Ｂａｓｉｓ） ３９．３ ｇと、関東化学社製Ｔｗｅｅｎ ８０ ０．５ ｇを、１０００ ｍｌの蒸留水に溶かして作成したもの）に接種し、嫌気培養装置（平山製作所製嫌気製培養ジャーＪ型を、Ｅｙｅｌａ社製Ｖａｃｃｕｍ ｏｖｅｎ、ＶＯＳ−６００ＳＤ内に静置したもの）にて、１００ ％二酸化炭素下で３７℃にて７日間培養し、同様に計数した。これで培養は完了である。この実施１６例における皮膚表面の細菌の同定・計数結果を表１に示す。【００２８】【表１】【００２９】また、この実施例において本発明の効果を検証するため、吹き流しと溶液封入に、１００ ％二酸化炭素の代わりに大気を用いた実験を行い、表２に示す結果を得た。【００３０】【表２】【００３１】【発明の効果】本発明により、細菌叢の採取工程を比較的簡便かつ安全に嫌気的環境下で実施することができるようになった。また、本発明により、細菌叢の培養工程を嫌気的環境下で実施することができるようになった。本発明のキットを用いれば、細菌叢の採取および培養の全工程に必要な器具をまとめて入手することができる。【図面の簡単な説明】【図１】本発明の嫌気性細菌を採取する方法の一例を示す。【図２】本発明の嫌気性細菌を採取するために用いられる器具の一例の全体斜視図を示す。【図３】本発明の嫌気性細菌を採取するためのキットを構成する要素の一例を示す。【図４】図１に示した方法で採取した嫌気性細菌を培養する方法の一例を示す。【図５】本発明の嫌気性細菌を採取及び培養するためのキットを構成する要素の一例を示す。【符号の説明】１・・・被採取面２・・・円筒状の器具３・・・吹き込み口４・・・試験管５・・・ゴム栓６・・・溶液７・・・滅菌綿棒８・・・操作口９・・・混合液１０・・・溶液１１・・・試験管１２・・・ゴム栓１３・・・寒天培地（好気培養用）１４・・・寒天培地（嫌気培養用） 区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取し、酸素を除去した溶液に懸濁させることを含む、嫌気性細菌を採取する方法。 嫌気性細菌を採取するために用いられる、側面にガス吹き込み口を有する円筒状の器具。 請求項２記載の器具を含む、嫌気性細菌を採取するためのキット。 区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取し、酸素を除去した溶液に懸濁させた後、嫌気的条件下で培養することを含む、嫌気性細菌の採取及び培養方法。 請求項２記載の器具及び培地を含む、嫌気性細菌を採取及び培養するためのキット。 【課題】細菌叢の採取・培養のほぼ全工程を、比較的簡便かつ安全に嫌気的環境下で実施できるようにすること。【解決手段】区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取し、酸素を除去した溶液に懸濁させることを含む、嫌気性細菌を採取する方法。嫌気性細菌を採取するために用いられる、側面にガス吹き込み口を有する円筒状の器具。前記の器具を含む、嫌気性細菌を採取するためのキット。区切られた区域内に存在する細菌叢を嫌気的ガスの吹き流し下に採取し、酸素を除去した溶液に懸濁させた後、嫌気的条件下で培養することを含む、嫌気性細菌の採取及び培養方法。前記の器具及び培地を含む、嫌気性細菌を採取及び培養するためのキット。【選択図】 図１

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