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| タイトル： | 公開特許公報(A)_ＤＮＡ合成酵素阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤 |
| 出願番号： | 2003197516 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C07J9/00,A61K31/575,A61K35/84,A61P31/18,A61P35/00,A61P37/00,A61P43/00,C12N9/99 |
特許情報キャッシュ
秋久 俊博 水品 善之 浮谷 基彦 押久保 学 JP 2005035897 公開特許公報(A) 20050210 2003197516 20030716 ＤＮＡ合成酵素阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤 学校法人日本大学 899000057 浅村 皓 100066692 浅村 肇 100072040 高松 武生 100107146 安藤 克則 100107504 秋久 俊博 水品 善之 浮谷 基彦 押久保 学 7 C07J9/00 A61K31/575 A61K35/84 A61P31/18 A61P35/00 A61P37/00 A61P43/00 C12N9/99 JP C07J9/00 A61K31/575 A61K35/84 A A61P31/18 A61P35/00 A61P37/00 A61P43/00 111 C12N9/99 5 ＯＬ 10 4C086 4C088 4C091 4C086AA01 4C086AA02 4C086DA11 4C086MA01 4C086MA04 4C086NA14 4C086ZB07 4C086ZB26 4C086ZB33 4C086ZC20 4C088AA04 4C088AC17 4C088BA10 4C088BA32 4C088CA06 4C088CA14 4C088NA14 4C088ZB07 4C088ZB26 4C088ZB33 4C088ZC20 4C091AA02 4C091BB10 4C091BB20 4C091CC01 4C091DD01 4C091EE07 4C091FF02 4C091FF06 4C091GG01 4C091HH01 4C091JJ03 4C091KK01 4C091LL03 4C091LL06 4C091MM03 4C091NN01 4C091PA02 4C091PA05 4C091PB05 4C091QQ01 4C091RR13 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、デヒドロトラメテノン酸（化学名、３−オキソラノスタ−７、９（１１）、２４−トリエン−２１−オイン酸）、それを有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤又はＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤に関する。【０００２】【従来の技術】従来から、ＤＮＡ合成酵素群及びＤＮＡトポイソメラーゼ群が細胞の増殖、分裂、分化等に関与していることが知られている。そして、ＤＮＡ合成酵素阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤は、癌の場合には癌細胞の増殖抑制作用、エイズの場合にはＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用、免疫抑制作用の場合には抗原に対する特異的抗体産生を抑制すると考えられている。そこで、ＤＮＡ合成酵素阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤は、癌、エイズ及び免疫疾患治療薬及び予防効果のある医薬品の開発が期待される。【０００３】ＤＮＡ合成酵素阻害群は、癌やエイズ等の疾病において、さらには、免疫担当細胞による抗体産生等において重要な要因の一つであることが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。現在、ＤＮＡ合成酵素阻害剤としては、ジデオキシＴＴＰ（ｄｄＴＴＰ）、Ｎ・メチルマレイミド、ブチルフェニル・ｄＧＴＰ等が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにも、ＤＮＡ合成酵素阻害作用が見出されている（例えば、特許文献２参照。）。ＤＮＡトポイソメラーゼは、ＤＮＡの複製、転写、組換え等あらゆるＤＮＡ代謝に関わる重要な酵素であり、その阻害剤はヒト癌の治療においてイリノテカン、エトポシド等多くの重要な抗癌剤として使用されている。【０００４】【特許文献１】特開平１１−１０６３９５号公報【特許文献２】特開２０００−１４３５１６号公報【非特許文献１】Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、１９９１年、６０巻、５１３〜５５２頁【０００５】【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡトポイソメラーゼの阻害を介した癌細胞の増殖能の抑制により、腫瘍及び免疫疾患の領域において治療効果をもたらす、ＤＮＡ合成酵素阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤を提供することである。【０００６】本発明の阻害剤は、癌及びエイズの発症、進行を予防する作用あるいは治癒、また臓器移植時の免疫抑制作用をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用されるが、とりわけ抗癌剤、抗ウイルス剤及び免疫抑制剤として有効である。また、これら疾患の予防剤として使用することも可能である。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明等は、デヒドロトラメテノン酸（化学名、３−オキソラノスタ−７、９（１１）、２４−トリエン−２１−オイン酸）、それを有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤又はＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤が、前記の課題を解決するのに有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】デヒドロトラメテノン酸は、例えば、茯苓又は茯苓皮から、メタノール等の水溶性溶媒を用いて抽出し、抽出物をクロロホルム等の非水系溶媒と水とで溶剤分別後、非水系溶媒画分、又は茯苓又は茯苓皮からクロロホルム等の非水系溶媒で直接抽出した抽出物から得ることができる。【０００９】【発明の実施の形態】本発明のデヒドロトラメテノン酸（以下、「化合物１」ということがある。）の構造式は、下記のとおりである。この化合物は、以下に述べるような方法により、茯苓、好ましくは茯苓皮より効率よく抽出されるものである。【００１０】【化１】【００１１】本発明のデヒドロトラメテノン酸は、ＤＮＡ合成酵素阻害剤又はＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤の有効成分となるが、これを換言すると、α、β型ＤＮＡ合成酵素及びＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害作用を有し、癌、エイズ治療剤及び免疫抑制剤となり得るということである。【００１２】前記のとおり、本発明のデヒドロトラメテノン酸の化学名は、下記のとおりである。化合物１：３−オキソラノスタ−７、９（１１）、２４−トリエン−２１−オイン酸（３−ｏｘｏｌａｎｏｓｔａ−７、９（１１）、２４−ｔｒｉｅｎ−２１−ｏｉｃ ａｃｉｄ）【００１３】【実施例】次に、本発明の実施例を示す。【００１４】実施例１図１は、本発明のデヒドロトラメテノン酸を得るための作業工程を示す。茯苓皮は、中国・雲南省医薬保険品進出口公司より入手した。乾燥茯苓皮（１ｋｇ）を粉砕後抽出フラスコに入れ、メタノール（３Ｌ）を加え、加熱還流下３時間抽出を行った。同様な抽出操作は全部で３回繰り返し行い、ロータリーエバポレーターを用いて抽出液からメタノールを留去し抽出エキスを得た（９６ｇ）。混在する水溶性多糖類を取り除くためにエキスをクロロホルム‐水系で溶剤分別を行った。得られたクロロホルム層は５％水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、中性クロロホルム層を得、溶媒を留去後中性のクロロホルム可溶画分（６．９ｇ）を得た。上記クロロホルム可溶画分はシリカゲル（２００ｇ）を担体とし、展開溶媒としてヘキサン‐酢酸エチル（０：１→１：０）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、９つのフラクション（Ｆｒ．Ａ〜Ｆｒ．Ｉ）に分画した。ヘキサン‐酢酸エチル（７：３）で溶出したＦｒ．Ｆ（０．６５ｇ）はメタノールから結晶化を行い、メタノール不溶部（０．１５ｇ）と可溶部（０．４８ｇ）を得た。次いで不溶部の逆層ＨＰＬＣ［カラム：Ｐｅｇａｓｉｌ ＯＤＳ（２５ｃｍ ｘ内径１０ｍｍ ｉ．ｄ．）；溶離液：９０％メタノール；溶離液流速：２．０ｍＬ／分］を行い、デヒドロトラメテノン酸（２４ｍｇ；溶出保持時間：２８．５分）を得た。【００１５】化合物１は、ＭＳ、ＩＲ、ＵＶ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ及びＮＯＥＳＹ法によって構造式を決定した。図２は、化合物１の炭素番号とＮＯＥＳＹ法における主要なＮＯＥとの相関を示す。また、表１に、ピリジン−ｄ５中で測定した１３Ｃ−ＮＭＲ、１Ｈ−ＮＭＲ及びＨＭＢＣのデータを示す。【００１６】【表１】【００１７】化合物１の諸性質及びスペクトルデータ（ＮＭＲデータを除く）を次に示した。無色針状結晶、ｍｐ２３３−２３５℃。［α］２５Ｄ＋１４．８°（ｃ０．３５、クロロホルム）。ＵＶ（エタノール）λｍａｘ２３６、２４３、２５２ｎｍ。ＩＲ νｍａｘ１７１３、１６９８、１６５６、８１３ｃｍ−１（ＫＢｒ）。ＥＩＭＳ（％）ｍ／ｚ ４５２［Ｍ］＋（１００）、４３７（２４）、４３４（９）、３７０（１１）、３１１（２７）、３０９（４０）、２７０（３２）、２６９（３８）、２５７（１４）、２５５（１２）、２４４（２０）、２２９（８）、６９（２５）。高分解能ＥＩＭＳ ｍ／ｚ ４５２．３２９０（計算値Ｃ３０Ｈ４４Ｏ３［Ｍ］＋、４５２．３２８７）。【００１８】化合物１はＭＳ及び１３Ｃ−ＮＭＲ ＤＥＰＴから分子式Ｃ３０Ｈ４４Ｏ３を持つことが示された。この化合物はオキソ基［νｍａｘ１６９８ｃｍ−１；δＣ２１５．１］、カルボキシル基［νｍａｘ１７１３ｃｍ−１；δＣ１７８．５］、Δ７、９（１１）−共役ジエン系［λｍａｘ２３６、２４３、２５２ｎｍ；νｍａｘ８１３ｃｍ−１；δＨ５．３４（１Ｈ、ｂｒ ｓ）、５．５７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ）］、末端イソプロピリデン基［δＨ１．６３、１．６７（各３Ｈ、ｓ）、５．３３（１Ｈ、ｂｒｓ）；δＣ１７．７、２５．８（各ｑ）、１２４．８（ｄ）］、５個の第三級メチル基［δＨ０．９７、１．０１、１．０６、１．１３、１．１４（各ｓ）］を有している。これらのデータ及びｍ／ｚ３１１［側鎖（Ｃ８Ｈ１３Ｏ２）の脱離］、３１１（３１３−２Ｈ）、２６９（側鎖の脱離−４２）、２５５（２６９−ＣＨ２）のＭＳ開裂イオンの存在から化合物１はΔ７、９（１１）−ジエン系、イソプロピリデン基とＣ−２１がカルボキシル化されたＣ８−側鎖を持つ３−オキソ四環性トリテルペン骨格を持つことが示唆された。さらに、１３Ｃ−及び１Ｈ−ＮＭＲデータ（表１）のデヒドロエブリコン酸の文献値（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、１９９５年、３９巻、１１６５〜１１６９頁）との比較、さらには１Ｈ−１ＨＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、及びＨＭＢＣスペクトルの解析から、化合物１は３−ｏｘｏｌａｎｏｓｔａ−７、９（１１）、２４−ｔｒｉｅｎ−２１−ｏｉｃ ａｃｉｄ（デヒドロトラメテノン酸と命名）の構造を持つことが明らかとなった。化合物１はさらにＮＯＥＳＹスペクトルにおいて、分子のα−側で［Ｈ−２８（４α−Ｍｅ）〜Ｈ−５α］及び［Ｈ−３０（１４α−Ｍｅ）〜Ｈ−１７α］間に、一方β‐側で［Ｈ−２９（４β−Ｍｅ）〜Ｈ−１９（１０β−Ｍｅ）〜Ｈ−１８（１３β−Ｍｅ）−Ｈ−２０］間に顕著なＮＯＥ相関を示し（図２）、与えた構造が正しいことが裏付けられた。【００１９】ＤＮＡ合成酵素阻害活性の検証上記実施例で得たデヒドロトラメテノン酸のＤＮＡ合成酵素群に対する活性を以下の方法で測定した。ＤＮＡ合成酵素として哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素α、βについて試験を行った。ＤＮＡ合成酵素αは、牛胸腺から常法により抽出精製した標品を、ＤＮＡ合成酵素βは、ラット由来の該当遺伝子を通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み、生産させた標品を用いた。【００２０】これらのＤＮＡ合成酵素に対するデヒドロトラメテノン酸の阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸ＩＶ、東京化学同人、６３頁〜６６頁）を用いた。すなわち、放射性同位元素で標識した［３Ｈ］−ＴＴＰを含む系においてＤＮＡ合成反応を行い、放射比活性を生成物（合成ＤＮＡ鎖）量の指標とするものである。阻害率は、（ａ）コントロールでの合成ＤＮＡ量、（ｂ）デヒドロトラメテノン酸存在下での合成ＤＮＡ量について、（ａ−ｂ）／ａＸ１００＝阻害率（％）として評価した。得られた結果を図３に示す。すなわち、図３は、哺乳動物由来の各ＤＮＡ合成酵素に対する阻害効果を示す。【００２１】図３の結果より、デヒドロトラメテノン酸は、哺乳動物のＤＮＡ合成酵素α及びβを阻害することがわかる。デヒドロトラメテノン酸の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は４５．５μＭ（α）及び８６．５μＭ（β）であった。ＤＮＡ合成酵素αは複製型のＤＮＡ合成酵素であるため、癌細胞のような細胞分裂がさかんな細胞や組織に対してのみ本酵素活性が高い。従って、デヒドロトラメテノン酸は抗癌剤としての作用を有することが期待される。ＤＮＡ合成酵素には、このα型の他にβ型、γ型、δ型及びε型のものがあることが知られている。これらのＤＮＡ合成酵素のうち、δ型及びε型は、α型のものと生化学的類型にあると考えられている。ここで、生化学的類型とは、次のような酵素機能としての共通性を有することを指す。（１）特定の化合物に対する感受性の有無・・・例えばこれら３種のＤＮＡ合成酵素は共に、Ｎ・メチルマレイミド及びブチルフェニル・ｄＧＴＰに対する感受性を持つが、ジデオキシＴＴＰ（ｄｄＴＴＰ）に対する感受性を持たない。（２）忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）・・・鋳型ＤＮＡに対するＤＮＡ合成の高い正確さを持つ。（３）反応の場・・・これら３種のＤＮＡ合成酵素は共に細胞分裂と連動するＤＮＡ複製に直接的に関与している。ＤＮＡ合成酵素α型（δ型及びε型も生化学的類型として含む）は、一般に細胞周期に応じてＤＮＡ合成を司ると考えられている。従って、ＤＮＡ合成酵素α（δ型及びε型も生化学的類型として含む）に対する阻害活性を有するデヒドロトラメテノン酸は、連続的かつ急激に細胞増殖を生じている癌細胞に対する増殖抑制能を有し得るものと考えることができる。本発明者らは、デヒドロトラメテノン酸はα型のＤＮＡ合成酵素の他に、δ型及びε型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害活性も有すると考えている。一方、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応のＤＮＡ再構成において抗原特異的に反応する抗体あるいはレセプター分子を作り出す根源に関与するとともに、変異による抗体の多様性に一定の役割を果たしているともいわれている。これらのことから、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応に密接に関与し、ＤＮＡ合成酵素βを抑制することは、免疫反応の抑制につながると推測される。従って、デヒドロトラメテノン酸は免疫抑制剤としての作用を有することも期待される。【００２２】ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害活性の検証上記実施例で得たデヒドロトラメテノン酸のＤＮＡトポイソメラーゼ群に対する活性を以下の方法で測定した。Ｉ型及びＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼは組換えヒト由来の市販標品（ＴｏｐｏＧＥＮ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いた。【００２３】文献（Ｍｉｚｕｓｈｉｎａ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．誌，２００２年，３５０巻，７５７〜７６３頁）に記載の方法に従い、Ｉ型ＤＮＡトポイソメラーゼ活性はカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ，ＣＰＴ）を、ＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼはエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，ＶＰ−１６）を陽性対照として、スーパーコイル（超ラセン，フォームＩ）を持った環状プラスミドＤＮＡの弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ，フォームＩＩ）反応で酵素活性を測定した。反応後、反応液を平板アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルを臭化エチジウム染色後、反応生成物のＤＮＡ量の変化から、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。得られた結果を表２に示す。【００２４】【表２】【００２５】表２の結果より、デヒドロトラメテノン酸はＩＩ型のＤＮＡトポイソメラーゼを阻害したが、Ｉ型のＤＮＡトポイソメラーゼは阻害しなかった。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）はＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼの方がＤＮＡ合成酵素群よりも低いことから、ＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼによる阻害効果の方がより有効であることが期待される。ＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼはＤＮＡの二本鎖を切断・再結合させることによりねじれを解消させる、ＤＮＡのトポロジーを変化させる酵素である。細胞分裂の進行においてこのトポロジー変化は必須であることから、ヒトＩＩ型ＤＮＡトポイソメラーゼに対する阻害物質は、抗癌剤としての応用が期待できる。【００２６】細胞増殖阻害活性の検証化合物１のヒト胃癌細胞増殖抑制効果を、次の方法を用いて評価した。本実験に用いた細胞は、ヒト胃癌由来ＮＵＧＣ−３細胞である。培地としてはＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）に、牛胎児血清１０％（ｖ／ｖ）を添加したものを用いた。培養は、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で行った。【００２７】上記に示した培地に、予め各試験濃度になるように化合物１を溶解した。ただし化合物１は水に難溶であるため、一度ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培地中の培地内に存在するＤＭＳＯの終濃度は、すべての試験区で１％以下になっており、本測定例で用いたＮＵＧＣ−３細胞の増殖の抑制にＤＭＳＯが関わる可能性は否定できる状態である。本試験のための培養は、９６穴マイクロプレートで行った。各ウエルに３．０ｘ１０５個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し３ウエルずつ与えた。またポジティブコントロールとして培地に１％のＤＭＳＯを含むものを用いた。【００２８】化合物１を添加後は、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で４８時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献（「Ｒａｐｉｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａ １：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙｓ」、Ｔｉｍ Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８３年、６５巻、５５〜６３頁）に記載されているＭＴＴアッセイ法を用いた。即ち、上記４８時間後テトラゾリウム塩ＭＴＴを添加し、さらに４時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、５７０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）で定量した。細胞生存率は、次の式により算出した。細胞生存率（％）＝試験区のＯ．Ｄ．［５７０ｎｍ］／対照区のＯ．Ｄ．［５７０ｎｍ］得られた結果を、図４に示す。すなわち、図４は、化合物１のヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ−３に対する細胞増殖阻害効果を示す。なお、図４に示すデータは、３ウエルの平均値である。【００２９】化合物１は癌細胞の増殖を濃度依存的に阻害した。図４の結果から、化合物１の５０％増殖阻害濃度（ＬＤ５０）は６２．５μＭであった。【００３０】【発明の効果】本発明によれば、癌及びエイズの発症、進行を予防する作用あるいは治癒、また臓器移植時等の免疫抑制作用に極めて有用なＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤が提供される。該当阻害剤は単独作用により、癌細胞を死滅させる機能を有する。また、本発明によれば、デヒドロトラメテノン酸は癌、エイズ、免疫疾患に対する予防あるいは治療のための医薬品として活用され得る。【図面の簡単な説明】【図１】本発明のデヒドロトラメテノン酸を得るための作業工程を示す。【図２】化合物１の炭素番号とＮＯＥＳＹ法における主要なＮＯＥとの相関を示す。【図３】哺乳動物由来の各ＤＮＡ合成酵素に対する阻害効果を示す。【図４】化合物１のヒト胃癌細胞ＮＵＧＣ−３に対する細胞増殖阻害効果を示す。 デヒドロトラメテノン酸（化学名、３−オキソラノスタ−７、９（１１）、２４−トリエン−２１−オイン酸）。 デヒドロトラメテノン酸を有効成分とするＤＮＡ合成酵素阻害剤。 デヒドロトラメテノン酸を有効成分とするＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤。 茯苓又は茯苓皮から抽出されたことを特徴とする請求項１〜３に記載の物。 茯苓又は茯苓皮からメタノール等の水溶性溶媒を用いて抽出し、抽出物をクロロホルム等の非水系溶媒と水とで分別後、非水系溶媒画分、又は茯苓又は茯苓皮からクロロホルム等の非水系溶媒で直接抽出した抽出物から目的物を得ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の物の製造方法。 【課題】新規なＤＮＡ合成酵素阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤を提供すること。【解決手段】茯苓及び茯苓皮をメタノール等の有機溶媒で抽出し、抽出物をクロロホルム等の水不溶性有機溶媒と水とで溶剤分別を行い、有機溶媒可溶性画分から、シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣを行うことにより得られる以下の構造式で示されるデヒドロトラメテノン酸（化合物１）、又はこれを含むＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害組成物。【選択図】 なし