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| タイトル： | 特許公報(B2)_ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質 |
| 出願番号： | 2003049132 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | A61K 36/48,A61K 36/75,A61K 36/899,A61K 8/97,A61P 37/04,A61P 37/08,A61P 43/00 |
特許情報キャッシュ
古林 万木夫 松下 裕昭 築山 良一 JP 4484014 特許公報(B2) 20100402 2003049132 20030226 ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質 ヒガシマル醤油株式会社 000112048 特許業務法人 もえぎ特許事務所 110000774 古林 万木夫 松下 裕昭 築山 良一 JP 2002062660 20020307 20100616 A61K 36/48 20060101AFI20100527BHJP A61K 36/75 20060101ALI20100527BHJP A61K 36/899 20060101ALI20100527BHJP A61K 8/97 20060101ALI20100527BHJP A61P 37/04 20060101ALI20100527BHJP A61P 37/08 20060101ALI20100527BHJP A61P 43/00 20060101ALI20100527BHJP JPA61K35/78 JA61K35/78 KA61K35/78 UA61K8/97A61P37/04A61P37/08A61P43/00 111 A61K 36/48 A61K 36/75 A61K 36/899 A61K 8/97 JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) 特開２０００−０７２６５２（ＪＰ，Ａ） 特開平０９−３０９８３９（ＪＰ，Ａ） 特開平０１−２８９４６２（ＪＰ，Ａ） 特開昭５８−２２４６４５（ＪＰ，Ａ） 18 2003327540 20031119 17 20050124 佐々木 秀次 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活活性物質、その製造法およびその用途に関する。より詳しくは、本発明は、皮膚の潤滑性、柔軟性を保ち、老化を防ぐヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を抑制して、皮膚の小ジワやかさつきを防ぎ、また免疫系におけるIgA生産能を賦活化する免疫賦活活性を有する物質、その製造法およびその用途に関する。【０００２】【従来の技術】ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を加水分解する酵素であり、動物組織に広く分布している。その基質となるヒアルロン酸は、皮膚・関節液などの組織に多く存在するムコ多糖の一種であり、例えば、皮膚においては、細胞の保護・栄養の運搬・組織水分の保持・柔軟性の維持等に、また、関節液として組織構造・機能の維持および潤滑性の保持等に重要な役割を果たしている。【０００３】皮膚や関節等における生体中のヒアルロン酸量は、老化または病的状態により減少し、皮膚の乾燥・肌荒れ・弾力性の低下、シワの増加、あるいは関節の湿潤性悪化による関節痛等を引き起こす。このような状態に対して、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸の分解を抑制し、生体ヒアルロン酸量の維持に寄与する。【０００４】また、ヒアルロニダーゼ阻害剤はヒアルロニダーゼに起因する抗炎症・抗アレルギー剤にも利用することができる。これは、ヒアルロニダーゼが炎症時に活性化され、結合組織のマトッリクスを破壊し、炎症系の組織への浸潤・血管の透過性を亢進すること、Ｉ型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミンの遊離の過程に介在している可能性が高いことによる。従って、抗炎症剤・抗アレルギー剤であるインドメタシン、アスピリン、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラスト等には高いヒアルロニダーゼ阻害活性が認められている。ヒアルロニダーゼ阻害剤は、近年患者数が増加しつつあり、社会問題化しているアトピー性皮膚炎、花粉症、気管支喘息、食物アレルギー等のアレルギー性疾患の予防や改善効果が期待されている。【０００５】また、ヒアルロニダーゼ阻害剤は、ヒアルロン酸を配合した化粧料の皮膚への塗布や関節へのヒアルロン酸の注入等の措置による外因性ヒアルロン酸の安定化にも利用することができる。【０００６】これまでに、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有するものとしては、茶ポリフェノール類（特許文献１）、果実ポリフェノール類（特許文献２）、水溶性プロポリス（特許文献３）、生薬又は飲食物として使用されているチンピ・キジツ・羅漢果の抽出物（特許文献４）、ブナ科の植物であるウラジロガシ抽出物（特許文献５）、カシューナッツ殻油（特許文献６）、ウルシ科植物抽出物（特許文献７）、海藻類（特許文献８）等が見出されているが、作用・効果が不十分な点や、活性を保ったまま製剤に安定に配合することが困難であるというような問題点が残されていた。【０００７】一方、生体が外界と接する境界には皮膚と粘膜があるが、粘膜面積の方がはるかに広く、その中でも腸管粘膜表面は最も広い面積を有する。腸管粘膜は多数のウィルス、細菌、寄生虫、病原性抗原や食物抗原と接触する場所であるため、それらの異物抗原から身体を守るための腸管免疫システムが存在する。この腸管免疫として機能するものとしてIgAが存在し、このIgAは、細菌やウィルスの中和、組織への細菌の付着の抑制、食物抗原によるアレルギー抑制等に重要な役割を果たしている。【０００８】免疫力が低い老人や幼児あるいは体力の低下した人は、ウィルスや病原菌などの外部からの異物に対する抵抗力が低い事が知られており、IgAを高く保つ作用を有する物質、あるいはIgAの生産力を高めることができる免疫賦活剤の開発が望まれている。【０００９】免疫賦活活性物質としては、発酵乳製品が古くから知られているが、嗜好的要素もあり利用範囲が限定されること、作用・効果が不十分な点や、製剤への配合に特殊な技術が必要なことなどの問題があった。最近においては、エンテロコッカス属の菌体または処理物を有効成分とするもの(特許文献９)、核酸組成物を有効成分として含む免疫賦活作用を有する飲食品（特許文献１０）、カカオ豆から得られる抽出物を有効成分とする免疫賦活剤（特許文献１１）等があるが、その実用性はまだ明らかでない。【００１０】【特許文献１】特開平６−９９３９１号公報【特許文献２】特開平８−２５９４５３号公報【特許文献３】特開平１１−２９０００５号公報【特許文献４】特開平６−８０５７６号公報【特許文献５】特開平６−２３９７５７号公報【特許文献６】特開平６−３２９５２６号公報【特許文献７】特開平７−１０７６５号公報【特許文献８】特開平９−６７２６６号公報【特許文献９】特開平１１−９２３８９号公報【特許文献１０】特開２００１−３１４１７２号公報【特許文献１１】特開２０００−８６５２６号公報【００１１】【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記事情に鑑みなされたものであって、経済的、安全性に優れたヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性ならびに免疫賦活活性を有する物質およびその製造法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、このような物質を用いたヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性、免疫賦活活性等の生理活性を有するアレルギー抑制、肌荒れ抑制、小じわ発生の抑制、関節痛の抑制あるいは免疫賦活作用を持つ、食品、化粧品及び医薬を提供することを目的とする。【００１２】【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性、免疫賦活活性を有する物質のスクリーニングを鋭意行った。その結果、大豆、ユズ、スダチ、ミカン等の柑橘類、およびこれらの加工副産物である脱脂加工大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐あるいは柑橘類の果皮、柑橘類の果汁を窄汁した残渣等の原料を糸状菌、納豆菌および／または糸状菌、納豆菌の酵素で処理することにより、ヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および免疫賦活活性が発現することを発見し、本発明をなすに至った。【００１３】本発明のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活活性を有する物質は、大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を原料とし、糸状菌（麹菌）または納豆菌を利用した発酵物全般から得ることができる。また、本発明の物質は、アルコール不溶性、水可溶性であり、分子量12,000以上である。【００１４】すなわち、本発明は、次のとおりのヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質に関する(1) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からなる、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。(2) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分子画分からなる、ヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。(3) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる高分子画分からなるヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質。【００１５】また、本発明は、次のとおりのヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫活性物質の製造法に関する。(4) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を採取することを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれかに記載のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性物質の製造方法。(5) 大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を糸状菌、納豆菌および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、水、食塩水または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬し、得られた液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得ることを特徴とする（1）〜（3）のいずれかに記載のヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および免疫賦活物質の製造方法。【００１６】さらに本発明は、前記物質の次のとおりの用途に関する。(6) (1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性および／または免疫賦活剤。(7）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性を有する健康・機能性飲料。(8）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性を有する化粧品。(9）(1）〜（3）のいずれかに記載される物質を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性を有する医薬品。【００１７】次に、本発明の前記生理活性を有する高分子物質を得る手段の一例を以下に示す。しかし、本発明はこのような方法に特に限定されるものではない。大豆、脱脂大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐等の大豆加工品、あるいは、ユズ、スダチ等の柑橘類、柑橘類の果皮、柑橘類から果汁を窄汁した残渣等の果実の加工品、あるいは小麦を含有する原料に、水を加えるかそのままで蒸煮あるいは焙煎する等の加熱処理を施し、これに、麹菌等の糸状菌や納豆菌を生育させることによって、本発明に関わる活性成分を発現させる。【００１８】これら微生物の生育を促進させるために、各種栄養源を補給することもできる。また、通常の醤油原料である大豆、小麦に大豆加工品や柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を添加して製麹することも可能である。このようにして培養物中に発現した活性成分はそのままでも利用が可能であり、水や食塩水あるいは30％（v/v）程度未満の低濃度エタノール等のアルコールで容易に抽出することができる。さらには、食塩水や30％（v/v）程度未満のエタノール中で長期間発酵させても得ることができる。【００１９】また、大豆、脱脂大豆、大豆皮、大豆粕、おから、豆腐等の大豆加工品、あるいはユズ、スダチ等の柑橘類、柑橘類の果皮、柑橘類から果汁を搾汁した残渣等の果実の加工品、あるいは小麦を含有する原料に、麹類や納豆菌の培養物から得られる粗酵素剤を作用させて生成させることも可能である。この場合、上記原料を蒸煮もしくは焙煎しておくことが望ましく、処理原料１重量部に対して水、食塩水、30％（v/v）程度未満のエタノールもしくはこれらの混合液を１から10重量部程度加え、腐敗せずに酵素による加水分解が進行する温度、好ましくは水を加えたときは５℃以下で１〜数日間、塩水あるいは30％（v/v）程度以下のエタノールを加えたときは30〜45℃程度で１日〜数週間程度処理する。【００２０】本発明においてヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性は、発酵分解物中に発現し、これをそのまま利用することも可能である。さらに利用しやすくするために、以下に示すような手段で、抽出し、あるいはその高分子画分を濃縮することによってこれらの活性をさらに高めることもできる。【００２１】本発明の生理活性物質を抽出するには、大豆、小麦、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品の発酵分解物に、１から10重量部程度の水、食塩水、あるいは30％（v/v）程度未満のエタノールを加えて攪拌をするかしないで1時間〜数日間放置し、ろ過し、そのろ液を使用する。本発明の生理活性を有する高分子物質を得るには、上記分解物の抽出ろ液に、エタノールを添加して生成する不溶性物質をろ過あるいは遠心分離で集める方法、あるいは、これらの液体を限外ろ過膜に通すことによって高分子物質を含有する画分である非透過液を集める方法、あるいはこの非透過液にエタノールを加えて不溶物を生成させ、それを回収する方法等が利用できる。【００２２】本発明に係る高分子物質を採取するために加えるエタノールの量は、高分子物質が不溶性となる濃度であればよく、最終エタノール濃度が30％（v/v）以上、望ましくは50％（v/v）以上になればよい。エタノールに代えてメタノールや2-プロパノール等によっても本発明の高分子物質は回収できるが、安全性の面でエタノールが好ましい。【００２３】本発明のアルコール沈殿により高分子画分を採取した残りの液は、新たな原料から高分子物質を回収するために利用することも可能である。また、例えばこの液は添加したエタノールとともにアミノ酸や低分子の糖質を含有するものであり、蒸留などの操作によってエタノールと分離する。エタノールは本発明において再利用でき、また、不揮発成分は調味料や食品として利用することもできる。あるいは、限外ろ過による透過液はそのままで調味料や食品として利用することが可能である。【００２４】得られたヒアルロニダーゼ阻害活性および／または免疫賦活活性を有する生理活性物質は、水などに溶解した形態、粉末化した形態、あるいはそのまま利用することが可能であり、製剤としてもよく、また飲食品、化粧品、医薬（医薬部外品も含む）などに適宜配合することができる。また、必要に応じて、透析、限外ろ過あるいはゲルろ過などの方法によってさらに活性（ヒアルロニダーゼ阻害活性、抗アレルギー活性および／または免疫賦活活性）または純度の高い物質を得ることも可能である。【００２５】本発明の生理活性物質を製剤化するときは温度に留意することが必要で、100℃程度の高温になると活性が低下する可能性がある。本発明の生理活性物質は、上記の方法により得られた抽出物をそのまま直接使用してもよいが、一般的には適当な液体担体に溶解するかもしくは分散させ、または、適当な粉末担体と混合するかもしくはこれに吸着させ、場合によっては、さらにこれらに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤等を添加し、乳剤、油剤、水和剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の製剤として使用する。【００２６】本発明における生理活性物質の使用量は生理活性物質の純度により大きく異なる。例えば大豆皮を原料として麹菌を３日間培養して10倍量の水で２時間抽出後得られたろ液に、２倍量のエタノールを加えて得られた沈殿物を透析した後凍結乾燥した本発明の生理活性物質の場合、成人1人あたり10〜1000mg程度が望ましく、これは飲食品あるいは化粧品として用いたときも免疫賦活剤として用いたときも、あるいはヒアルロニダーゼ阻害剤として用いたときも同様である。【００２７】製剤として使用する場合における生理活性物質の使用量は製剤の形態によっても異なるが、0.001重量%以上が好ましく、安全性に全く問題がないので特に上限は規定しない。【００２８】本発明のヒアルロニダーゼ阻害活性およびまたは免疫賦活活性を有する生理活性物質を飲食物に添加して、ヒアルロニダーゼ阻害作用または免疫賦活作用を有する飲食物を得るに当たって、その免疫賦活物質を飲食物に添加する方法としては、通常一般的に行われている方法でよいが、好ましくは、色素、香料等を添加するように最終工程で添加することが好ましい。【００２９】これらの飲食物としては、チューインガム，キャンディ，錠菓，グミゼリー，チョコレート，ビスケットまたはスナック等の菓子、アイスクリーム，シャーベットまたは氷菓等の冷菓、飲料、プリン、ジャム、乳製品、醤油味噌等の調味料等が挙げられ、これらの飲食物を日常的に接種することにより免疫力を強化する事が可能となる。【００３０】これらの飲食物に対する本発明の生理活性物質の添加量としては、飲食物の形態によっても異なるが、0.001重量%以上の添加が望ましく、嗜好性の面からは20重量%以下が望ましい。また、カプセルや錠剤型の健康食品、機能性食品の場合、その濃度に上限を設ける必要はない。【００３１】また、本発明の生理活性物質は、そのまま化粧品に添加して使用することもできるが、公知の賦形剤や希釈剤、あるいは他の任意の配合材料とともに混合して顆粒、エマルジョン、溶液、懸濁液などの剤形に調整して使用することができる。さらに、本発明の化粧品では本発明の生理活性物質以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、ビタミン類、保湿剤、増粘剤、界面活性剤、湿潤剤、香料、色素、防腐剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、アミノ酸類、各種動植物抽出物、胎盤抽出物などの化粧品添加物として公知のものを適宜任意に組み合わせて配合することもできる。【００３２】具体的な化粧品の例としては、ローション、乳液、クレンジングクリーム、マッサージクリーム、日焼け止めクリーム等のクリーム類、パック類等の基本化粧品、あるいはファンデーション、口紅、ほお紅、アイシャドー、おしろい等のメークアップ化粧品を挙げることができる。また石けん、洗顔クリーム、ボディローション、入浴剤等として調製することもできる。このような化粧品においては、その製造工程の任意の段階で、本発明の生理活性物質の粉末や液体など、目的に適した剤形のものを配合することができる。【００３３】本発明の生理活性物質の免疫賦活活性は、医薬として免疫力の低い老人や幼児あるいは体力の低下した人に、その免疫力を高めるために用いられる。また、主にヒアルロニダーゼ阻害活性は花粉症などのアレルギーを抑制するために用いられる。【００３４】これらは、本発明の生理活性物質を含有し、所望により、製剤学的に許容することのできる担体を含有することができる。投与形態としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤などの経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。【００３５】これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。【００３６】【発明の実施の形態】【実施例１】以下の方法により脱脂加工大豆と小麦、大豆皮と小麦、大豆皮を原料とする麹を作成した。3L容三角フラスコに脱脂大豆100gあるいは大豆皮100gを入れ、熱水120mlを加えた後30分間放置した。続いて、割砕小麦90gを加えよく撹拌後、121℃で45分間オートクレーブ処理を行った。また、大豆皮100gを割砕小麦を加えることなく、上記の処理を行った。放冷後、種麹（Aspergillus oryzae HL-15株）10gを植菌し、よく撹拌した。その後、30℃に保持したウォーターバスで48時間静置培養を行って麹とした。その間、撹拌のため2回の手入れ（20時間後および30時間後）を行った。【００３７】培養したそれぞれの麹の一部（90g）に純水150mlを加え、10,000rpmで15分間ホモジネートを行った。続いて、ホモジネート液を7,000rpmで30分間遠心分離を行い、上清を回収して各麹の水抽出液とした。【００３８】麹の水抽出液に2倍量のエタノールを添加し沈殿物を生成させた。続いて、7,000rpmで10分間遠心分離を行い、沈殿物を回収し凍結乾燥して試験品１とした。【００３９】また、同様に操作して得られた沈殿物を約100mlの純水に溶解し、分画分子量12,000以上の透析チューブ（和光純薬工業製、商品名Seamless cellulose tubing, small size 18, Wako、以下の実施例においても同様の透析チューブを使用した）に充填し、4℃の流水中で一夜透析した。その後、透析内液にその2倍量のエタノールを添加・混合し生成した沈殿物を、7,000rpmで10分間遠心分離して回収し凍結乾燥して試験品２とした。【００４０】試験品１および２を用いて次の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定した。その結果を表1に示した。【００４１】＜ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定方法＞乾燥粉末を水に溶解した後、0.1Ｍ酢酸緩衝液（pH 4）中に添加し、濃度の異なる水溶液を調製した。これらの水溶液0.2mlに、ヒアルロニダーゼ（シグマ社製の牛睾丸由来、タイプＩＶ-S）を400単位（0.1ml）添加して反応液とした。なお、これらの反応液中の乾燥粉末の終濃度は、0.01〜10 ｍｇ／ｍｌである。また、これらの乾燥粉末を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対照とした。【００４２】上記の反応液を37℃で20分間プレインキュベートした後、ヒアルロニダーゼの活性化物質であるCompound48/80（シグマ社製）、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムの混合液を、終濃度が0.1mg/ml、2.5mMおよび150mMとなるように加え、さらに37℃で20分間プレインキュベートした。この溶液に、基質であるヒアルロン酸カリウム（和光純薬製、ヒト臍帯由来）を、終濃度が0.4mg/mlとなるように加えて、37℃で40分間インキュベートして酵素反応を行った。【００４３】その後、基質が分解されることによって遊離したN-アセチルグルコサミンをモルガン・エルソンの改良法（Davidson, E. A., J. Biol. Chem., 242, 437, 1967）により発色させ、分光光度計（島津製作所製 UV-1200）を用いて585nmの吸光度を測定した。この測定結果から、本発明品の生理活性物質を含有する反応液におけるヒアルロニダーゼ活性阻害率（%）を、以下に示す計算式（１）に従って計算した。さらに、本発明品の生理活性物質の濃度とヒアルロニダーゼ活性阻害率との関係から、最小二乗法によって、ヒアルロニダーゼ活性を50%阻害する場合の濃度（IC50）（mg/ml）を求め、その結果を表1に示した。阻害活性(%)＝[（対照反応液の吸光度−試料反応液の吸光度）／対照反応液の吸光度]×100 …（１）ヒアルロニダーゼ阻害については、比較試験としてヒアルロニダーゼ阻害剤であるクロモグリク酸ナトリウム（DSCG）の結果を併記した。【００４４】＜免疫賦活活性の測定方法＞BALB/cマウス雄性７週齢（日本クレア）よりパイエル板組織を取り出し、20%FBS（ウシ胎児血清）を含むRPMI-1690培地（Gibco社製）に浸し、組織を押しつぶし、ナイロンメッシュを通して単細胞浮遊液とした。これを800rpmで5分間遠心分離して上清を除き、20%FBSを含むRPMI培地に1×107個/mlになるように懸濁した。【００４５】IgA誘導剤として、試験品１または２を200μg/ml添加した96穴平底プレートに、上記懸濁液を100μlずつ添加し、37℃、5%CO2の存在下で３日間培養し、培養液を3000rpmで遠心分離し、上清のIgAをELISA法により測定した。パイエル板細胞に何も添加せずに培養した対照群の値を１とした時の比活性を示した。【００４６】【表１】【００４７】【実施例２】脱脂加工大豆100gと小麦90g、大豆皮100gと小麦90g、大豆皮100g、ユズ皮100g、スダチ皮100gを原料として実施例１と同様の方法で麹をそれぞれ作成した。続いて、実施例１と同様に操作して得られた沈殿物及び透析物を凍結乾燥して試験品３とした。実施例１に記載の方法で、試験品３を用いてヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定した結果を表２に示す。【００４８】【表２】【００４９】【実施例３】（酵素処理による活性の発現）米と押麦を等量混合したものを原料として麹菌（Aspergillus oryzae）を接種して実施例１の方法と同様に培養し麹を作成した。得られた麹50gに200mlの0.1Mリン酸バッファー（pH 7.0）を加え、菌体破砕のために氷中でホモジナイズ(10,000rpm×15分）を行った後、遠心分離(7,000rpm×15分）により上清を得た。メンブレンフィルター(0.45μm）で上清をろ過し、麹菌酵素を含む酵素液とした。大豆皮、ユズ皮、スダチ皮（それぞれ4g）を100ml容三角フラスコに入れ、熱水8mlを加え30分放置した後、121℃で30分間オートクレーブした。放冷後、酵素液を20ml加え、30℃で18時間インキュベートした。インキュベート後の反応液を遠心分離(3,500rpm×10分）し、得られた上清に対して2倍容量のエタノールを加えて沈殿を生じさせた。続いて、遠心分離(7,000rpm×10分）により回収した沈殿物を凍結乾燥してヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。表３に示すとおり、麹菌の酵素で処理することにより活性が発現した。【表３】【００５０】【実施例４】アレルギー反応は４つの型に分類され、その中のＩ型アレルギー反応は組織中の肥満細胞や血液細胞中の好塩基球の細胞膜上にあるFCεリセププターにIgE抗体が結合し、その２分子の抗体が抗原で架橋されることにより脱顆粒現象が生じて、酵素やヒスタミン、セロトニンの化学伝達物質が細胞外へ遊離する。これらの物質により気管支喘息、アレルギー性鼻炎等のアレルギー疾患が発症すると考えられている。そこで、Ｉ型アレルギー反応に関与する正常好塩基球や肥満細胞と同様な機能を有するラット好塩基球白血球細胞（RBL-2H3）を用いて、片岡および高垣の文献（片岡正博、高垣裕：生薬学雑誌、46(1)、25-29、1992）に従い本発明の試験品２の脱脂加工大豆と小麦の麹の透析物について抗アレルギー活性を評価した。【００５１】ラット好塩基球白血病細胞（RBL-2H3）は、Wistar系ラットにβ-chloroethylamide を投与して作成された Rat basophilic leukemia 細胞（RBL 細胞）群中クローニングより得られた細胞である。RBL-2H3 細胞はRPMI-1640培地（Sigma製）に3％ Fetal calf serum (HyClone 製)および0.2％ Bovine serum albumin Fraction V（生化学工業製）を含む培養液中37℃、５％CO2で培養した。【００５２】RBL-2H3 細胞液（5×105 cells/ml）を24 Well（Costar 製）に0.4ml分注し、マウス抗DNPIgE抗体を0.5μg/ml加えて、37℃、5％CO2インキュベーターで12時間培養し感作を行った。培養後 Well中の培養液を吸引除去しリン酸バッファーで2回洗浄後、Releasing medium を260μl加えた。Releasing mediumに溶解した試験品2を添加し、10分間インキュベート後、抗原として20μlのDNP-BSA（4.0μg/ml）を加え更に30分間インキュベートした。上清中に遊離されたヒスタミン量を ELISA キット（SPI bio 社）を用いて測定し、ヒスタミンの遊離抑制を抗アレルギー活性の指標とした。比較試験としてフマル酸ケトチフェンの結果を併記した。表４に示したとおり試験品２を添加した区は無添加にくらべてヒスタミン遊離を抑制し、抗アレルギー活性が認められた。【００５３】【表４】【００５４】【実施例５】脱脂加工大豆と小麦を主原料とした生揚げ醤油100mlにエタノール50,100,200mlをそれぞれ添加混合し、生成した不溶物を遠心分離によって採取した。次いで、それぞれの沈殿物を100mlの純水に溶解し、再度エタノール50,100,200mlをそれぞれ添加混合し、生成した不溶物を遠心分離によって集め凍結乾燥して乾燥物を得た。得られた乾燥物を試験品４として用いた。また、同様に操作して得られた沈殿物を約20mlの水に溶解し、分画分子量12000以上の透析チューブに詰め、4℃の流水で一夜透析した。その後、透析内液にその2倍量のエタノールを添加・混合し生成した沈殿物を遠心分離によって集め、凍結乾燥によって乾燥した。得られた乾燥物を試験品５とした。試験品４および５を用いて実施例１と同様の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性および、免疫賦活活性を測定した。結果を表５に示した。【００５５】【表５】【００５６】【実施例６】丸大豆と小麦を主原料とした生揚げ醤油500mlにエタノール1000mlを添加し十分混合後一夜静置し、上清をデカンテーションで除き、さらに66%のエタノール1500mlで十分洗浄した。生成した沈殿物をデカンテーションおよび遠心分離して集め、室温で2時間程度エタノールを飛散させた後凍結乾燥すると凍結乾燥物25 gが得られた(以下、沈殿物という)。この乾燥物20gを約100mlの水に溶解し、透析チューブに詰めて一夜流水中で透析した。透析内液にその2倍量のエタノールを加えて混合後遠心分離し、得られた沈殿物を凍結乾燥すると凍結乾燥物2.6 gが得られた（以下、透析残存物という）。それぞれについて実施例1と同様の方法で、ヒアルロニダーゼ阻害活性および免疫賦活活性を測定し、その結果を表６に示した。免疫賦活活性についてはIgA誘導剤としての試料添加量を200μg/mlおよび2mg/mlで行い、また、ヒアルロニダーゼ阻害については、比較試験としてヒアルロニダーゼ阻害剤であるクロモグリク酸ナトリウム（DSCG）の結果を併記した。【００５７】【表６】【００５８】【実施例７】醤油麹1kgに水2.2Lおよび防腐のためにエタノール500mlを加え30℃で1および4週間放置し、麹菌酵素による分解を行った。これらの期間中麹菌、乳酸菌、酵母等の増殖は認められなかった。これを圧搾してろ液を得、さらに清澄ろ過して得られたろ液500mlに、エタノールを1L添加して混合後しばらく静置し、生成した沈殿物をデカンテーションおよび遠心分離して集めた。さらに、その一部を実施例６と同様に透析、エタノールによる沈殿、および凍結乾燥して透析残存物を得た。これらについて実施例１と同様の方法でヒアルロニダーゼ阻害活性ならびに免疫賦活活性を測定した。その結果を表７に示した。【００５９】【表７】【００６０】【実施例８】生揚げ醤油6Lを限外ろ過膜（分画分子量5,000）に通し、透過液4.8Lと非透過液1.2 Lに分別した。また、生揚げ醤油、透過液（低分子）、非透過液(高分子)のそれぞれの一部をとり、95℃、5分加熱後55℃、2日保持し、発生する火入れおりをセライトろ過で除いて火入れろ過醤油を得た。これらの150mlにエタノールを300ml添加混合後しばらく静置したところ、透過液およびその火入れろ過液から沈殿の発生は認められなかった。【００６１】沈殿が生成したものについて、デカンテーションおよび遠心分離によって沈殿物を集めた。得られた沈殿物はそれぞれ150mlの水で溶解しエタノール300mlを添加して沈殿を発生させ同様の方法で回収した。沈殿物の1/2量は凍結乾燥し、残りの1/2量は少量の水に溶解して透析チューブに詰め、 1夜冷流水にて透析後、透析内液にその2倍量のエタノールを添加して生成した沈殿物を遠心分離で採取し凍結乾燥した。それぞれについてヒアルロニダーゼ阻害活性を測定し、表８にその結果を示した。【００６２】表８によると、加熱したほうがヒアルロニダーゼ阻害活性は低く、生揚げ醤油から回収するほうが有利と思われる。また、限外ろ過によって高分子画分を濃縮してから、エタノール沈殿させると効率よく回収できることが示唆された。【００６３】【表８】【００６４】【実施例９】大豆または小麦を蒸煮し、これに糸状菌、もしくは納豆菌を接種し、30℃で3日間培養後、培養物100gに水500mlを加えて4℃で20時間攪拌し、布ろ過および遠心分離によって澄明な抽出液を得た。得られた抽出液にその2倍量のエタノールを添加し、生じた沈殿物を遠心分離で採取した。さらにこの沈殿物を10mlの純水に溶解し、透析チューブに詰めて流水中で15時間透析した。透析内液に2倍量のエタノールを加えて発生した不溶物を遠心分離によって集め、凍結乾燥した。この凍結乾燥物を反応最終濃度が1mg/mlになるように調製してヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した。結果は表９にしめした。表９から明らかなように、大豆、小麦の原料そのものからはヒアルロニダーゼ阻害活性は得られず、麹菌あるいは納豆菌を生育することによって強い活性物質が得られた【００６５】【表９】＊ヒアルロニダーゼ活性強度は表３と同様に表した。【００６６】【実施例１０】大豆および小麦を原料とした市販の発酵食品のヒアルロニダーゼ阻害活性について検討した。試料が液体の場合は、100gにエタノールを200ml添加して混合した。固形物試料の場合は、その200gに純水400gを加えて10,000rpmで10分間ホモジナイズし、遠心分離により上清300gを採取し、エタノール600mlを加えて混合した。それぞれ、発生した沈殿物を遠心分離により回収し、適量の純水に溶解して透析チューブに詰め、流水で一夜透析後、透析内液を凍結乾燥し乾燥粉末を得て阻害活性測定用の試料とした。結果は表10に示したように、各種発酵物からヒアルロニダーゼ阻害活性物質が得られた。【００６７】【表１０】＊ヒアルロニダーゼ活性強度は表３と同様に表した。【００６８】【実施例１１】大豆と小麦を原料として作成した醤油麹、または大豆を原料として作成した納豆10gに水50mlを加えてホモジナイズした後ろ過し、得られたろ液を凍結乾燥して、乾燥物それぞれ0.15gと0.13gを得た。これを純水に10mg/mlになるよう溶解し、0.2μmのフィルターによってろ過して試料液とした。この試料液を用いて実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ阻害活性および免疫賦活活性を測定した。その結果を表11に示した。【００６９】【表１１】【００７０】【実施例１２】（機能性食品）実施例1と同様の方法によって得られた大豆皮麹1kgに15%のエタノールを3L添加して一夜冷蔵保管し、その後ろ過して抽出液2Lを得た。これに4Lのエタノールを加えて撹拌後1週間静置した。生成した沈殿物をデカンテーションによって集め、これを40℃で減圧乾燥後、凍結乾燥によって乾燥粉末30gを得た。(1) 上記の凍結乾燥粉末10%、馬鈴薯澱粉20%、乳糖70%を混合し、粉末食品を得た。(2) 上記の凍結乾燥粉末1%、オレンジ果汁5%、異性化糖15%、クエン酸0.1%、香料0.1%、水78.8%を混合してオレンジ果汁飲料を得た。これらの粉末食品及び飲料は抗アレルギー及び免疫力向上のために食用に供される。【００７１】【実施例１３】（化粧品）実施例12と同様にして得られた乾燥粉末10gを100mlの純水に溶解し、透析チューブに充填し一夜流水中で透析した。その透析内液を凍結乾燥すると淡褐色の精製粉末が得られた。下記の処方例に従って混合してローションを得た。（処方例）ポリオキシエチレン（20E. O.）ソルビタンモノステアレート2.0（重量%、以下同じ）、ポリオキシエチレン（60E. O.）硬化ヒマシ油2.0、オリーブ油0.5、エタノール10.0、上記の精製粉末の20%水溶液10.0、精製水75.5（合計100）【００７２】【実施例１４】（医薬品）実施例13の乾燥粉末50%、デキストリン50%を混合し、0.1gをゼラチンカプセルに充填する。これを、花粉症の予防薬として1日3回1カプセルずつ服用する。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からなる、ヒアルロニダーゼ阻害剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分子画分からなる、ヒアルロニダーゼ阻害剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる高分子画分からなるヒアルロニダーゼ阻害剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を採取することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、水、食塩水または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬し、得られた液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のヒアルロニダーゼ阻害剤の製造方法。 請求項１〜３のいずれかに記載されるヒアルロニダーゼ阻害剤を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害用医薬品。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からなる、アレルギー疾患治療用のヒスタミン遊離抑制剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分子画分からなる、アレルギー疾患治療用のヒスタミン遊離抑制剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる高分子画分からなるアレルギー疾患治療用のヒスタミン遊離抑制剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を採取することを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のアレルギー疾患治療用のヒスタミン遊離抑制剤の製造方法。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、水、食塩水または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬し、得られた液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得ることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載のアレルギー疾患治療用のヒスタミン遊離抑制剤の製造方法。 請求項７〜９のいずれかに記載されるアレルギー疾患治療用のヒスタミン遊離抑制剤を有効成分とするヒスタミン遊離抑制用医薬品。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物からなる、免疫賦活活性剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物の高分子画分からなる、免疫賦活活性剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる高分子画分からなる免疫賦活活性剤。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を水、食塩水または低濃度のアルコールで抽出もしくは浸漬して得られる液体にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物を採取することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の免疫賦活活性剤の製造方法。 大豆、小麦、これらの加工品、あるいはゆず及びスダチの果皮を含有する原料を糸状菌、納豆菌、および／または糸状菌、納豆菌の酵素により処理した発酵物を、水、食塩水または低濃度アルコールで抽出もしくは浸漬し、得られた液体を限外ろ過により濃縮し、濃縮物を得ることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の免疫賦活活性剤の製造方法。 請求項１３〜１５のいずれかに記載される免疫賦活活性剤を有効成分とする免疫賦活用医薬品。