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| タイトル： | 特許公報(B2)_Ｃ型肝炎罹患検査方法 |
| 出願番号： | 2002340726 |
| 年次： | 2007 |
| IPC分類： | G01N 33/576,G01N 33/543 |
特許情報キャッシュ
長井 辰男 岡崎 登志夫 JP 3895262 特許公報(B2) 20061222 2002340726 20021125 Ｃ型肝炎罹患検査方法 独立行政法人科学技術振興機構 503360115 下田 昭 100110249 長井 辰男 岡崎 登志夫 20070322 G01N 33/576 20060101AFI20070301BHJP G01N 33/543 20060101ALI20070301BHJP JPG01N33/576 ZG01N33/543 545B G01N 33/576 G01N 33/543 特表平０７−５０４４９２（ＪＰ，Ａ） 特表２００４−５２９０８０（ＪＰ，Ａ） 特開平０４−３２６０６２（ＪＰ，Ａ） 4 2004177158 20040624 9 20050113 竹中 靖典 【０００１】【発明の属する技術分野】この発明は、Ｃ型肝炎罹患検査の方法に関する。【０００２】【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染すると、慢性化しやすく、肝硬変を引き起こす確率が高い等の問題がある。このため、Ｃ型肝炎ウイルス感染が疑われている患者について、血液中にＣ型肝炎ウイルスが存在しているか否かを、短時間のうちに確認することができる検査技術は重要である。更に、Ｃ型肝炎ウイルスは、ＨＣＶ感染患者の体内にて遊離状態及び／又は免疫複合体の状態で存在しているが、そのＣ型肝炎ウイルスが如何なる状態（すなわち、遊離状態あるいは免疫複合体の状態）で存在しているかについて知る適当な方法がなく、このような検査方法の完成が望まれていた。【０００３】一方、クリオグロブリンは、低温で血清から沈澱する熱タンパク質であり、多くの骨髄腫や、リンパ増殖性疾患、自己免疫疾患及び感染性疾患などの広範な疾患において検出されている（例えば、非特許文献１参照。）。クリオグロブリン血症とＣ型肝炎との間の関係に関して報告がなされており（例えば、非特許文献２、３参照。）、クリオグロブリン中のＨＣＶ−ＲＮＡの存在が確認されている（例えば、非特許文献４参照。）。しかし従来法によるクリオグロブリンの確認には大量のＨＣＶ感染血清が必要であり、極めて少量のクリオグロブリンの沈澱を検出することは困難であった。【０００４】発明者らは既にクリオグロブリンを検出する簡易な方法を開発して報告した（例えば、非特許文献５参照。）。この方法は冷却したアガロースゲルプレートを利用したゲル拡散法であり、１０μｌ程度の少量のサンプルで行うことができる。この方法で得られるクリオグロブリンの沈澱リングは極めて明確であり、特にＣ型肝炎におけるクリオグロブリンの分析に有効である。更に、本発明者らは、この遊離ウイルス相分離検知技術をＣ型肝炎ウイルスの検査技術として用いる方法を開発した（特願2001-230946）。【０００５】【非特許文献１】厚生省新興・再興感染症研究事業「非Ａ非Ｂ型肝炎の予防、疫学に関する研究、非Ａ非Ｂ型肝炎の臨床的総合研究」平成１１年度研究報告書、飯野四郎「Ｃ型慢性肝疾患におけるクリオグロブリン血症の検討」【非特許文献２】Casato M, et. al., Lancet 1991; 337; 1047-8【非特許文献３】Disdier P, et. al., Lancet 1991; 338: 1151-2【非特許文献４】Agnello V, et. al., N Engl J Med 1992; 327: 1490-5【非特許文献５】Okazaki T, et. al., C1inica1 Chemistry 1998; 44: 1558-1559【０００６】【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡単な装置と煩雑でない操作にて、血清中のＣ型肝炎ウイルスの検査方法を提供することを目的とし、更に、Ｃ型肝炎ウイルスの感染者に特有の免疫複合体を特定し、これを見積もることのできる手段、即ちＣ型肝炎患者を見分ける効果的な方法を提供するものである。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研究を進めた結果、Ｃ型肝炎患者のＩｇＭが健常者のＩｇＭとは異なる変性ＩｇＭであること、ＩｇＭがＧａｌβ１−３ＧＰと結合し複合体を形成すること、この複合体は特定のレクチンと結合すること、及びこの変性ＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとの複合体が低温下で凝集し、これが即ちクリオグロブリンであることなどの知見を得た。本発明者らは、このような知見から、Ｃ型肝炎ウイルスの感染者に特有の異常ＩｇＭから成る免疫複合体を見積もる方法、及びＣ型肝炎患者を見分ける方法を完成させた。なお、Ｇａｌβ１−３ＧＰとは、被検者血清試料中に存在するＧａｌβ１−３ＧａｌＮａｃの構造を糖鎖末端に持つ糖蛋白質のことである。即ち、本発明は、Ｇａｌβ１−３ＧＰと親和性のレクチンを固定化した担体に被検者の血清検体を３７℃未満の凍結しない寒冷状態で接触させる段階（第１段階）、３７℃未満の凍結しない寒冷状態において、前段階で得た担体を冷洗浄した後、この担体にヒトＩｇＭに対する酵素標識第二抗体を接触させる段階（第２段階）、及び前段階で得た担体を冷洗浄した後この担体に結合している標識を検知する段階（第３段階）から成るＣ型肝炎罹患検査方法である。【０００８】【発明の実施の形態】上記のように発明者らは、Ｃ型肝炎患者のＩｇＭが健常者のＩｇＭより分子量が正常のものより数千大きい変性ＩｇＭであることを見出した。その結果は後述の参考例１に示す。ＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとは複合体を形成するが、健常者のＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとの複合体は低温下でも凝集しないと考えられる。しかし、Ｃ型肝炎患者の変性ＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとの複合体は低温下で凝集し、これがクリオグロブリンであると考えられる。この凝集状態を寒天ゲル上で観察したことは既に報告した（非特許文献５）。【０００９】一方、本発明者らは、ＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとから成る複合体が特定のレクチンと特異的に結合することを見出した。その結果は後述の参考例２に示す。レクチンは、動植物から抽出される糖鎖構造を持つ蛋白であり、凝集・沈降反応その他特異抗体反応に類似した現象をひき起こす。Ｇａｌβ１−３ＧＰと親和性のレクチンとしては、例えば、実施例で実証したヤシの実のレクチンであるJacalinが好ましい。Ｇａｌβ１−３ＧＰとの親和性は、例えば、後述の参考例２に記載の方法により知ることができる。【００１０】レクチン（Jacalin）はＣ型肝炎患者の変性したＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとの複合体も健常者の正常ＩｇＭ・Ｇａｌβ１−３ＧＰ複合体も区別無く固相に結合する。しかるに、Ｃ型肝炎患者の変性ＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとの複合体であるクリオグロブリンは低温で凝集するため、本発明の方法のように、系内にレクチン（Jacalin）を置いても結合できなくなってしまうものと考えられる。従って、本発明の方法により、レクチン（Jacalin）と結合することのできない変性ＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰから成る複合体の量を見積もることが可能になる。【００１１】本発明のＣ型肝炎ウイルスの検査方法の第１段階と第２段階は、３７℃未満の凍結しない寒冷状態で行うが、好ましくは１〜１０℃、より好ましくは４℃付近であり、各段階で同じ温度である必要はない。冷洗浄は、３７℃未満、好ましくは１〜１０℃で、通常は９０ｍＭ リン酸緩衝液等を用いて洗浄を行う。また、第３段階は低温である必要はなく通常は３７℃で行う。酵素標識第二抗体は、ヒトＩｇＭに対する抗体であれば特に制限はないが、ＨＲＰ標識ヒトＩｇＭウサギ抗体等が一般に用いられる。【００１２】【実施例】以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。参考例１ゲル上の沈澱物リングに含まれるクリオグロブリンの分析をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて行った。まず、低温で、クリオ沈澱物リングを切り出して、アガロースゲルに含まれるクリグロブリンを３７℃でグリシンを含むDulbeccoリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解する。この溶解液をTris-SDS-βME seprazol（第一化学社製）で処理し、0.025 M Tris-0.195 M グリシン緩衝液（ｐＨ８．６）を用いて４０ｍＡの一定電流で５〜１５％ポリアクリルアミド勾配ゲル電気泳動を６０分間行った。電気泳動後、分画された免疫グロブリンをImmobilon PVDF 移転膜（第一化学社製）に１時間移転させ、この膜をスキムミルク（Block Ace、大日本製薬社製）でブロックした。これを抗μ鎖抗体（Dako A/S, Glostrup社製）と反応させ、次にＰＯＤ標識ウサギ抗体（Dako A/S, Glostrup社製）で着色した。その結果を図１に示す。レーン１は健常者のもので、レーン２〜６はＨＣＶ患者のものである。ＨＣＶ患者のもののうちクリオグロブリンの沈澱が多いものについては、健常者のものより数キロダルトン大きい異常ｍｕ画分が確認された。即ち、この結果から、Ｃ型肝炎患者で異常なＩｇＭが作られていることが確認された。これは、ＨＣＶがリンパ球に入り免疫機構に対して悪さをしている証拠ではないかと考えられる。【００１３】参考例２７５０ｍＬの水に、組成物Ａと組成物Ｂとを加え、充分に彊搾した後、沸騰湯浴中で溶解させた。（１）組成物Ａ：ＮａＣｌ ８００ｍｇＫＣｌ ２００ｍｇリン酸一水素ナトリウム １１５０ｍｇリン酸二水素ナトリウム ２００ｍｇ（２）組成物Ｂ：アジ化ナトリウム ０．７５ｇグリシン ５６．２５ｇアガロース ４．５０ｇ溶解に際しては、５分毎にスターラーで撹拝し、均一なアガロース溶液とになるようにした。【００１４】アガロース溶液を溶解後直ちに直径３０ｍｍのプレートに注ぎ、室温で凝固させてアガロースゲルプレートを得る。このアガロースゲルプレートに直径５ｍｍの凹み（ウェル）を７個程度形成し、これを冷蔵保存した。Ｃ型肝炎ウイルスの感染者と健常者から所定の手段で採取した血清試料２０μＬを３７℃に維持し、これを室温にて、アガロースゲルプレートの凹みへ注入した。その後２０分間静置して、血清試料をゲルプレート内に染み込ませた。【００１５】このゲルプレートを４℃附近に置き、１２時間以上の時間をかけてインキュベートした。その結果を図２のNo.３（Ｃ型肝炎ウイルスの感染者）とNo.４（健常者）に示す。No.３でのみ、凹みの周辺に白い沈澱物リングが観察された。即ち、既報（非特許文献５）と同様に、変性ＩｇＭとGalβ1-3GPとの複合体が凹みの周辺に凝集沈澱したと考えられる。【００１６】一方、上記血清試料にJacalin Pure（ＥＹ社製）を血清試料１０μｌあたり１μｇとなるように加え、約２時間静置した後、参考例２のプレートの凹みに注入して、上記と同様の操作を行った。その結果をその結果を図２のNo.2（Ｃ型肝炎ウイルスの感染者）とNo.1（健常者）に示す。いずれにも凹みの周辺にも白い沈澱物リングは観察されなかった。これらの結果を表１にまとめる。表中、凹みの周辺に白い沈澱物が観察されたものを＋、観察されなかったものを−とした。【００１７】【表１】Jacalin処理のものを無処理のものと比べると、ＨＣＶ患者の凹みの周辺の白い沈澱物がJacalin処理により観察されなくなった。この結果から、ＨＣＶ患者のクリオグロブリン沈澱物には変性ＩｇＭとGalβ1-3GPとの複合体が含まれるもの考えられる。しかし、Jacalinが複合体を形成するGalβ1-3GPと特異的に結合し、凹みの周辺に移動することが出来なくなり、凹みの周辺の白い沈澱物がJacalin処理により観察されなくなったと考えられる。【００１８】実施例１この実施例では、ＨＣＶ患者のクリオグロブリン沈澱物に含まれる変性ＩｇＭとGalβ1-3GPとの複合体を測定することを目的とする。Galβ1-3GPと親和性が確認されたJacalinをコーティングした酵素結合免疫収着検定法（以下「ＥＬＩＳＡ」という。）反応用プレートを以下の手順で作製した。１．プレート（ｃｏｓｔａｒ社製６穴丸底 高吸差能タイプ）各穴にコーティングバッファーで稀釈したJacalin Pure（ＥＹ社製）溶液（１μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ添加し２〜８℃で一晩放置する。２．上記プレートを洗浄液（９０ｍＭ リン酸緩衝液（ＮａＣｌ，８．０ｇ；Ｎａ２ＨＰＯ４，１．１５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４，０．２ｇ；ＫＣｌ，０．２ｇ；Ｔｗｅｅｎ２０，０．５ｇ；ＤＷ，１Ｌ）、以下洗浄液は同様のものを使用した。）で３回洗浄し、イオン交換水で５倍に稀釈したブロッキング剤（日本油脂製Ｎ１０２ブロッキング剤）を各プレート穴へ１５０μＬ添加し、室温で２時間放置する。３．上記プレートを洗浄液で３回洗浄し、水分を完全に除去する為２，５００ｒｐｍ、１０分間遠心する。プレートシーラーを貼り付けて冷蔵庫で４８時間以上静置して使用する。【００１９】次に、健常者１０名（表２のＮｏ．１〜１０）から血清を採取し、このプレートを用いて下記の手順でＥＬＩＳＡによる検定を行った。１．反応プレートを室温に戻し、洗浄液で３回洗浄後タッピングして水分を除去する。２．上記プレートに３７℃で保存した血清検体５０μｌを注入後４℃で２時間静置する。３．冷洗浄液で３回洗浄後、抗体稀釈液（０．８５％ＮａＣｌ）で５，０００倍に稀釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭウサギ抗体（ダコ社）１００μＬを各プレート穴へ添加し、ミキサーにかけ、４℃で１時間反応させる。４．冷洗浄液で３回洗浄後、ＴＭＢＺ発色試薬（クエン酸１水和物，１２．８０ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４，１０．９０ｇ／Ｌ；Ｈ２Ｏ２，０．１５ｍｌ／Ｌ；１０ｍｇ／ｍｌＴＭＢＺ，１０ｍｌ／Ｌ）１００μＬを各プレート穴へ添加し、室温で３０分間反応させる。５．反応停止用リン酸溶液（リン酸，３４ｍＬ；ＤＷ，５００ｍＬ）１００μＬを各プレート穴に加え、反応を終了する。６．プレートリーダーにかけて、４５０ｎｍで測光し吸光度（Ａｂｓ）を求める。【００２０】実施例２ＨＣＶ患者１５名（表２のＮｏ．１１〜２５）から採取した血清を用いて、実施例１と同様の試験を行った。実施例１（Ｎｏ．１〜１０）と実施例２（Ｎｏ．１１〜２５）の結果を表２に示す。なお、同時に同血清検体をＨＣＶ・ＥＩＡ ２ｎｄ「アボット」キットで検査し、サンプルをＨＣＶ関連抗原と反応させた後の吸光度をカットオフ値の吸光度で割った値（Ｃ−ＩＤＸ）を表２に示す。このキットはＨＣＶコア抗原とＨＣＶ関連抗原を含み、サンプル中のＨＣＶ関連抗体の有無を検査する。【００２１】【表２】この表２から、ＨＣＶ患者の吸光度（Ｎｏ．１１〜２５）は健常者のもの（Ｎｏ．１〜１０）に比べて有意に低いことがわかる。【００２２】JacalinはＣ型肝炎患者の変性したＩｇＭとＧａｌβ１−３ＧＰとの複合体も健常者の正常ＩｇＭ・Ｇａｌβ１−３ＧＰ複合体も区別無く固相に結合する。図３に示すように、健常者の正常ＩｇＭ・Ｇａｌβ１−３ＧＰ複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知することができる。しかし、Ｃ型肝炎患者のＩｇＭは参考例１で明らかなように健常者のＩｇＭよりも分子量が数千大きく、健常者のものとは異なる変性ＩｇＭである。このような変性ＩｇＭからなる複合体は冷却すると凝集し、Jacalinと結合することができなくなってしまうものと考えられる。その結果、図４に示すように、ＥＬＩＳＡによる検定による数値が低くなるものと考えられる。即ち、この値は、ＨＣＶ感染（たぶんリンパ球への感染）に伴う変性ＩｇＭ産生を示すものであると考えられる。即ち、本発明の方法は、Ｃ型肝炎患者の変性ＩｇＭを見積もる手段を与えるものである。【図面の簡単な説明】【図１】健常者とＣ型肝炎の患者から得た６つのクリオ沈澱物のＰＡＧＥパターンを示す図である。レーン１は健常者のもの、レーン２〜６はＨＣＶ患者のものを示す。矢印はｍｕ鎖バンドを示す。ｍｕ−０は通常のもの、ｍｕ−１とｍｕ−２は異常のものを示す。【図２】冷アガロースゲル上のＣ型肝炎の患者と健常者のクリオ沈澱物リングを示す図である。No.１とNo.４は健常者のもの、No.２とNo.３はＨＣＶ患者のもの、No.１とNo.２はJacalinで処理したもの、No.３とNo.４は無処理のものを示す。No.３の凹みの周辺にのみ白い沈澱物が観察された。【図３】ＥＬＩＳＡ法により、健常者の正常ＩｇＭ・Ｇａｌβ１−３ＧＰ複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知する方法(実施例１)の概略を示す図である。【図４】ＥＬＩＳＡ法により、Ｃ型肝炎患者の変性ＩｇＭ・Ｇａｌβ１−３ＧＰ複合体を担体に固定化したJacalinと結合させて検知する方法(実施例２)の概略を示す図である。 Ｇａｌβ１−３ＧＰと親和性のレクチンを固定化した担体に被検者の血清検体を３７℃未満の凍結しない寒冷状態で接触させる段階、３７℃未満の凍結しない寒冷状態において、前段階で得た担体を冷洗浄した後、この担体にヒトＩｇＭに対する酵素標識第二抗体を接触させる段階、及び前段階で得た担体を冷洗浄した後この担体に結合している標識を検知する段階から成るＣ型肝炎罹患検査方法。 前記レクチンがJacalinである請求項１に記載の方法。 前記寒冷状態が１〜１０℃である請求項１又は２に記載の方法。 前記酵素標識第二抗体がＨＲＰ標識ヒトＩｇＭウサギ抗体であり、４５０ｎｍの吸光度で標識を感知する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。