生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_ガラクトオリゴ糖の製造法 |
| 出願番号： | 2002077762 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12P 19/14 |
特許情報キャッシュ
藤井 武 藤井 紀人 JP 4095816 特許公報(B2) 20080314 2002077762 20020320 ガラクトオリゴ糖の製造法 日本オリゴ株式会社 591014581 大石 征郎 100087882 藤井 武 藤井 紀人 20080604 C12P 19/14 20060101AFI20080515BHJP JPC12P19/14 Z C12P 19/00-19/64 C12N 1/00-1/38 BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) CAplus(STN) JST7580(JDream2) JSTPlus(JDream2) 特開昭５５−１０４８８５（ＪＰ，Ａ） 特開平０９−１１７２９７（ＪＰ，Ａ） 1 FERM P-18651 2003274991 20030930 14 20050304 渡邉 潤也 【０００１】【発明の属する技術分野】 本発明は、新規に発見した菌類に由来する酵素を作用させることにより、高い転移率でガラクトオリゴ糖を製造する方法に関するものである。【０００２】【従来の技術】 ガラクトオリゴ糖は、ガラクトース残基をGal 、グルコース残基をGlc と表わすとき、Gal-(Gal)n-Glc（ｎは０〜３）で示される。結合様式には、β1-6 、β1-3 、β1-4 、β1-2 や、α1-3 、α1-6 などがある。【０００３】 ガラクトオリゴ糖は、(a) 腸内でビフィズス菌の増殖促進因子として機能し、整腸作用が期待できることのほか、(b) それ自体は味がないこと、(c) フラクトオリゴ糖と異なり、その水溶液を酸性条件下に保存しても変質を起こしにくいこと、などの利点がある。そのため、ガラクトオリゴ糖は、食品素材、動物飼料配合用、飼育動物用人工乳材料などとして有用である。【０００４】 ガラクトオリゴ糖の製造法に関しては、以下に例示するように多くの出願がなされているので、従来は主としてどのようなガラクトシダーゼ産生菌が使われているかの観点からまとめてみる。【０００５】（イ）特開平９−２３８６９６号公報には、原料乳糖（ラクトース）にβ−ガラクトシダーゼを作用させてガラクトース転移反応を行わせる反応工程を備えた３’−ガラクトオリゴ糖リッチの糖組成物の製造方法において、予め定められた時点（たとえば乳糖が初期濃度の６０〜４０％になった時点）で反応を停止する反応停止工程を含む方法が示されている。３’−ガラクトオリゴ糖は、Gal-Gal 結合がβ（１→３）結合方式のガラクトオリゴ糖である。【０００６】 この公報の出願の実施例で主として得ている３糖は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来のβ−ガラクトシダーゼを用いた場合で、 Gal β1-3 Gal β1-4 Glc 、 Gal β1-6 Gal β1-4 Glcであり、その実施例１における５０℃で８時間反応後の生成３糖の収率は、 6.2％（基質初期濃度５％）、16.1％（基質初期濃度２０％）、20.6％（基質初期濃度２０％）である。【０００７】 この公報には、β−ガラクトシダーゼ産生菌として、アスペルギルス・オリゼ、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・ラクチス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ライヒマニー、ラクトバチルス・ヘルペティクス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、クルイベロマイセス・フラジリス、クルイベロマイセス・ラクチス、カンジダ・シュードトロピカリス、大腸菌などが例示されており、これらの中では、ラクトバチルス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ビフィドバクテリウム属、クルイベロマイセス・ラクチス等が好適であるとあり、殊に、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガクトシダーゼを用いることが好ましいとある。【０００８】（ロ）特開２０００−４１６９３には、乳糖または乳糖含有物にサーマス(Thermus) 属に属する微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼを作用させるガラクトオリゴ糖の製造方法が示されている。試験例１（７０℃で糖転移反応を行っている実施例１の条件を採用している）によれば、乳糖濃度が５，２０，２５，３０，４０，４５，５０％のときのガラクトオリゴ糖の収率は、この順に、22.5, 29.5, 35.4, 39.2, 40.5, 35.4, 28.3％であり、乳糖濃度が３０〜４０％で収率が最高の約４０％となっている。なお、試験例１によれば、２５〜４５％の乳糖濃度の溶液を使用することが好ましいとしている。【０００９】 この公報の発明は、それ以前に知られている哺乳動物、植物または微生物起源の酵素（エシェリキア・コリ、クライベロマイセス・ラクチス、アスペルギルス・ニガー等の酵素）を用いた場合には、乳糖の加水分解反応や、糖転移反応により一旦生成したオリゴ糖の加水分解反応により、オリゴ糖の生成量が最大でも約２５％とかなり低くなること、特公平３−５４５５９号公報のバシラス・サーキュランス由来の粗酵素を使用する方法によれば、３０〜４０％の収率でガラクトオリゴ糖を製造することができるとしてあるが、そこで使われている酵素は耐熱性が低く、６５℃で大部分が失活することなどの限界ないし問題点があるので、この公報の発明においては、収率をさらに高くし、かつ７０℃以上でも製造が可能であるガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することを目的としている。【００１０】（ハ）以下の従来技術については、酵素産生菌、基質濃度、反応温度、転移率などにつき、まとめて示してある。【００１１】・特公昭５８−２０２６６号公報（特開昭５５−１０４８８５号公報） ・酵素産生菌：アスペルギルス・オリゼ。 ・基質濃度：１０〜５０％程度。 ・反応温度：２０〜５０℃（実施例は３７℃）。【００１２】・特開平９−１１７２９７号公報 ・酵素産生菌：Penicilium citrinum 、Bacillus subtilis 。 ・反応温度：実施例は３７℃。【００１３】・特開平１０−２０１４７２号公報 ・酵素産生菌：ペニシリウム(Penicilium)属、アスペルギルス(Aspergillus) 属、ストレプトミセス(Streptomiyces) 属の微生物。 ・酵素：α−ガラクトシダーゼ。 ・反応温度：至適温度は５０℃。【００１４】・特開平８−１６８３９３号公報 ・基質：ガラクトシル基を有する糖と、スクロースまたはマルトース。 ・酵素産生菌：ロドトルラ(Rhodotorula) 属の酵母。 ・反応温度：１０〜６０℃（実施例は４０℃）。【００１５】・特公昭６３−３４（特開昭６２−１１８８８６号公報） ・酵素産生菌：バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)。従来法として、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)、クリベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 。【００１６】・特公平３−５４５５９号公報（特開平１−５１０９４号公報） ・酵素産生菌：バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)。従来法として、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)、クリベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 。 ・基質濃度：３０％以上、好ましくは約４０〜８０％。 ・反応温度：約４０〜７０℃。 ・収率：実施例では33.6〜４０％。【００１７】・特開平７−２２２５９４号公報 ・基質：ラクチュロースとラクトースの混合物。 ・酵素産生菌：ロドトルラ(Rhodotolura) 属。 ・反応温度：約２０〜８０℃。【００１８】・特開平５−１４０１７８号公報および特公平８−２４５９２号公報（特開平２−８４１９１号公報） ・酵素産生菌：ピクノポラス・シナバリヌス(Pycnoporus cinnabarinus) 、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis) 、デプロコッカス・ニューモニア(Diprococcus pneumoiae) 、モルティエレラ・ビナセ(Mortierella vinacea) 、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 、キャンディダ・ギリエルモンディー(Candida quilliermondii)、ビシア・サティバ(Vicia sativa)、緑色コーヒー豆(Green coffee bean) 。 ・基質：ガラクトース、ガラクトースを含む物質。【００１９】・特開平５−２３６９８１号公報 ・酵素産生菌：ステリグマトマイセス属、ロドトルラ属、シロバシディウム属またはリポミセス属の微生物。従来技術として、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、バチラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、リポミセス(Lipomyces) 属、ロドトルラ(Rhodotorula) 属、クルイベルミセス(Kluyveromyces) 属、デバリオミセス(Debaryomyces)属、クリプトコッカス・ローレンティー(Cryptococcus laurentii)。 ・基質：乳糖（鉄イオン、銅イオンまたは亜鉛イオンを添加）。【００２０】・特開昭６０−２５１８９６号公報 ・酵素産生菌：クリプトコッカス属。【００２１】【発明が解決しようとする課題】 従来提案されているβ−ガラクトシダーゼ産生菌由来の酵素を用いた場合は、一般的にはガラクトオリゴ糖への転移率が低く（たとえば２０〜４０％程度）、４０％を越える転移率を確保しようとすると、培養法や２段階反応法、あるいは金属イオンの添加などの特殊な方法を採用しなければならないので、操作や工程が煩雑になったり、不純物混入の危険が増加したりするという問題点があった。そのほか基質濃度を高くすることができないため工業化に支障を来すことがあったり、また最適反応温度が低いため雑菌が繁殖するおそれがあった。【００２２】 上に例示した従来技術の中には、このうちの１ないし２の要求を克服することができるものもあるが、これらの要求を全て満たすまでには至っていない。従来提案されている微生物に由来する酵素を用いたのでは、おのずから限界があるのである。【００２３】 本発明は、このような背景下において、従来提案されていない微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼを用いることにより、上記の壁を破る（ブレークスルーする）ことのできる技術を見い出し、もって、高い転移率でかつ工業的に有利にガラクトオリゴ糖を製造することのできる方法を提供することを目的とするものである。【００２４】【課題を解決するための手段】 本発明のガラクトオリゴ糖の製造法は、 基質であるラクトースに、ドシディール目(Dothideales) の微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼを作用させて、ガラクトオリゴ糖を生成させること、および、 前記ドシディール目(Dothideales) の微生物が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された「寄託番号 FERM P-18651」の「Dothideales-SIID1019-1-16 」であること、を特徴とするものである。【００２５】【発明の実施の形態】 以下本発明を詳細に説明する。【００２６】〈基質〉 本発明においては、基質として、ラクトース（Lactose 、乳糖）またはラクトースを豊富に含む原料を用いる。ラクトースは、Ｄ−グルコースの４位にＤ−ガラクトースがβ−グルコシド結合したものである。【００２７】〈β−ガラクトシダーゼ産生菌〉 本発明において用いるドシディール目の菌は、本発明者らが自然界から分離した新規な菌類（カビ）であり、すでに独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに「寄託番号 FERM P-18651」の「Dothideales-SIID1019-1-16 」菌として寄託されている。なお、この菌類の同定のための以下に述べる試験は、NCIMB Japan Co., Ltd. に依頼して行った。【００２８】 この「FERM P-18651」菌の菌学的特徴に関し、検体をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）、オートミール寒天（ＯＡ）、２％麦芽寒天（ＭＥＡ）の各プレートに接種し、２５℃で最長３週間の培養を行い、コロニーの巨視的特徴を肉眼および実体顕微鏡で観察した。コロニー色調についてはMethuen Handbook of Colour (Kornerup & Wanscher, 1978)に従い、ＰＤＡスライド培養検体の微視的特徴の観察は光学顕微鏡にて行った。【００２９】 その結果、ＯＡ、ＭＡ、ＰＤＡ共に、２５℃での生育はやや遅く、１週間で直径 0.8〜1.0 cmの生育を示した。全ての培地において、コロニー周縁はやや波状で低凸状の盛り上がりを示した。菌糸は寒天内に比較的深い潜り込みを見せた。気中菌糸は当初フェルト状で、コロニー表面色調は当初yellowish white - yellowish gray (3A-B2)を示し、その後ＭＥＡプレートおよびＰＤＡプレートの気中菌糸部ではyellowish gray - dull yellow (3B2-3)を、ＯＡプレートおよびＰＤＡプレートの基低菌糸部でolive - olive yellow (3C-D3-6)を呈した。コロニー裏面は、当初よりbronze - dark brown (5-7E-F5) を呈した。全てのプレートにおいて、透明な滲出液の産生は認められなかったが、ＯＡプレートでは培養３週間後の検体から若干geranium (11B7) の可溶性色素の産生が観察された。【００３０】 微視的観察では、菌糸体に規則的な隔壁が認められた。菌糸の大半は屈曲した広がりを示した。分岐は全体的によく観察されるが、特に基部周辺では格子状となった分枝が比較的多く観察された。菌糸が数本から１０数本集まり、束状となったものが比較的多く観察された。菌糸幅は菌糸基部および先端ともにほぼ同程度であった。菌糸表面は平滑で、壁は厚かった。培養３週間経過後の気中菌糸基部からは油滴状の構造物が若干観察された。菌糸の隔壁周辺部において、かすがい連結の形成は確認されなかった。有性および無性生殖器官の形成についても確認したが、培養３週間経過後の検体からも観察されず、また厚壁胞子の存在も確認されなかった。これらのことから、この検体は、現在の分類体系に従えば、その帰属を担子菌門あるいは子菌門、すなわち高等菌類（旧分類体系における無胞子不完全菌類）に含まれるとするのが至当である。なお、この検体の全体像（微分干渉顕微鏡、倍率：３６０倍）および気中菌糸（微分干渉顕微鏡、倍率：７２０倍）も撮影してある。（図示は省略。）【００３１】 上記の菌体（「FERM P-18651」菌）をYM broth (Becton, Dickinson, MA)にて３０℃で４日間培養し、培養後に集菌し、凍結乾燥した。この凍結乾燥菌糸からＤＮＡ分離を行った。この分離ＤＮＡを用いて、常法に従って目的遺伝子塩基配列を得た。（操作の詳細および塩基配列は省略。）【００３２】 上記の菌体（「FERM P-18651」菌）のＤＮＡ配列データベース(GenBank) から類似の塩基配列を検索するため、BLAST (Altschul et al., 1997) によるホモロジー検索を行った。ホモロジー検索の結果を参考に操作可能な分類群を選定し、近隣結合法(Saitou & Nei, 1987)により分子系統樹を作成した。系統樹作成は、Clustal X (Thompson et al., 1997) にてマルチプルアライメント作成および系統樹推定、１０００回のブーツストラップ(Felsenstein, 1985) による信頼性評価を行った。距離は木村の２変数法(Kimura, 1980)による（α／β= 2.0)。【００３３】 その結果、系統樹で上記検体の近傍に位置した各タクソンの帰属は、次の表１の通りであった。上記検体は、分子系統上、Dothideales に帰属するものと判断される。【００３４】【表１】 タクソン名 テレオモルフ属名 科(Family)名 目(Order) 名 Spilocaea Venturia Venturiaceae oleaginea Cucurbitaria Cucurbitaria Cucurbitariaceae berberidis Septoria Dothideales nodorum Mycosphaerella Mycosphaerellaceae Mycosphaerella mycopappi Westerdykella Westerdykella dispersa Sporormiaceae Sporormia Sporormia lignicola 【００３５】〈培養、産生酵素の分離〉 ドシディール目の菌類（カビ）である上記の菌体（「FERM P-18651」菌）を培養することにより、培養菌体または菌体を含む培養液が得られるので、本発明においてはその菌体（またはそれを含む培養液）自体を菌体内酵素と共にそのまま用いることができる。このとき、反応を特に３０℃±５℃で行うと、グルコースが菌体により消化され、後述の実施例２のように、反応物中の糖全体に占める３糖および４糖以上のガラクトオリゴ糖の合計量が７０％を越えるような高転移率で、ガラクトオリゴ糖が容易に得られる。【００３６】 液体培養を行うときの培養液の培地組成の例については、後に実施例の箇所で述べる。【００３７】 一方、大規模生産の観点からは、菌体を分離し、固定化し、固定化菌体として用いるか、あるいは産生酵素を菌体から遊離させて酵素を固定化し、固定化酵素として用いることが有利である。【００３８】 産生酵素を菌体から分離するときは、培養液から菌体をろ過などの手段により回収し、ついで超音波法など適宜の手段により菌体を破砕して破砕菌体と上清とに分離し、その上清を遠心分離して粗酵素抽出液を得ればよい。必要に応じ、さらに精製を行うこともできる。【００３９】〈反応〉 基質であるラクトースに、ドシディール(Dothideales) 目の微生物である上記の菌体（「FERM P-18651」菌）に由来するβ−ガラクトシダーゼを作用させることにより、ガラクトオリゴ糖を効率的に製造することができる。生成するガラクトオリゴ糖とは、Gal をガラクトース、Glc をグルコースとするとき、主に 「Gal β1-6 Gal β1-4 Glc 」および「Gal β1-3 Gal β1-4 Glc 」の３糖、および 「Gal β1-6 Glc 」または「Gal β1-3 Glc 」のガラクトース転移２糖である。ちなみに、原料ラクトースは 「Gal β1-4 Glc 」である。【００４０】 生成したガラクトオリゴ糖は、それをさらに精製したり、各成分ごとに分離ないし濃縮したりすることもできるが、通常はそこまでするには及ばないので、そのまま種々の用途に用いることが多い。このとき、水溶液の状態で酸性条件下に保存しても、変質を起こしにくい。【００４１】 反応系の基質濃度は、通常は３０〜８０％、さらには４０〜７５％、殊に５０〜７５％というように広い範囲に設定することができる。７０％前後というように高い濃度に設定しうることが本発明の特徴の一つであり、そのような高い濃度条件を採用すれば、反応装置の点で工業的に有利となる。【００４２】 反応温度は、常温〜７５℃程度、通常は３０〜７５℃、殊に４０〜７５℃程度、なかんずく５０〜７０℃、さらには６０〜７０℃とすることが好ましい。７０℃前後というような高温でも反応が進むことが本発明の特徴の一つであり、そのような高温条件を採用すれば、雑菌の繁殖を防止することができる。【００４３】 反応系のｐＨは３〜７、殊に５〜６とすることが多い。【００４４】 反応時間は、１２時間〜４日程度とすることが多い。【００４５】 反応の停止（酵素の失活）は、反応液をたとえば８０℃以上にもたらすことにより達成できる。【００４６】 基質からのガラクトオリゴ糖転移率、生成ガラクトオリゴ糖の組成（転移２糖と３糖以上との比率）は、反応条件（基質濃度、反応温度、反応時間など）に依存するので、反応条件を適宜に設定することにより、目的とする転移率や組成のガラクトオリゴ糖を得ることができる。このように、予め設計した転移率や組成をもたらすことができることも、本発明の特徴の一つである。【００４７】〈用途〉 得られたガラクトオリゴ糖は、腸内におけるビフィズス菌の増殖促進作用ないし整腸作用、無味性、耐酸性、耐熱性、保湿作用、低カロリー性などの諸機能を生かして、食品素材（機能性食品）、医薬品原料、動物飼料配合用、飼育動物用人工乳材料をはじめとする種々の用途に用いることができる。【００４８】【実施例】 次に実施例をあげて本発明を詳細に説明する。濃度表記の「％」は、先に述べたものも含めて、「(wt/vol)％」である。【００４９】実施例１ 寄託番号 FERM P-18651 の「Dothideales-SIID1019-1-16 」を用いて、以下の実験を行った。【００５０】（スラント）・組成 ラクトース１％、酵母エキス 0.1％、(Stock solin Salt, Mg) 1:100の比（１００mlに１ml）、Agar 1.6％ ｉ．Stock solin Salt (1) NaCl 0.25％ (2) KH2PO4 0.5 ％ (3) K2HPO4 0.5 ％ (4) NH4NO3 1.0 ％を１００ml ii．Stock solin Mg MgSO4 ・7H2O 0.25％を１００ml【００５１】（前培養） 次の組成、すなわち、 ・ラクトース 2.5〜 5.0％ ・ポリペプトン 1.0％ ・酵母エキス 1.0％ ・(Stock solin Salt, Mg) 1:100（１００mlに１ml）の培養液（ｐＨ 7.0）を調製し、１００ml容量の三角フラスコに３０mlを採って、３０℃、１００〜１２０rpm 、３〜５日間の条件で培養するか、あるいは１００mlで静置培養を行った。培養は、菌がふわっとした状態（小さい胞子が何粒もブドウ房状）となるまで行った。【００５２】（本培養） 次の組成、すなわち、 ・ラクトース 5.0％ ・ポリペプトン 2.0％ ・酵母エキス 1.0％ ・(Stock solin Salt, Mg) 1:100の比 (１００mlに１ml)の培地（ｐＨ 7.0）を調製し、５００ml容量の三角フラスコに２００mlを採って、３０℃、１２０rpm 、７日間の条件で培養を行った。【００５３】（菌体の回収） Whatman 社製のろ紙「ＧＦ／Ａ（直径１１０mm）」を用いて吸引ろ過することにより、菌体を回収した。【００５４】（粗酵素の抽出） 菌体（適量）を、 0.1M-MacIlvain 緩衝液（ｐＨ 5.0）１００ml、 0.5％ドデシル硫酸ナトリウム１００ml、蒸留水１００mlの計３００mlの溶液の入ったフラスコに入れ、３０℃で６時間振盪した。この液を氷冷しながらソニケーターにより２０kHz の超音波を約５分間かけ、または 0.5Ｍの同緩衝液キタラーゼ（Wako）(from Rhizoctonia solani) を0.15mg/ml の濃度で添加、混合したものを４０℃で 2.5時間処理し、菌体粉砕を行った。この懸濁液をろ紙（Whatman 社製のろ紙「ＧＦ／Ａ（直径１１０mm）」を敷いたヌッチェを用い、アスピレーターで吸引ろ過し、粉砕菌体と上清とに分離した。この上清を４℃、１２０００rpm 、１５分間の条件で遠心分離し、その上清を粗酵素液とした。【００５５】（力価の測定） ニトロフェノール法により力価の測定を行った。すなわち、ワッセルマン試験管中にＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニルガラクトピラノシド）水溶液（５０ｍＭ）（0.1M-MacIlvain（ｐＨ 5.0）緩衝液中） 2.4mlを入れ、７０℃で１分間の予備加熱後、菌体 0.1ｇまたは粗酵素 0.1mlを加え、恒温槽下にスターラーを置き、１０分間酵素反応を行った。加温後、反応液に１Ｍ Na2CO3 1.0mlを加え、反応を停止し、それに 1.5mlの蒸留水を加え（トータル５ml）、４１０nmの吸光度により遊離したｐ−ＮＰ量を定量した。１分間に１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊離する力価を１unitとする。【００５６】（反応） 反応温度を３０℃または７０℃とし、基質濃度を５０％、６０％または７０％とし、反応時間を１４４時間としたときの結果を、後の表２〜７に示す。相対保持時間は、Glc を1.00としている。【００５７】（生成物の定量） 生成物の定量は、ＨＰＬＣ法により行った（TSKGel Amido-80 、４mmφ×２５cm、溶離液：アセトニトリル／水＝７５／２５、１ml/min）。【００５８】【表２】 添加酵素力価 1.8ｕ/g-Lactose 反応温度３０℃、基質濃度５０％ 相対保持時間 反応時間 (hr) ／生成物 4 6 12 48 144 1.00／Glc 2.9 4.1 4.0 3.5 3.5 1.06／Gal - 1.0 0.8 2.0 2.7 1.30／２糖 - - - 2.5 1.9 1.37／２糖 - - - 3.0 2.2 1.51／Lac 97.1 93.3 88.6 49.2 56.6 1.70／２糖 - - - 1.9 - 1.78／２糖 - - - 2.4 0.8 1.92／２糖 - - - - - 2.04／３糖以上 - - - 1.1 - 2.22／３糖以上 - 1.6 3.4 21.4 28.5 2.37／３糖以上 - - 3.3 5.0 2.8 2.55／３糖以上 - - - 3.7 - 2.80／３糖以上 - - - 3.0 - 転移率(%) ２糖（除 Lac） 0.0 0.0 0.0 9.8 4.9 ３糖以上 0.0 1.6 6.7 34.2 31.3 ２糖以上合計 0.0 1.6 6.7 44.0 36.2【００５９】【表３】 添加酵素力価 1.0ｕ/g-Lactose 反応温度３０℃、基質濃度６０％ 相対保持時間 反応時間 (hr) ／生成物 4 6 12 48 144 1.00／Glc - 2.3 1.6 4.8 2.5 1.06／Gal - 0.6 - 1.3 0.6 1.30／２糖 - - 0.7 1.9 0.4 1.37／２糖 - - - 2.0 - 1.51／Lac 100.0 96.3 89.7 59.8 82.5 1.70／２糖 - - - 1.4 - 1.78／２糖 - - - 1.9 - 1.92／２糖 - - - - - 2.04／３糖以上 - - - - - 2.22／３糖以上 - 0.9 6.0 17.7 10.5 2.37／３糖以上 - - 2.0 3.7 - 2.55／３糖以上 - - - 2.6 - 2.80／３糖以上 - - - 1.0 - 転移率(%) ２糖（除 Lac） 0.0 0.0 0.7 7.2 0.4 ３糖以上 0.0 0.9 8.0 25.0 10.5 ２糖以上合計 0.0 0.9 8.7 32.2 10.9 【００６０】【表４】 添加酵素力価 0.4ｕ/g-Lactose 反応温度３０℃、基質濃度７０％ 相対保持時間 反応時間 (hr) ／生成物 4 6 12 48 144 1.00／Glc - - 2.3 3.9 1.1 1.06／Gal - - 0.2 0.7 0.2 1.30／２糖 - - - 0.8 0.2 1.37／２糖 - - - 1.0 0.5 1.51／Lac 100.0 100.0 97.5 75.2 91.2 1.70／２糖 - - - 0.9 0.4 1.78／２糖 - - - 1.8 0.6 1.92／２糖 - - - - 0.3 2.04／３糖以上 - - - - - 2.22／３糖以上 - - - 9.9 3.5 2.37／３糖以上 - - - 2.0 0.9 2.55／３糖以上 - - - 1.5 0.5 2.80／３糖以上 - - - 0.6 0.3 転移率(%) ２糖（除 Lac） 0.0 0.0 0.0 4.5 2.0 ３糖以上 0.0 0.0 0.0 14.0 5.2 ２糖以上合計 0.0 0.0 0.0 18.5 7.2【００６１】【表５】 添加酵素力価 0.8ｕ/g-Lactose 反応温度７０℃、基質濃度５０％ 相対保持時間 反応時間 (hr) ／生成物 4 6 12 48 144 1.00／Glc 14.3 18.7 30.7 31.0 36.4 1.06／Gal 1.2 2.1 2.1 6.6 7.4 1.30／２糖 2.5 3.9 6.4 3.4 2.9 1.37／２糖 2.8 4.7 8.5 4.0 3.8 1.51／Lac 53.9 44.0 27.3 23.8 13.1 1.70／２糖 0.9 1.4 - 9.5 10.3 1.78／２糖 0.9 1.8 - 11.7 13.9 1.92／２糖 - - - - - 2.04／３糖以上 - - - 1.7 0.4 2.22／３糖以上 19.0 18.5 21.4 - 1.8 2.37／３糖以上 4.4 3.7 3.7 7.1 8.5 2.55／３糖以上 - - - - 0.3 2.80／３糖以上 - - - - 1.2 転移率(%) ２糖（除 Lac） 7.1 11.8 14.9 28.6 30.9 ３糖以上 23.4 22.2 25.1 8.8 12.2 ２糖以上合計 30.5 34.0 40.0 37.4 43.1 【００６２】【表６】 添加酵素力価 1.0ｕ/g-Lactose 反応温度７０℃、基質濃度６０％ 相対保持時間 反応時間 (hr) ／生成物 4 6 12 48 144 1.00／Glc 10.4 12.8 19.7 30.2 24.7 1.06／Gal 0.8 0.9 1.7 3.4 3.8 1.30／２糖 1.4 2.0 3.7 3.6 4.4 1.37／２糖 1.4 2.5 4.7 5.5 5.2 1.51／Lac 69.1 55.8 37.7 17.0 17.5 1.70／２糖 - 0.8 - 5.4 5.9 1.78／２糖 - 1.1 0.7 8.5 7.9 1.92／２糖 - - - - 1.0 2.04／３糖以上 - - - 1.2 2.7 2.22／３糖以上 14.0 18.6 24.0 9.2 8.9 2.37／３糖以上 2.8 5.3 7.0 12.0 11.1 2.55／３糖以上 - - - 0.6 2.2 2.80／３糖以上 - - - 3.5 4.8 転移率(%) ２糖（除 Lac） 2.8 6.4 9.1 23.0 24.4 ３糖以上 16.8 23.9 31.0 26.5 29.7 ２糖以上合計 19.6 30.3 40.1 49.5 54.1 【００６３】【表７】 添加酵素力価 0.4ｕ/g-Lactose 反応温度７０℃、基質濃度７０％ 相対保持時間 反応時間 (hr) ／生成物 4 6 12 48 144 1.00／Glc 5.8 7.3 11.2 19.4 19.1 1.06／Gal - 0.5 1.0 2.8 1.7 1.30／２糖 0.9 0.8 2.0 4.4 4.7 1.37／２糖 0.6 0.9 2.2 5.0 5.5 1.51／Lac 85.6 72.9 55.4 24.8 24.7 1.70／２糖 - 0.3 1.0 2.4 2.3 1.78／２糖 - 0.5 1.3 3.1 3.1 1.92／２糖 - - - 0.4 0.2 2.04／３糖以上 - - - 1.2 1.0 2.22／３糖以上 6.5 12.2 17.1 21.9 22.1 2.37／３糖以上 0.6 3.5 6.0 10.1 10.1 2.55／３糖以上 - 0.5 1.4 1.4 1.3 2.80／３糖以上 - - - 3.0 2.9 転移率(%) ２糖（除 Lac） 1.5 2.5 6.5 15.3 15.8 ３糖以上 7.1 16.2 24.5 37.6 37.4 ２糖以上合計 8.6 18.7 31.0 52.9 53.2 【００６４】（解析） 上記の表２〜７から、次のことがわかる。 １．基質濃度が高いほど３糖以上の割合が高く、基質濃度が低いほど、比較的早い時期から転移２糖が生成される。 ２．反応初期には３糖以上が生成し、時間の経過と共に転移２糖が蓄積される。 ３．これらの性質を利用して、転移２糖と３糖以上との割合を調整できる。 ４．たとえば、反応時間を６日（１４４時間）としたとき、主な基質濃度および反応温度による生成ガラクトオリゴ糖の組成の調整は、次の表８のようになる。【００６５】【表８】 反応温度 基質濃度 転移２糖 ３糖以上 合 計 ３０℃ ５０％ 約 ５％ 約３１％ 約３６％ ７０℃ ５０％ 約３１％ 約１２％ 約４３％ ７０℃ ６０％ 約２４％ 約３０％ 約５４％ ７０℃ ７０％ 約１６％ 約３７％ 約５３％【００６６】実施例２ 実施例１の「（本培養）」で培養した培養液５０mlと、１００mlに４０ｇのラクトースを含む滅菌溶液とを混合し、３０℃、１２０rpm の条件で６日間培養を行った。【００６７】 ついで不溶性の物質をろ別し、減圧乾固したところ、２０ｇの固形物が得られた。ＨＰＬＣで分析の結果は、 ３糖 ４２％ ４糖以上 ３５％ ２糖（含ラクトース） １５％ 単糖 ８％ 合計 １００％であり、反応物中の糖全体に占める３糖および４糖以上の合計量が７７％というような高率で、ガラクトオリゴ糖が生成してことがわかった。【００６８】【発明の効果】 本発明の方法は、従来知られていなかったドシディール目の微生物（菌類、カビ）である上記の菌体（「FERM P-18651」菌）に由来する酵素を用いており、本発明によれば、主として、Gal β1-6 Gal β1-4 Glc 、Gal β1-3 Gal β1-4 Glc のほか、４糖以上の転移糖、およびガラクトース転移２糖を生産することができる。【００６９】 菌類（カビ）を用いる方法であるため、酵母やバクテリアを用いる方法に比し、生産にかかる操作が簡単である（たとえばろ過性が良くなる）。【００７０】 本発明によれば、１段階の酵素反応で、ガラクトオリゴ糖を高収率で得ることができる。ガラクトオリゴ糖を原料ラクトースに対し５０％以上も含有する糖液を工業的に生産することもできる。【００７１】 菌体より遊離させた酵素を用いたときは、反応にかかる酵素力価を高くできるので生産性の点で有利である上、不純物量も少なくすることができる。【００７２】 基質濃度を高くすることができるので（たとえば７０％）、生産性、装置効率の点で有利であること、【００７３】 比較的高温で反応させることもできるので（たとえば７０℃）、雑菌繁殖による汚染を低減できること、【００７４】 そして、基質濃度、反応温度、反応時間などを選ぶことにより、転移２糖と３糖以上との生成割合を広い範囲で調整できるので、目的用途に合った生成物組成とすることができる。【００７５】 また、培養後の菌体（またはそれを含む培養液）とラクトースとを３０℃前後の温度で反応させると、グルコースが菌体により消化されるため、極めて高い転移率で３糖および４糖以上のガラクトオリゴ糖が得られる。【００７６】 よって、本発明の方法は、ガラクトオリゴ糖を得る工業的な製法として、他の種々の微生物に由来する酵素を用いている従来法に比し、工業生産上のメリットが大である。 基質であるラクトースに、ドシディール目(Dothideales) の微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼを作用させて、ガラクトオリゴ糖を生成させること、および、 前記ドシディール目(Dothideales) の微生物が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された「寄託番号 FERM P-18651」の「Dothideales-SIID1019-1-16 」であること、を特徴とするガラクトオリゴ糖の製造法。