生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_新規カルシウム拮抗剤 |
| 出願番号： | 2001576049 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | A61K 31/7072,A61P 7/02,A61P 9/10,A61P 43/00,C07H 19/10 |
特許情報キャッシュ
田中 俊雄 菅谷 純子 岸 雄一郎 松川 晃 JP 4601238 特許公報(B2) 20101008 2001576049 20000417 新規カルシウム拮抗剤 扶桑薬品工業株式会社 000238201 青山 葆 100062144 矢野 正樹 100106231 田中 俊雄 菅谷 純子 岸 雄一郎 松川 晃 20101222 A61K 31/7072 20060101AFI20101202BHJP A61P 7/02 20060101ALI20101202BHJP A61P 9/10 20060101ALI20101202BHJP A61P 43/00 20060101ALI20101202BHJP C07H 19/10 20060101ALN20101202BHJP JPA61K31/7072A61P7/02A61P9/10A61P43/00 111C07H19/10 A61K 31/7072 A61P 7/02 A61P 9/10 A61P 43/00 C07H 19/10 CAplus/CASREACT/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN) JSTPlus/JMEDPlus(JDreamII) 特開２０００−２４７８９１（ＪＰ，Ａ） Stroke,1997,28,p2053-2059 3 JP2000002477 20000417 WO2001078749 20011025 16 20070208 瀬下 浩一 技術分野本発明は、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物の新しい用途、特にウリジン５’−アルキルホスフェート化合物またはアデノシン５’−アルキルホスフェート化合物のカルシウム拮抗剤としての用途に関する。背景技術感染症は、抗生物質などの薬剤によって克服されつつあるが、他方、循環器系疾患は、食生活の西洋化に伴う摂取脂肪量の急激な増加と日本古来からの高塩化ナトリウム食とが相まって、症例の拡大を見つつあり、高齢化が進む将来においてはゆゆしい問題になることが懸念されている。このような状況を反映して、種々の循環器用薬剤が開発されてきているが、中でもカルシウム拮抗作用を機序とする循環器用薬にはその優れた薬効から大きな期待が寄せられている。カルシウム拮抗剤は、血管平滑筋細胞へのカルシウムイオンの流入を抑制することにより、冠動脈の太い部分および細い部分の両方を弛緩させ、これにより冠動脈血流量を増加させ、心筋への酸素供給を増大させる。従来のカルシウム拮抗剤は、主にニフェジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムの三つのタイプに分けられるが、これらのうち、ニフェジピンタイプ（ジヒドロピリジンタイプ）のカルシウム拮抗剤は、血管のみならず、心筋細胞におけるカルシウムイオンの流入も抑制する作用を有しており、ベラパミルやジルチアゼムに比較して、相対的に心臓抑制作用が弱いと理解されている。発明の目的カルシウム拮抗剤は、現在、狭心症や心筋梗塞のような虚血性心疾患の治療薬として注目を浴びるに至っており、より強力かつ安全な効力を有するカルシウム拮抗剤の提供が、常時、要望されている。本発明の主な目的は、このような新規カルシウム拮抗剤を提供することである。以下、添付の図面を参照し、本発明のこの目的および他の目的ならびに効果について、さらに説明する。発明の概要本発明者らも、このような要望に応えるべく、種々のヌクレオシド化合物について種々研究を重ねるうち、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物、とりわけウリジン５’−アルキルホスフェート化合物またはアデノシン５’−アルキルホスフェート化合物が顕著なカルシウム拮抗作用を有する事実を確認し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。ウリジン類化合物については、本発明に先立って、ウリジン５’−モノホスフェート（ＵＭＰ）の血小板凝集作用の有無を検討した事実が存在するが、陰性の結果が得られた旨、報告されている（薬学雑誌、１１１（９）５０４−５０９（１９９１））。また、ウリジン５’−アルキルホスフェート類は、酵母菌のαおよびαハプロイド（１倍体）細胞間の有性凝集を阻害するが、細胞の成長には影響しないことが報告されている（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４７，１７−２２（１９９７））。この凝集阻害は、ウリジン５’−アルキルホスフェート類の酵母菌細胞壁への直接の作用によるものではないことが明らかになっている。本発明の要旨は、式Ｉ：（式中、Ｒは直鎖または分岐鎖状アルキル基を示し、Ｂはヌクレオシドを構成する塩基を示す。）で表されるヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物（以下、単に化合物（Ｉ）と称する）を有効成分とするカルシウム拮抗剤、特に、血小板凝集抑制剤にある。発明の詳細な説明上記式Ｉにおいて、Ｒで示されるアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれであってもよい。その炭素数は、通常３０を超えることはなく、好ましくは４〜２４、さらに好ましくは１６〜２０である。このようなアルキル基の具体例としては、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルなどの直鎖状アルキルまたはゲラニル、ファルネシルなどの分岐鎖状アルキルを挙げることが出来る。また、Ｂで示される、ヌクレオシドを構成する塩基としては、アデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンを挙げることができる。現時点で最も好ましいと考えられるものは、Ｒが炭素数１６のｎ−ヘキサデシル基であり、かつＢがアデノシンまたはウリジンを表す場合、すなわち、アデノシン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＡＭＰＣ１６）またはウリジン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＵＭＰＣ１６）である。有効成分としての本発明の化合物（Ｉ）は、遊離形のみならず、医薬的に許容される限り、水和物、塩、エステルなど、生体内で遊離形を与えることの出来る任意の形で使用されてよい。したがって、以下の記載において、化合物（Ｉ）は、遊離形のみならず、そのような医薬的に許容される任意形をも包括して意味するものとする。本発明の化合物（Ｉ）、すなわちヌクレオシド５’−アルキルホスフェートは、一般にヌクレオシド５’−モノホスフェート（式Ｉにおいて、Ｒ＝Ｈに相当する化合物）から自体常套の方法により合成することができる。例えば、ヌクレオシド５’−モノホスフェートおよび種々の直鎖状または分岐鎖状アルキルアルコールをｔ−ブチルアルコールに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させることにより、製造することが出来る。反応温度は、溶媒の種類により異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは７０〜９０℃であり、反応時間は、反応温度により異なるが、通常２〜２０時間、好ましくは６〜８時間である。化合物（Ｉ）は、後に記載するように、ウサギの血小板を使用する凝集試験において、阻害効果を有する事実が確認された。また、化合物（Ｉ）について、細胞内カルシウムイオン流入抑制作用を有する事実も確認された。したがって、化合物（Ｉ）は、カルシウム拮抗剤として有用なものであり、さらに血小板凝集抑制剤として有用なものである。化合物（Ｉ）は、例えば、経口、非経口、口腔、経直腸または経皮投与により、すなわち薬剤を適用するのに都合のよい方法で投与することが出来る。経口投与のためには、液体または固体、たとえば、シロップ、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセルまたはロゼンジとして処方できる。液体処方は、一般に、化合物（Ｉ）を、沈殿防止剤、保存剤、フレーバー剤、着色剤などのような任意の添加剤と共に、適当な液体担体（例えば、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、油、水）中へ、懸濁または溶解させて調製する。錠剤形である組成物は、固体処方の製造に慣用的な適宜の医薬担体を用いて製造することが出来る。このような担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースを包含する。カプセル形である組成物は、慣用的カプセル化操作を用いて製造できる。たとえば、活性成分含有のペレットを標準担体の使用により調製し、ついで、硬ゼラチンカプセルに充填することができる。別法として、いずれか適当な医薬担体、たとえば水性ガム、セルロース、シリケートまたは油を用いて分散液または懸濁液を調製し、ついで該分散液または懸濁液を軟ゼラチンカプセルに充填することができる。化合物（Ｉ）は、また、ボーラス注射または点滴により非経口投与してもよい。典型的な非経口用組成物は、該化合物の滅菌水性担体または非経口的に許容される油中、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油またはゴマ油中溶液または懸濁液からなる。別法として、該溶液を凍結乾燥し、ついで、投与直前に適当な溶媒で復元してもよい。本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセルまたはアンプルのような単位投与形であるのが好ましい。経口投与用の各投与単位は、１〜２５０ｍｇ（非経口投与では、好ましくは０．１〜６０ｍｇ）の化合物（Ｉ）（遊離塩基として換算）を含有するのが好ましい。成人患者の場合、一日の投与量は、たとえば化合物（Ｉ）（遊離塩基として換算）が、１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２５０ｍｇ（例えば、５〜２００ｍｇ）の経口用量、あるいは０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜６０ｍｇ（例えば、１〜４０ｍｇ）の静脈内、皮下または筋肉内用量であり、それを一日に１〜４回投与する。また、化合物（Ｉ）を、好ましくは一日当たり４００ｍｇまでの用量で、連続的静脈内注入により投与してもよい。かくして、経口投与による一日の全用量は、１〜２０００ｍｇの範囲にあり、非経口投与による一日の全用量は０．１〜４００ｍｇの範囲にある。適当には、該化合物を連続的治療の期間中、たとえば１週間またはそれ以上の期間投与する。以下、本発明の化合物（Ｉ）の製造例、製剤例および試験例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。製造例ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物は、Ｍａｃｈｉｄａ Ｋ．らの方法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１４７，１７−２２（１９９７））により合成した。例えば、ウリジン５’−ヘキサデシルホスフェート（Ｉ：Ｒ＝Ｃ１６Ｈ３３、Ｂ＝ウリジン）（ＵＭＰＣ１６）の場合、以下のごとく合成される。ウリジン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）およびヘキサデシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのｔ−ブチルアルコールに溶解した後、３ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、８０℃で２０時間加熱する。反応終了後、生成した沈殿を濾別し、ｔ−ブチルアルコールを減圧下に除去する。残渣をヘキサンおよびアセトンの混液（１：１）で数回洗浄し、乾燥した後、クロロホルムおよびメタノールの混液（９５：５）に溶解する。これを同溶液にて作成したシリカゲルカラムに負荷し、カラムを同液で充分洗浄してジシクロカルボジイミドを流出させる。以後、メタノールの濃度を順次、上昇させることによって、ウリジン５’−ヘキサデシルホスフェートを溶出する。溶出液から溶媒を減圧下に除去することにより、白色の沈殿を得た。対ウリジン５’−モノホスフェートあたりの収率は、３２．４％であった。製剤例１（静脈内注射）化合物（Ｉ） １−４０ｍｇバッファー ｐＨ約７まで溶媒 １００ｍｌまで製剤例２（ボーラス注射）化合物（Ｉ） １−４０ｍｇバッファー ｐＨ約７まで共溶媒 ５ｍｌまで上記製剤例１および２において、バッファーの具体例としてはクエン酸塩、リン酸塩および水酸化ナトリウム／塩酸を、溶媒の具体例としては水を、共溶媒の具体例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびアルコールを挙げることができる。製剤例３（錠剤）化合物（Ｉ） １−４０ｍｇ希釈剤／充填剤 ５０−２５０ｍｇ結合剤 ５−２５ｍｇ崩壊剤 ５−５０ｍｇ滑沢剤 １−５ｍｇ上記製剤例３において、希釈剤／充填剤の具体例としては微結晶セルロース、ラクトースおよび澱粉を、結合剤の具体例としてはポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを、崩壊剤の具体例としてはナトリウム澱粉グリコレートおよびクロスポビドンを、滑沢剤の具体例としてはステアリン酸マグネシウムおよびステアリルフマル酸ナトリウムを挙げることができる。製剤例４（経口用懸濁液）化合物（Ｉ） １−４０ｍｇ沈殿防止剤 ０．１−１０ｍｇ希釈剤 ２０−６０ｍｇ保存剤 ０．０１−１．０ｍｇバッファー ｐＨ約５−８まで共溶媒 ０−４０ｍｇフレーバー ０．０１−１．０ｍｇ着色剤 ０．００１−０．１ｍｇ上記製剤例４において、沈殿防止剤の具体例としてはキサンチンガムおよび微結晶セルロースを、希釈剤の具体例としてはソルビトール溶液、典型的には水を、保存剤の具体例としては安息香酸ナトリウムを、バッファーの具体例としてはクエン酸塩を、共溶媒の具体例としてはアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびシクロデキストリンを挙げることができる。試験例１．試験材料と試験方法１−１．試験材料試験化合物としてのウリジン５’−オクチルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ８Ｈ１７）（ＵＭＰＣ８）、ウリジン５’−ドデシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ１２Ｈ２５）（ＵＭＰＣ１２）、ウリジン５’−エイコシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ２０Ｈ４１（ＵＭＰＣ２０）、ウリジン５’−テトラコシルホスフェート（Ｉ： Ｒ＝Ｃ２４Ｈ４９）（ＵＭＰＣ２４）およびアデノシン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＡＭＰＣ１６）は、それぞれ、製造例の方法に準じて合成した。血小板凝集誘導剤としての１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＦ）は、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入したものを使用した。カルシウム−イオン透過担体「Ａ２３１８７」、ウシ血漿由来トロンビン、アラキドン酸、パルミチン酸、ヘキサデシルアルコール、アデノシン５’−ジホスフェート（ＡＤＰ）、イオノマイシンカルシウム塩およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，必須脂肪酸を含まない）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）の製品を用いた。ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物および脂質は、クロロホルム−メタノール−水の展開溶媒系でシリカゲル６０Ｈプレートを用いた薄層クロマトグラフィーにより単一スポットを示すか、あるいは、メタノール−水−アセトニトリルの溶媒系でＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより単一ピークを示すものを用いた。フラ２ＡＭとフラ２は、同仁（熊本、日本）の製品を用いた。塩酸ベラパミル、１２−ミリスチン酸１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ）、フィコール−ハイパーク液、および塩化ピアシナノールは、それぞれ和光純薬（東京、日本）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（東京、日本）およびナカライテスク（京都、日本）から入手した。溶媒は全ての試薬が特級である。ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物の機能としての臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、塩化ピナシアノール色素の可視吸収スペクトル（５９５ｎｍ）を測定することにより決定した（Ｎｕｎｎ，ＣＣら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，８６，３２７１−３２７２（１９８２））。バッファー組成は、次のとおりである：（１）基本タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）液：ＮａＣｌ ８．０１ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．１９５ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ ０．２１５ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３ １．０２ｇ／Ｌ、グルコース １．０１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２；（２）Ｃａ２＋を含まずＥＤＴＡを含んだタイロード／ゼラチン：バッファー（１）と同じであるが、ゼラチン（２．５ｇ／Ｌ）とＮａ２ＥＤＴＡ（０．３７３ｇ／Ｌ）を含む、ｐＨ６．５；（３）Ｃａ２＋を含んだタイロード／ゼラチン：バッファー（１）と同じであるが、ＣａＣｌ２ ２Ｈ２Ｏ（０．１４３ｇ／Ｌ）を含む、ｐＨ７．２；（４）ＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡを含む緩衝性生理食塩水：ＨＥＰＥＳ １．００ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ８．０１ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．１９５ｇ／Ｌ、デキストロース １．０１ｇ／Ｌ、Ｎａ２ ＥＤＴＡ ０．３７３ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４。ウサギ血小板の調製：プラスチック容器やシリコン処理したガラス製容器が全ての血小板の調製と刺激実験に用いられた。洗浄されたウサギの血小板は、スガタニらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２巻、５７４０頁、１９８７年）を一部修正して調製した。それぞれ４５ｍＬ分のウサギ血液を、５ｍＬの４１ｍＭクエン酸−８５ｍＭクエン酸三ナトリウム−２％グルコース溶液中で加え、１７０ｇで１０分間遠心分離した。血小板が豊富な血漿である上清多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）は、１０ｍＬのフィコール−ハイパーク液で下層にし、７５０ｇで２０分間遠心分離した。血小板層は、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ４０ｍＬのＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７．２）と穏やかに混合し、０．２ｍＬのフィコール−ハイパーク液に重層し、７５０ｇで、１０分間遠心分離した。再び、血小板層を０．１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ４０ｍＬのＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７．２）で懸濁し、７５０ｇで１０分間遠心分離した。血球は、０．１ｍＭＥＤＴＡを含んだタイロード／ゼラチン（ｐＨ６．５）で、１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。１−２．試験方法（血小板凝集試験）血小板（１×１０８ｃｅｌｌｓ，４００μＬ）は、１ｍＭ Ｃａ２＋を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液中で刺激を受け、活性化される。凝集活性は、凝集測定器（Ｎｉｋｋｏ Ｈｅｍａｔｒａｃｅｒ，ＰＡＴ−２Ａ）を使って、光透過の変化として測定される。０．０５％エタノール−０．００５％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解させたウリジン５’−アルキルホスフェートや生理食塩水に溶解させたベラパミルは、特に示さない場合は、ＰＡＦ等の刺激剤を添加する１分前に、反応系に添加される。ただし、グアノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＧＴＰγＳ）により誘発される血小板凝集に対する試験では、膜非透過性であるＧＴＰγＳを効果的に血小板サイトゾルの中へ送達させるために、血小板をサポニン（３．３μｇ／ｍＬ）と１分間インキュベートし、予め血小板の膜透過性を高めておいた。血小板凝集阻害の割合は、［（コントロール反応−阻害反応）／コントロール反応］×１００で計算する。ＩＣ５０は、添加量−反応量曲線の回帰分析によって得られる。（［３Ｈ］ａｃｅｔｙｌ−ＰＡＦとの結合性）０．１％のＢＳＡおよび１ｍＭのＣａ２＋を含有するタイロード−ゼラチン緩衝液（ｐＨ７．２）中で、血小板（２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をＵＭＰＣ１６（１×１０−５Ｍ）と１分間インキュベートした後、３７℃で［３Ｈ］ａｃｅｔｙｌ−ＰＡＦ（１×１０−９Ｍ）を添加した。結合試験は、ポリプロピレンチューブ中で行った。３分間インキュベーションした後、４００μＬの血小板を取り出し、５０μＬのジブチルフタレート／ジオクチルフタレート混液（３：１、Ｖ／Ｖ）を積層し、遠心分離（１０，０００×ｇ、６０秒）により懸濁培地から分離した。続いて、４００μＬの０．１％ＢＳＡ／生理食塩液で洗浄した。血小板ペレットは、３００μＬの１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００液に再懸濁し、血小板結合放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。特異的結合は、１０００倍量の過剰の非ラベルＰＡＦの存在下、または非存在下における［３Ｈ］ａｃｅｔｙｌ−ＰＡＦ結合との差として計算した。（サイトゾル中の遊離カルシウム濃度の測定）０．１ｍＭのＥＤＴＡを含んだＨＥＰＥＳ−緩衝性生理食塩水（ｐＨ７．４）中に懸濁したウサギ血小板（１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）は、１×１０−６Ｍのフラ２−アセトキシメチルエステルと、３７℃４５分間インキュベートして細胞内に取り込ませ、細胞外色素を取り除くために１度洗浄した。０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ６．５）で１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度となるように再懸濁した。この血小板懸濁液（０．４８ｍＬ）を、丸底試験管に分取し、外液中のＣａ２＋（［Ｃａ２＋］０）濃度が１ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加した。その後、これらのサンプルは、特注のキュベットホルダーに移し、記録計を備えた日本分光（東京、日本）蛍光分光光度計ＣＡＦ−１００中に設置し、３７℃に保温した。試験管内の磁石を回転させ、絶えず細胞を攪拌した。少なくとも５分間３７℃に保った後、細胞は、０．０１ｍＭの前述した濃度のウリジン５’−アルキルホスフェートで１分間、次いで、０．０１ｍＬの前述した濃度の凝集惹起物質を添加することにより、活性化した。フラ２蛍光は、３４０ｎｍ（Ｆ３４０）と３８０ｎｍ（Ｆ３８０）（それぞれ誤差±５ｎｍ］）の励起波長で連続的に測定した。［Ｃａ２＋］ｉの測定は、相当する発光シグナル（５００±１０ｎｍ）を、Ｒ３４０／３８０と表す比シグナル（Ｆ３４０／Ｆ３８０）と同様に計測した。細胞内Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２−］ｉは、次の式から算出できる（Ｇ．Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０巻、３４４０頁、１９８５年）。［Ｃａ２＋］ｉ＝Ｋｄ×Ｂ×［（Ｒ−Ｒｍｉｎ）／（Ｒｍａｘ−Ｒ）］ただし、Ｋｄ：Ｃａ２＋に対するフラ２の解離定数で、ｉｎ ｖｉｖｏでは２２４ｎＭと仮定する式から算出できる（Ｇ．Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０巻、３４４０頁、１９８５年）； Ｂ：Ｃａ２＋を含んだ溶液中でのＦ３８０に対するＣａ２＋を含まない溶液中でのＦ３８０の割合；Ｒ：Ｆ３４０／Ｆ３８０で表される蛍光比； Ｒｍａｘ：２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．０１ｍＬ添加し、細胞を溶解したときの細胞内フラ２による最大発光シグナル値； Ｒｍｉｎ：Ｒｍａｘの測定後、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／４５０ｍＭ ＥＧＴＡを０．０１ｍＬ添加し、Ｃａ２＋を除去したときの発光シグナル値。いずれの実験も、それぞれの阻害剤について３〜４回測定した。また、血小板反応蛍光、色素の漏れおよび蛍光標識の影響を最小限に止めるために、実験を１時間以内に完了するように設定した。データ表示：表や図に示した結果は、調整した血小板を分離して用い、少なくとも２回行った実験を表し、特別の場合を除き、複数回の平均値（±平均の範囲）を提供している。２．試験結果２−１．血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果ＰＡＦに対する血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の投与量に依存的な効果を、図１に示す。すなわち、図１は、血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図であって、Ａは凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の異なった濃度における効果を示し、Ｂは血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６とパルミチン酸の投与量依存的効果の比較を示し、Ｃは種々の濃度のＰＡＦによる血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性を示す。図１のＡにおけるａ〜ｆは、次の実験条件を示す。すなわち、１ｍＭ ＣａＣｌ２を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７．２）中の洗浄ウサギ血小板（１×１０８ｃｅｌｌｓ，０．３８ｍＬ）を、２．０％エタノール−２．０％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＵＭＰＣ１６（指示された濃度）（１０μＬ）と、１分間プレインキュベートし（ａ）、その後０．１％ＢＳＡを含んだ生理食塩水に溶解したＰＡＦ（１０μＬ）（最終濃度８×１０−１１Ｍ）に、２分間（ＰＡＦ刺激により最大反応が得られる時間）、暴露した（ｂ）。血小板凝集の阻害率を上記の方法により計算し、結果を複数個の平均値で示した（±平均値の範囲）。ｃは媒介物のみ、ｄは６×１０−６Ｍ、ｅは８×１０−６Ｍ、ｆは１×１０−５Ｍの場合を示す。図１のＡに示すように、ＵＭＰＣ１６は、８×１０−１１Ｍ ＰＡＦによる血小板の形態、変化を抑制しなかったが、血小板凝集を阻害した。ＵＭＰＣ１６による凝集阻害は、ＵＭＰＣ１６とＰＡＦの濃度に依存した（図１のＢとＣ参照）。一方、１〜１０μＭ濃度のパルミチン酸（ＵＭＰＣ１６のアルキルの一部から成る）は、ＰＡＦによる血小板凝集を抑制しなかった（図１のＢ）。２−２．血小板凝集を惹起するＰＡＦ、トロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰ、Ａ２３１８７およびＰＭＡに対するＵＭＰＣ１６の効果ＵＭＰＣ１６による血小板凝集阻害は、ＰＡＦに対してのみ惹起されるのか検討するために、種々の凝集惹起物質に対するＵＭＰＣ１６の効果を試験した。すなわち、２−１（図１）の場合と同様に、血小板（１×１０８ ｃｅｌｌｓ，０．３８ｍＬ）を１分間ＵＭＰＣ１６とプレインキュベートし、その後凝集惹起物質（１０μＬ）、すなわち０．１％ＢＳＡを含んだ生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０−１１Ｍ）、生理食塩水に溶解したトロンビン（最終濃度０．０２Ｕ／ｍＬ）、４％エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したアラキドン酸（最終濃度２×１０−５Ｍ）、生理食塩水に溶解したＡＤＰ（最終濃度２．５×１０−５Ｍ）、４％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＡ２３１８７（最終濃度２×１０−７Ｍ）および４％エタノールを含んだ生理食塩水に溶解したＰＭＡ（最終濃度２×１０−８Ｍ）に、それぞれ２分、４分、２分、２分、４分および３０分間（媒介物の存在下、凝集惹起物質で刺激することにより最大反応が得られる時間）、暴露した。血小板凝集の阻害率は、上記方法で計算し、結果を複数個の平均値で、図２に示した（±平均値の範囲）。図２から明らかなように、血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰは、血小板凝集を惹起するＰＡＦと同様にＵＭＰＣ１６により明らかに抑制された。阻害の強さは、凝集惹起物質とＵＭＰＣ１６の濃度に依存した。凝集を惹起するＰＡＦ（８×１０−１１Ｍ）、トロンビン（０．０２Ｕ／ｍＬ）、アラキドン酸（２×１０−５Ｍ）およびＡＤＰ（２．５×１０−５Ｍ）に対するＩＣ５０値は、それぞれ２．４×１０−６Ｍ、５．４×１０−６Ｍ、２．１×１０−６Ｍおよび２．２×１０−６Ｍであった（データを示さず）。反対に、２×１０−８Ｍから２×１０−７Ｍの濃度のＡ２３１８７による血小板凝集と、２×１０−９Ｍから２×１０−７Ｍの濃度のＰＭＡによる血小板凝集は、１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６により阻害されなかった。これらの結果は、ＵＭＰＣ１６がＰＡＦの刺激のみならず、受容体を介した刺激を阻害するが、Ａ２３１８７により惹起される細胞外カルシウムの流入や、プロテインキナーゼＣ経路の活性化には影響を及ぼさなかったことを示している。また、ＵＭＰＣ１６の濃度依存効果を図３に示す。実験の結果、ＵＭＰＣ１６は、ＰＡＦ、トロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰおよびＧＴＰγＳにより誘導される血小板凝集を濃度依存的に阻害することが明らかとなった。なお、ＧＴＰγＳ（最終濃度２×１０−５Ｍ）により誘発される血小板凝集に対する試験では、膜非透過性であるＧＴＰγＳを効果的に血小板サイトゾルの中へ送達させるために、ＵＭＰＣ１６（最終濃度１×１０−５Ｍ）でプレインキュベートされた後、サポニン（３．３μｇ／ｍＬ）と１分間インキュベートされ、予め血小板の膜透過性を高めた。図３のａ〜ｃは、それぞれ、指示された濃度のＵＭＰＣ１６とのプレインキュベート（ａ）、サボニンとのインキュベート（ｂ）（ＧＴＰγＳ実験のみ）、および各種アゴニストの曝露（ｃ）を示す。また、（ ）内の数字は、ＵＭＰＣ１６の相対濃度を示す。すなわち、（ｏ）は、媒介物のみのデータを表している。２−３．血小板凝集を誘発するＰＡＦとトロンビンに対するヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）の阻害効果各種ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）、すなわちＵＭＰＣ８、ＵＭＰＣ１２、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０、ＵＭＰＣ２４およびＡＭＰＣ１６の血小板凝集阻害作用を調べた。すなわち、２．０％エタノール−２．０％ジメチルスルホキシドを含む生理食塩水に溶解した所定濃度のＵＭＰＣ８、ＵＭＰＣ１２、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０、ＵＭＰＣ２４またはＡＭＰＣ１６（１０μＬ）を、１ｍＭ ＣａＣｌ２含有タイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７．２）中の血小板（１×１０８ ｃｅｌｌｓ，０．３８ｍＬ）に１分間暴露し、その後０．１％ＢＳＡを含む生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０−１１Ｍ）（Ａ）または生理食塩水に溶解したトロンビン（最終濃度０．０２Ｕ／ｍＬ）（Ｂ）に、それぞれ２分または４分間暴露する。血小板凝集の阻害率を、上記した方法により計算し、結果を図４に複数個の平均値で示した（±平均値の範囲）。図４のＡやＢから明らかなように、これらのヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）はＰＡＦやトロンビンによる血小板凝集に影響を及ぼす。極頭基のメチレン鎖の長さを引き延ばしたＣ１６やＣ２０を含むヌクレオシド５’−アルキルホスフェート類は、血小板凝集を惹起するＰＡＦをＰＡＦ刺激に対する阻害が報告（Ｋ．Ｄ．Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６１巻、３９５頁、１９７８年；Ｔ．Ｃ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２３巻、３３頁、１９８３年；Ｆ．Ｈ．Ｖａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ，Ｒｅｓ．，４０巻、３８５頁、１９８５年）されているカルシウムチャネル阻害剤であるベラパミルより強く阻害した。つまり、１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６と１×１０−５Ｍのベラパミルは、それぞれ対照試験に対し、８×１０−１１Ｍ ＰＡＦによる凝集を０％および１９％抑制した。８×１０−１１Ｍ ＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の凝集阻害のＩＣ５０値（２．４×１０−６Ｍ）は、ＵＭＰＣ２０のＩＣ５０値（２．２×１０−６Ｍ）と同程度であった。さらに、ＵＭＰＣ１６とＵＭＰＣ２０は、ＰＡＦだけでなく、トロンビンの凝集も同様に抑制した。また、ＡＭＰＣ１６は、８×１０−１１ＭのＰＡＦで誘発される血小板凝集を阻害した（ＩＣ５０値：８．７×１０−６Ｍ）。２−４．凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の阻害作用の特徴次に、ＵＭＰＣ１６により惹起された血小板凝集阻害が、ベラパミルで見られたのと同様に、補足のカルシウムにより元に戻るかどうかを調べた。すなわち、１ｍＭ又は１０ｍＭのＣａＣｌ２を含んだタイロード／ゼラチン緩衝液（ｐＨ７．２）中の血小板（１×１０８ｃｅｌｌｓ，０．３８ｍＬ）を、２．０％エタノール−２．０％ジメチルスルホキシドを含んだ生理食塩水に溶解したＵＭＰＣ１６（最終濃度１×１０−５Ｍ）（１０μＬ）と１分間プレインキュベーションした後、０．１％ＢＳＡを含む生理食塩水に溶解したＰＡＦ（最終濃度８×１０−１１Ｍ）に２分間暴露した。血小板凝集の阻害率は、上記した方法により計算し、結果を図５に複数個の平均値として示した（±平均値の範囲）。図５から理解できるように、血小板の懸濁液中で、１ｍＭから１０ｍＭの範囲でカルシウム濃度を増加させたところ、ＰＡＦの凝集惹起に対するＵＭＰＣ１６による阻害は元に戻らなかった。逆に、補足ＣａＣｌ２濃度を１０ｍＭにするとＰＡＦによる血小板凝集誘発の程度は、７２％に減少した。さらに、ＵＭＰＣ１６は、ＰＡＦの添加後でも効果があるのか調べるために、血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の添加時間の影響を試験した。すなわち、ＵＭＰＣ１６または対照試験用の溶媒を、８×１０−８ＭのＰＡＦ添加前後の指定された時間に血小板に添加し、血小板凝集の阻害率を上記方法により計算し、結果を図６に複数個の平均値として示した（±平均値の範囲）。８×１０−１１ＭのＰＡＦを添加する前に１分間１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６とインキュベートしただけでなく、８×１０−１１ＭのＰＡＦと同時に１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６を添加した場合も、ＰＡＦによる凝集が１００％阻害された。一方、ＵＭＰＣ１６をＰＡＦの添加後１０秒、３０秒および１分経過した後の血小板に添加すると、血小板凝集は、それぞれ、対照試験に対し２９％、４２％および７５％程度となった（図６）。これらの所見は、ＵＭＰＣ１６がベラパミル同様に脱凝集を引き起こし、ＰＡＦより後に添加した場合でさえ、ＰＡＦ刺激に対する阻害効果があったことを示している。２−５．受容体を介した血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性の特徴カルシウム拮抗剤であるエコナゾールによるカルシウム流入阻害は、０．３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを添加することにより復元することが知られている。そこで、血小板凝集を誘発するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の阻害活性に対するＢＳＡの作用について検討した。１ｍＭの塩化カルシウムを含有するタイロード−ゼラチン緩衝液（ｐＨ７．２）中のウサギ血小板（２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をＵＭＰＣ１６（１×１０−５Ｍ）と１分間プレインキュベートした後、ＰＡＦ（１×１０−９Ｍ）を加えて２分間インキュベートし、生理食塩液に溶解させたＢＳＡ（最終濃度０．３％（ｗ／ｖ））または生理食塩液を血小板に添加した。３分後、ＵＭＰＣ１６を添加しなかったものと添加したものとの血小板凝集の程度は、それぞれ５８．３±６．５％、１２．５±６．５％であった。この結果は、ＵＭＰＣ１６によるＰＡＦの阻害は、０．３％ＢＳＡの添加により復元しないということを示している。また、血小板懸濁液中のＣａ２＋濃度を１から１０ｍＭにまで上昇させても、ＵＭＰＣ１６による血小板凝集を誘発するＰＡＦの阻害は復元しなかった。このことは、ＵＭＰＣ１６がカルシウムキレート作用を有しないことを示している。一方、血小板（２．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６と１０秒、３０秒、１分および２分間ブレインキュベートした後１×１０−９ＭのＰＡＦを添加すると、血小板凝集はコントロールに比較して、それぞれ８５．７±１４．３％、５６．０±１５．５％４７．６±４．７％及び１７．９±２．１％であった（図７）。これらの所見は、ＵＭＰＣ１６による阻害活性の強さは血小板との反応時間に依存することを示している。ＵＭＰＣ１６がアゴニストと受容体の結合を阻害しているかどうかを調査するために、血小板に結合する［３Ｈ］ａｃｅｔｙｌ−ＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の作用を検査した。ＰＡＦは、ウサギ血小板と特異的あるいは非特異的に結合する。ＰＡＦの特異的結合は、ＵＭＰＣ１６により有意に阻害されない。１×１０−９ＭのＰＡＦの特異的結合は、１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６の非存在下および存在下でそれぞれ１．９±０．９および１．５±０．２ｆｍｏｌ／１０８ｃｅｌｌｓであり、ＰＡＦの非特異的結合は、１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６の非存在下および存在下でそれぞれ９．４±１．４及び８．３±０．３ｆｍｏｌ／１０８ｃｅｌｌｓであった。２−６．［Ｃａ２＋］ｉ反応を誘発するＰＡＦ、トロンビン、ＡＤＰおよびイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の作用［Ｃａ２＋］ｉ反応を誘発するアゴニストに対するＵＭＰＣ１６の作用を調べるため、ＵＭＰＣ１６や溶媒を３７℃の温水中で、直接血小板と１分間、ブレインキュベーションした。最大反応は、溶媒の存在下で、ＰＡＦの刺激により測定した。添加を指示したのは、溶媒（ａ）、ＰＡＦ（ｂ、８×１０−１１Ｍ）、ＵＭＰＣ１６（ｃ、１×１０−５Ｍ）、０．０５Ｕ／ｍＬのトロンビン、２．５×１０−５ＭのＡＤＰおよびイオノマイシン（ｄ、４×１−８Ｍ）を添加した。結果は、少なくとも４回行った実験の代表例を、図８に示す。各図において、Ａは媒介物のみ、ＢはＵＭＰＣ１６添加のデータを示す。また、ａ〜ｃは、それぞれ、媒介物とのプレインキュベート（ａ）、指示された濃度のＵＭＰＣ１６とのプレインキュベート（ｂ）、および各種アゴニストの曝露（ｃ）を示す。その結果、ＵＭＰＣ１６は、ＰＡＦ、トロンビン、およびＡＤＰによる［Ｃａ２＋］ｉを阻害した。血小板内カルシウム濃度を変化させるＰＡＦやトロンビン、ＡＤＰ、イオノマイシンに対するベラパミルとＵＭＰＣ類の効果を比較した。すなわち、血小板（１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、溶媒、ベラパミル（最終濃度１×１０−１Ｍ）またはＵＭＰＣ類（最終濃度１×１０−５Ｍ）と、上記２．４（図６）に記載したように、１分間、インキュベート、処理した後、ＰＡＦ（最終濃度４×１０−１１Ｍ）やトロンビン（最終濃度０．０５Ｕ／ｍＬ）、ＡＤＰ（最終濃度２．５×１０−５Ｍ）、イオノマイシン（最終濃度４×１０−８Ｍまたは１．６×１０−７Ｍ）に暴露した。最大［Ｃａ２＋］ｉレベルは、上記したように、フラ−２蛍光で測定した。結果は、４−６回行った測定結果の平均値±ＳＤとして表１に示す。その結果、ＰＡＦ、トロンビンおよびＡＤＰにより誘発される［Ｃａ２＋］ｉ増加は、１×１０−５ＭのＵＭＰＣ１６により阻害（コントロールに比較してそれぞれ６５％、３４％、７８％）された。この結果から、ＵＭＰＣ１６は、［Ｃａ２＋］ｉを誘発するＰＡＦ、トロンビンおよびＡＤＰの作用を減弱させるが、［Ｃａ２＋］ｉを誘発するイオノマイシンの作用を減弱させないことが理解できる（図８、表１）。ＵＭＰＣ１６による受容体を介する［Ｃａ２＋］ｉの阻害は１００％ではなかったが（図８、表１）、血小板凝集の阻害は１００％であった。このことはＵＭＰＣ１６による［Ｃａ２＋］ｉ応答の阻害が、受容体を介するＣａ２＋流入を阻害することにより起こったことを示している。１ｍＭの細胞外カルシウムの存在下において、未刺激血小板の平均［Ｃａ２＋］ｉが５２．０±１８．４ｎＭ（ｎ＝１５）であり、ＵＭＰＣ１６はこの値を変化させなかった。８×１０−１１ＭのＰＡＦを添加すると、血小板［Ｃａ２＋］ｉは４７４．７±７４．２ｎＭに上昇するが、ＵＭＰＣ１６は、このＰＡＦによる［Ｃａ２＋］ｉの上昇を減弱させた。ＵＭＰＣ１６による［Ｃａ２＋］ｉ反応の阻害の程度は、ベラパミルによるものより高かったが（表１）、血小板凝集阻害の様式は、よく似ていた。３．試験結果の解析上記試験結果は、ＵＭＰＣ１６が、ＰＡＦだけでなく、血小板凝集を惹起するトロンビン、アラキドン酸およびＡＤＰをも投与量依存的に直接阻害し、その阻害は血小板活性化を惹起するＰＡＦに限局したものでないことを示している（図１および２）。ＵＭＰＣ化合物のうち、ＵＭＰＣ１６は、血小板活性化に対する阻害効果がＵＭＰＣ８やＵＭＰＣ１２よりも強い。また、ＡＭＰＣ１６も血小板凝集阻害活性を示した（図３）。アラキドン酸は、ホスホリパーゼＣ経路の活性を誘発すると考えられているエンドペルオキシドやトロンボキサンＡ２を経てシクロオキシゲナーゼやトロンボキサンＡ２シンテターゼにより代謝される。ＰＡＦ、トロンビン、トロンボキサンＡ２およびＡＤＰによる刺激は、受容体を介して伝達され、４０−ｋＤａのタンパク質リン酸化を惹起する、プロテインキナーゼＣシステムと関連しているホスホリパーゼＣの活性化を誘発する。ＵＭＰＣ１６は、これら受容体を介した刺激による血小板凝集や、［Ｃａ２＋］ｉの変化を誘発するＰＡＦの作用を阻害した（図２と８および表１）。血小板懸濁液中のカルシウム濃度の増加は、ＵＭＰＣ１６のＰＡＦに対する凝集誘発の阻害を回復させず（図５）、これは、ベラパミルの活性様式とは相違する。他の所見は、好中球におけるベラパミルの阻害効果が、単にカルシウムの流入を阻害するためだけでなく、ベラパミルにより活性化されたプロテインキナーゼＣ酵素に対する直接的な阻害活性もまたあるということを示している。一方、ＵＭＰＣ１６は、カルシウムイオン透過担体であり、血小板凝集を惹起するＡ２３１８７や［Ｃａ２＋］ｉを変化させるイオノマイシンの作用を阻害しなかった（図２と８）。さらに、ＵＭＰＣ１６は、血小板凝集を惹起するＰＭＡを阻害しなかった（図２）。一方、ＵＭＰＣ１６は、血小板凝集を誘発するＧＴＰγＳを阻害した（図３）。グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）は、受容体と膜イオンチャネルの活性を含む関連反応をつなぐと考えられている。したがって、ＵＭＰＣ１６が、Ｇタンパク質受容体とつながっているＣａ２＋チャネルに拮抗することが明らかになった。ＰＭＡは、血小板において、４０ｋＤａのタンパク質をリン酸化するプロテインキナーゼＣを直接活性化させ、細胞外Ｃａ２＋を必要としない。図６で示したように、あらかじめＰＡＦで凝集された血小板に添加したとき、１×１０−５Ｍの濃度のＵＭＰＣ１６は、凝集を阻害できる。すなわち、脱凝集を引き起こす。ベラパミルは、４０−ｋＤａや２０−ｋＤａのタンパク質のリン酸化を元に戻すことにより、ＰＡＦで凝集した血小板に脱凝集を引き起こすと報告されてきた（Ｇ．Ｂｏｎａｄｏｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅａｍｏｓ．，５６巻、３０８頁、１９８６年）。我々は、ウサギ血小板に結合するＰＡＦの動態についての研究で、ＰＡＦにより完全に凝集された血小板は、受容体に対するＰＡＦの量が減少すると同時に、脱凝集が見られる、つまり、血小板凝集を維持するために、受容体にＰＡＦの結合が必要であるということを示していることを解明している。以上、ＵＭＰＣ１６の活性様式は、受容体に特異的に結合する凝集惹起物質を介するカルシウム流入を阻害したり、カルシウムチャンネル阻害剤であるベラパミルと同様に、凝集惹起物質の結合を阻害することによるものであると考えることが出来る。なお、細胞内カルシウムに依存する反応の阻害は、血小板反応に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性に影響を与える可能性が考えられる。結論として、ＵＭＰＣ１６は、血小板反応を介する受容体をベラパミルより効果的に阻害するということができる。ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物は、アゴニスト（ＰＡＦ、トロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰ、ＧＴＰγＳ）の血小板受容体への結合を阻害しなかった。よって、ＵＭＰＣ１６は、受容体に拮抗しないことがわかる。また、培地中のカルシウム濃度を上昇させても、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物のＰＡＦ阻害作用は復元しなかった。よって、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物は、カルシウムキレート作用は有しない。ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物は、受容体を介した細胞内カルシウム濃度増加を１００％阻害しなかったが、血小板凝集は１００％阻害したことから、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物は、受容体作動性のカルシウムチャネルを阻害していることが明らかとなった。さらに、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物は、イオノマイシンおよびＡ２３１８７を阻害せず、ＰＡＦ、トロンビン、アラキドン酸、ＡＤＰ、ＧＴＰγＳによる細胞内カルシウム濃度上昇を阻害した。よって、カルシウムチャネル阻害剤であることが判った。また、ＰＡＦ、トロンビン、ＧＴＰγＳを阻害することから、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物はＧタンパク質共役型受容体作動性カルシウムチャネルに拮抗していることがわかった。ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物のＰＡＦ阻害作用の強さは、添加時間に依存しており、ＰＡＦ添加の前にＵＭＰＣ１６を添加した方が、阻害作用は強かった。ＢＳＡの添加により血小板凝集阻害が元に戻らないことより、エコナゾールとは作用機序が異なっていると思われる。また、培地中のカルシウム濃度上昇により血小板凝集阻害が元に戻らないことより、ベラパミルとは作用機序が異なっていると思われる。以上記載したごとく、本発明のヌクレオシド５’−アルキルホスフェート化合物（Ｉ）は、カルシウム拮抗作用を有し、特に細胞外液カルシウムの細胞内流入阻止に基づくカルシウム拮抗作用を有することから、心筋障害や不整脈発生の防止に有効であり、また優れた血小板凝集抑制作用を有することから、血栓症、塞栓症または動脈硬化症の予防薬または治療薬として有用である。【図面の簡単な説明】図１は、後に記載する試験例における血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。Ａは凝集を誘発するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６の異なった濃度における効果を示し、Ｂは血小板凝集を惹起するＰＡＦに対するＵＭＰＣ１６とパルミチン酸の投与量依存的効果を示し、Ｃは種々の濃度のＰＡＦによる血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の阻害活性を示す。図２は、血小板凝集を惹起する凝集惹起物質に対するＵＭＰＣ１６の阻害効果を示す図である。図３は、種々のアゴニストに誘導された血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。ａはＵＭＰＣ１６の添加時、ｂはサポニン添加時（ＧＴＰγＳ実験のみ）、ｃは各アゴニストの添加時を示す。図４は、血小板凝集惹起剤に対するヌクレオジド５’−アルキルホスフェート類の阻害効果を示す図である。Ａは惹起剤がＰＡＦの場合のもの、Ｂは惹起剤がトロンビンの場合のものである。図５は、血小板凝集を惹起するＰＡＦのＵＭＰＣ１６による阻害活性に対する細胞外カルシウムの効果を示す図である。図６は、血小板凝集を惹起するＰＡＦに対し、様々な時間にＵＭＰＣ１６を添加したときの効果を示す図である。図７は、ＰＡＦに誘導される血小板凝集に対するＵＭＰＣ１６のプレインキュベーションが及ぼす影響を示す図である。図８は、血小板内カルシウム濃度を変化させるＰＡＦ、トロンビン、ＡＤＰおよびイオノマイシンに対するＵＭＰＣ１６の効果を示す図である。 式Ｉ:（式中、Ｒは炭素数１６の直鎖または分岐鎖状アルキル基を示し、Ｂはアデノシンを示す。）で表されるアデノシン５’−アルキルホスフェート化合物を有効成分とするカルシウム拮抗剤。 アデノシン５’−アルキルホスフェート化合物が遊離形、または水和物および塩から選択される生体内で遊離形を与え得る医薬的に許容される形で使用される、請求項１記載のカルシウム拮抗剤。 血小板凝集抑制剤として使用される、請求項１または２記載のカルシウム拮抗剤。