生命科学関連特許情報

タイトル:再公表特許(A1)_ビオプテリン類の製造方法
出願番号:2001007395
年次:2004
IPC分類:7,C12N15/09,C07D487/04,C12N1/15,C12N1/19,C12N1/21,C12N5/10,C12P17/18


特許情報キャッシュ

藪田 雅之 古川 和明 宮本 伸江 山本 克彦 大末 和廣 JP WO2002018587 20020307 JP2001007395 20010828 ビオプテリン類の製造方法 第一サントリーファーマ株式会社 503062312 岩谷 龍 100077012 藪田 雅之 古川 和明 宮本 伸江 山本 克彦 大末 和廣 JP 2000262973 20000831 7 C12N15/09 C07D487/04 C12N1/15 C12N1/19 C12N1/21 C12N5/10 C12P17/18 C12N1/21 C12R1:19 C12N1/21 C12R1:125 C12P17/18 C12R1:19 C12P17/18 C12R1:125 JP C12N15/00 A C07D487/04 147 C12N1/15 C12N1/19 C12N1/21 C12P17/18 B C12N5/00 A C12N1/21 C12R1:19 C12N1/21 C12R1:125 C12P17/18 B C12R1:19 C12P17/18 B C12R1:125 AP(GH,GM,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,CH,CY,DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,CA,CN,CO,CR,CU,CZ,DM,DZ,EC,EE,GD,GE,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KG,KR,KZ,LC,LK,LR,LT,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MX,NO,NZ,PH,PL,RO,RU,SG,SI,SK,TJ,TM,TT,UA,US,UZ,VN,YU,ZA 再公表特許(A1) 20040115 2002522494 66 技術分野本発明は、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる1つ以上の酵素の遺伝子を導入した形質転換細胞、およびそれを用いたビオプテリン類の製造方法に関する。背景技術本明細書においては、テトラヒドロビオプテリン(L−erythro−5,6,7,8−tetrahydrobiopterin:以下、THBPと略す)、7,8−ジヒドロビオプテリン(L−erythro−7,8−dihydrobiopterin:以下DHBPと略す)もしくはビオプテリン(Biopterin:BPと略す)、またはこれらの任意の2以上の組み合わせを総称してビオプテリン類とする。THBPは、動物において広く分布している生体物質であり、1963年にKaufmanにより、ラット肝のフェニルアラニン水酸化酵素の補酵素であることが明らかにされた。その後、THBPはチロシン水酸化酵素およびトリプトファン水酸化酵素に対して共通に働く補酵素であることも明らかにされ、神経伝達物質の生合成に関わる重要な役割を果たすことが明らかとなった。また近年、一酸化窒素(NO)合成酵素の補酵素としての機能も見出され、多様な生体物質の生合成系酵素の補酵素となることが注目されている。ヒトにおいて、THBPの欠損は上記のアミノ酸水酸化酵素の活性低下をもたらし、異型高フェニルケトン尿症および異型高フェニルアラニン血症を引き起こすことが知られており、THBPはこの先天性代謝異常疾患の治療に塩酸サプロプテリンとして用いられている。動物においてTHBPは、第1図に示すように、グアノシン3リン酸(以下、GTPと略す)から、GTPシクロヒドラーゼI(以下、GCHと略す)、6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素(以下、PTPSと略す)およびセピアプテリン還元酵素(以下、SPRと略す)の3段階の酵素反応により生合成されることが知られている。一方、動物以外では、ショウジョウバエ(Weisberg,E.P.and O’Donnell,J.M.J.Biol.Chem.261:1453−1458,1996)、カイコ(Iino,T.,Sawada,H.,Tsusue,M.and Takikawa,S.−I.Biochim.Biophys.Acta 1297:191−199,1996)、Euglena gracilis、Neurospora crassaおよびPhycomyces blakesleeanusなどの真核微生物(Maier J.,Ninnemann H.Photochamistry and Photobiology 61:43−53,1995)、ならびに原核微生物であるNocardia sp(Son JK,Rosazza JP.J Bacteriol.182:3644−3648,2000)においてその存在が報告されている。このように、THBPの存在が報告されている生物の種類は多いが、特に微生物については進化上、動物とは大きく隔たりがあることから、微生物全般が有している生体物質ではないと考えられる。THBPは、分子内に3つの不斉炭素を有するため化学合成が困難な化合物であり、その主な合成法としては、ラムノースやデオキシアラビノースを出発原料としてL−エリスロ−ビオプテリン(BP)を合成した後、これを化学的に不斉還元することにより合成する方法が知られている。しかし、これらの化学合成法は反応工程が多く、その反応工程の中には反応の収率が低いプロセスもある。また、出発原料であるラムノースやデオキシアラビノースが高価であることなどの問題点があり、操作性、収率、コスト面等において有利な製造方法とは言い難い。これに対し鏡山らは、酵素反応によるTHBP合成に取り組み、THBP合成に関わる3種類の酵素をそれぞれ精製後、これら3種類の酵素を使用し、GTPおよびニコチンアミドジヌクレオチドリン酸還元型(以下、NADPHと略す)を含んだ1つの反応槽の中でTHBPを合成させることに成功している(特開平4−82888号)。しかし、この方法を用いて1kgのTHBPを得るには、3.12kgのGTPと92kgのNADPHが必要となる。これらの原料が非常に高価であること、また3種類の酵素の精製を含めた操作は非常に煩雑となることを考慮すると、該方法を用いたビオプテリン類の工業的生産は、コスト面および操作面において困難である。一方、白石らはCandida属酵母(Candida noveiius、Candida rugosa,Candida robsta等)や、いくつかのMucor属糸状菌(Mucor javanicus、Mucor alternns、Mucor subtilissimus等)が、THBPの酸化物であるL−エリスロ−ビオプテリン(BP)を培地へ蓄積することを見出し、この性質を利用して培養液からBPを生産する方法を報告している(特開昭61−9296、特公平5−33990)。BPは化学的な還元によりTHBPへの変換が可能であるため、微生物にBPを生産させた後THBPへと変換する方法は、高価なGTPやNADPHを必要としない上、合成ステップが大幅に削減されることから、操作面においては工業上有利な製造方法であるといえる。しかし、いずれの菌株においても、BP生産量が低く、培養液1L当たりのBP生産量は1mg以下であり、収率およびコスト面からは工業的に有利な製造方法とはいえない。したがって、上記のように有用なTHBPは、従来工業的に有利な製造方法がないゆえに、研究対象となりにくく、また医薬等として一般に供給されにくいため、その有用性が必ずしも十分に生かされていない。また下記するTHBPの酸化物であるDHBPやBPなどのビオプテリン類にも、同等もしくはそれ以上の薬理作用が期待されながら、十分にその作用が解明されていない。発明の開示本発明の目的は、ビオプテリン類を、遺伝子工学的手法を用いて安価な原料から大量に、工業的に有利に生産する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる1つ以上の酵素の遺伝子を導入した形質転換細胞、またはかかる形質転換細胞を作成するために用いるテトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる1つ以上の酵素の遺伝子を有する発現ベクターを提供することにある。本発明のさらに他の目的は、テトラヒドロビオプテリンの生産に有利な、野生型細胞のGTP合成能以上のGTP合成能をもつ遺伝子組換え細胞などの変異型宿主細胞、または野生型細胞が有する内在性のGCH活性以上のGCH活性を有する変異型宿主細胞もしくは形質転換細胞を提供することにある。本発明者らは、大量培養が可能な微生物などの宿主細胞にTHBPの生合成に関与する酵素の遺伝子を導入することで、本物質を安価でかつ大量に生合成させることを知見した。すなわち、THBP生合成の出発物質であるGTPは生物に普遍的に存在する生体物質であるため、動物あるいはそれ以外の生物が有するTHBP生合成系酵素の遺伝子を遺伝子組換え技術により宿主細胞に導入することで、本来THBPの生産能力のない宿主細胞もTHBPを生産できるようになることを知見し、そのような形質転換細胞の作製を鋭意検討した。しかし、その一方でTHBPの大量合成は宿主細胞にとって有害となることも考えられ、本方法によるTHBPの生産は困難であることも予測された。すなわち、THBPはプテリジン環を有する点で葉酸と構造が類似しているため、葉酸アナログの一種ともみなすことができる。実際に大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素は、THBPの酸化体である7,8−ジヒドロビオプテリン(DHBP)に作用し、DHBPからTHBPへの変換を行えることが報告されている(渡辺ら、生化学、第53巻第8号、p1008(1981))。葉酸は生体内において種々の炭素転移反応にあずかる補酵素であり細胞の生育に必須の物質であるため、THBPが細胞内で著量に合成された場合、葉酸が関与する酵素反応を阻害し、細胞の増殖阻害ひいては死滅を引き起こすことが予想された。さらに、THBP合成の中間物質である7,8−ジヒドロネオプテリン3リン酸から生成する7,8−ジヒドロネオプテリンはラジカルを形成すること(Oettl,K.ら,Biochem Biophys Res Commun.264:262−7,1999)、またはその酸化体であるネオプテリンは過酸化水素や亜硝酸と共存すると、過酸化水素や亜硝酸が有する細胞毒性をさらに増強することが報告されている(Wede,I.ら、Free Radic Res.1999 Nov;31(5):381−8)。従って、THBPを大量に生成させた場合、中間体として7,8−ジヒドロネオプテリン3リン酸が蓄積し、これが細胞内のフォスファターゼにより7,8−ジヒドロネオプテリンへと変換され、ラジカルを形成し細胞に傷害を与える可能性、および酸化されて生ずるネオプテリンが細胞内で発生する過酸化水素や亜硝酸と共存することにより、細胞毒性を示す可能性が考えられた。さらにはTHBPの大量合成は基質であるGTPと補酵素であるNADPHの細胞内プールを減少させ、増殖阻害を引き起こす可能性も懸念された。また、細胞内でTHBPの生合成に必要な酵素を高発現させた場合には細胞増殖阻害を起こすのではないかという問題も懸念された。さらに、細胞内で高生産されたTHBPが果たして効率よく培地へ移行するのか否かについては全く不明であった。本発明者らはこのような宿主細胞への毒性も考慮し、THBP合成に関わる酵素の遺伝子を、本来その合成能が無い大腸菌およびサッカロマイセス(Saccharomyces)酵母に導入し、ビオプテリン類生産能を調べた。その結果、作製されたこれらの形質転換細胞は懸念された増殖阻害を起こすことなく、ビオプテリン類を大量に生産し、培地中に該ビオプテリン類を効率よく移行させることができることを知見した。さらに検討を重ねて、THBP合成に関わる酵素の遺伝子を導入した形質転換細胞によるビオプテリン類の生産が可能であることを知見した。本発明者らは、さらに大腸菌を例にビオプテリン類の生産量を上昇させる検討を行った。まず始めに、THBP合成の出発物質はGTPであるので、野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能を有する宿主細胞(以下、GTP高合成能宿主細胞と略す。)の作製を検討した。GTPはプリン化合物の一種であるため、プリン生合成経路の調節変異株をスクリーニングすることにより、GTP合成能が増加した変異型宿主細胞の取得できることを知見した。このようなプリン合成の調節変異株は、枯草菌の場合、8−アザグアニンやデコイニンのようなプリンアナログに耐性を有する変異株の内から得ることができることが報告されているが(例えば、IshiiおよびShiio、Agric,Biol.Chem,36(9):1511−1522,1972;Matsuiら、Agric.Biol.Chem.43(8):1739−1744,1979)、大腸菌において、これらのプリンアナログがGTP高合成能宿主細胞の取得に有効かどうかは明らかとなっていなかった。本発明者らは、大腸菌においても8−アザグアニンやデコイニンのようなプリンアナログを用いたGTP高合成能宿主細胞の取得に成功した。さらに、かかるGTP合成能が増加したプリン合成の調節変異株を宿主細胞とした場合は、野生株を宿主細胞とした場合に対し約10倍のビオプテリン類生産能を持ち、さらDHBPも著量産生されるという驚くべき知見を得た。また、GTP高合成能宿主細胞の作製方法として、イノシン酸からグアニル酸への変換を行うIMPデヒドロゲナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を細胞に導入し、当該両酵素の活性を上昇させることを検討した。その結果、上述したプリン合成の調節変異株である大腸菌にguaBA遺伝子を導入し、かかる遺伝子組換え細胞を宿主細胞とすることにより、ビオプテリン類の生産が上記プリン合成の調節変異株に比べさらに増加するという知見も得た。本発明者らは、さらにビオプテリン類の生産性を高めるために鋭意検討した結果、THBP合成に関わる酵素の遺伝子を宿主細胞に複数回導入し発現量を上げたところ、ビオプテリン類生産能が向上することを知見した。特に、THBP合成の第1段階の反応を触媒する酵素であるGCH遺伝子を複数回宿主細胞に導入し、GCHの発現量を上げると、ビオプテリン類生産能が顕著に向上するという思いがけない知見を得た。GCH遺伝子を複数回宿主細胞に導入すると、ビオプテリン類生産能が顕著に向上するという上記知見に基づき、枯草菌のGCH遺伝子(mtrA遺伝子ともいう)を用いることを検討した結果、ビオプテリン類の生産量がさらに向上するという思いがけない知見も得た。以上のように、本発明はTHBP等のビオプテリン類の工業的に有利な製造方法、ならびにその製造に有用な形質転換細胞および宿主細胞を提供できる。本発明者らは、さらに検討を重ねて、本発明を完成した。すなわち、本発明は、(1)形質転換した細胞によりビオプテリン類を製造する方法であって、(a)テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子の少なくとも一つで宿主細胞を形質転換し、(b)得られた形質転換細胞を培養してテトラヒドロビオプテリンを生産し、(c)所望により、生産されたテトラヒドロビオプテリンを酸化し、(d)生産されたテトラヒドロビオプテリン、ならびに該テトラヒドロビオプテリンが酸化されたジヒドロビオプテリンおよびビオプテリンからなる群から選ばれる1種以上のビオプテリン類を採取することを特徴とするビオプテリン類の製造方法、(2)前記(1)に記載のビオプテリン類の製造方法において、培養液中またはその処理物中のビオプテリン類を酸化した後、ビオプテリンを採取することを特徴とする前記(1)に記載のビオプテリン類の製造方法、(3)前記(1)または(2)に記載のビオプテリン類の製造方法において、採取したジヒドロビオプテリンおよび/またはビオプテリンを還元してテトラヒドロビオプテリンを製造することを特徴とする前記(1)または(2)に記載のビオプテリン類の製造方法、(4)テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素が、GTPシクロヒドラーゼI、6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素およびセピアプテリン還元酵素からなる群から選ばれる1〜3種類の酵素であることを特徴とする前記(1)〜(3)に記載のビオプテリン類の製造方法、(5)形質転換を6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子およびセピアプテリン還元酵素の遺伝子を有する発現ベクターにより行うことを特徴とする前記(1)〜(3)に記載のビオプテリン類の製造方法、(6)宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のGTPシクロヒドラーゼI活性以上のGTPシクロヒドラーゼI活性を有する変異型細胞であることを特徴とする前記(5)に記載のビオプテリン類の製造方法、(7)宿主細胞に導入するGTPシクロヒドラーゼI遺伝子が、枯草菌由来のmtrA遺伝子であることを特徴とする前記(4)に記載のビオプテリン類の製造方法、(8)宿主細胞が、原核生物細胞である前記(1)〜(7)に記載のビオプテリン類の製造方法、(9)原核生物が、大腸菌、枯草菌または放線菌である前記(8)に記載のビオプテリン類の製造方法、(10)宿主細胞が、真核生物細胞である前記(1)〜(7)に記載のビオプテリン類の製造方法、(11)真核生物が、酵母または糸状菌である前記(10)に記載のビオプテリン類の製造方法、(12)酵母が、メタノール資化酵母または分裂酵母である前記(11)に記載のビオプテリン類の製造方法、(13)酵母が、サッカロマイセス酵母である前記(11)に記載のビオプテリン類の製造方法、(14)宿主細胞が、野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記(1)〜(13)に記載のビオプテリン類の製造方法、(15)宿主細胞が、野生型細胞が有する8−アザグアニン耐性以上の8−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記(14)に記載のビオプテリン類の製造方法、(16)宿主細胞が、IMPデヒドロデナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記(14)または(15)に記載のピオプテリン類の製造方法、(17)宿主細胞に、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子を導入した前記(1)〜(16)に記載のビオプテリン類の製造に用いる形質転換細胞、(18)宿主細胞が、野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記(17)に記載の形質転換細胞、(19)宿主細胞が、野生型細胞が有する8−アザグアニン耐性以上の8−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記(18)に記載の形質転換細胞、(20)宿主細胞が、IMPデヒドロデナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記(18)または(19)に記載の形質転換細胞、(21)宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のGTPシクロヒドラーゼI活性以上のGTPシクロヒドラーゼI活性を有する変異型細胞であって、該宿主細胞に6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子およびセピアプテリン還元酵素の遺伝子を導入した前記(18)に記載の形質転換細胞、および(22)宿主細胞に導入するGTPシクロヒドラーゼI遺伝子が、枯草菌由来のmtrA遺伝子であることを特徴とする前記(17)〜(21)に記載の形質転換細胞、(23)IMPデヒドロデナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を宿主細胞に導入した形質転換細胞を用いることを特徴とする前記(14)または(15)に記載のビオプテリン類の製造方法、(24)宿主細胞にIMPデヒドロデナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を導入した前記(18)または(19)に記載の形質転換細胞、に関する。発明を実施するための最良の形態テトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる酵素としては、第1図に示したようにグアノシン3リン酸シクロヒドラーゼI(GCH)、6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素(PTPS)およびセピアプテリン還元酵素(SPR)等の酵素が挙げられる。宿主細胞に導入する遺伝子は、前述した酵素をコードする遺伝子を含有するものであればいかなるものであってもよい。具体的には、第10図に示した大腸菌由来のGCH遣伝子または第31図に示した枯草菌由来のGCH遺伝子、第11図および第32図に示したラット由来のPTPS遺伝子、および第12図および第33図に示したラット由来のSPR遺伝子を含むDNAはもちろんのこと、該DNAとハイブリダイズするDNAであってもよい。当該DNAとハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、第10図〜第12図および第31図〜33に示した塩基配列と約80%以上、好ましくは約85%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のcDNAライブラリーまたはキットを使用する場合、それらに添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイブリダイゼーションはハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM程度、好ましくは約19〜20mM程度で、温度が約50〜70℃程度、好ましくは約60〜65℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃程度の場合が最も好ましい。宿主細胞に導入する際のDNAは、ゲノムDNA、細胞・組織由来のcDNAまたは合成DNAのいずれでもよい。遺伝子導入に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミドなどいずれであってもよい。また、cDNAは前記した細胞・組織より全RNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。また、さらに、自体公知のオリゴヌクレオチドの合成法に従って製造されたものを用いてもよい。具体的には、例えばフォスフォアミダイト法を利用したDNA合成機model 392(パーキン・エルマー株式会社製)等のDNA合成機で化学合成する方法が挙げられる。宿主細胞に導入する目的遺伝子を含むDNAは、より具体的には、例えば以下のようにして得ることができる。テトラヒドロビオプテリン生合成の第1ステップの反応を触媒する酵素であるGCHについては、動物以外でも葉酸合成に関わる酵素として大腸菌および酵母菌など多くの宿主細胞に存在しているため、GCHをコードするDNAは、(1)該DNAの部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを用いて、PCR法によって遺伝子ライブラリー等から目的とする遺伝子を含んだDNAを増幅する方法、または(2)適当な遺伝子ライブラリーと、GCHの一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したもの(プローブ)とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などによって容易に得ることができる。該方法は本発明において好適に用いることができ、中でも前者が好ましい。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーやキットを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションのプローブとして用いる部分塩基配列を有するDNAは、自体公知のオリゴヌクレオチドの合成法に従って製造することもできる。本発明においては、GCH遺伝子として、大腸菌のGCH遺伝子(folE遺伝子ともいう)、酵母のGCH遺伝子(FOL2遺伝子ともいう)または枯草菌のGCH遺伝子(mtrA遺伝子ともいう)を用いるのが好ましく、中でも枯草菌のGCH遺伝子を用いるのがより好ましい。テトラヒドロビオプテリン生合成の第2ステップおよび第3ステップの反応を行うPTPSおよびSPRをコードするDNAを得るには、ラット肝よりmRNAを抽出し、RT−PCRを行う方法が好ましい。該mRNAを抽出するには、自体公知の方法を用いてよい。例えば、NP−40、SDS、TritonX100、デオキシコール酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊した後、mRNAを分離する。抽出の際にRNA分解酵素によるRNAの分解を防ぐために、抽出液中にRNA分解酵素阻害物質、例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボネイトまたはバナジウム複合体などを添加しておくのが好ましい。また、polyAを含むmRNAの精製については、オリゴdT−セルロースもしくはセファロース2Bを担体とするポリU−セファロースなどのアフィニティ・カラム・クロマトグラフィーあるいはバッチ法による精製法、SDG遠心法による分画またはアガロースゲル電気泳動法等によって行うことができる。かくして得られたPTPSおよびSPRに対応するmRNAを含むmRNA画分よりcDNAを合成する。cDNAを合成する方法としては自体公知の方法を用いてよいが、例えば、先ず、mRNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとして、dATP、dGTP、dCTPおよびdTTPの存在下で逆転写酵素によりmRNAと相補的な一本鎖DNAを合成し、アルカリ処理で鋳型mRNAを分解、除去した後、今度は該一本鎖cDNAを鋳型にして逆転写酵素あるいはDNAポリメラーゼを用いて二本鎖cDNAを合成する方法が挙げられる。こうして作成したcDNAライブラリーからGCH、PTPSまたはSPR等のTHBP合成に関わる酵素の遺伝子を含むcDNAを選択するためには、当該酵素遺伝子を含むDNA断片をプローブとしたハイブリダイゼーション法が用いられる。ハイブリダイゼーションとしては、上記に記載した方法など自体公知の方法を用いてよい。選択されたcDNAがGCH、PTPSまたはSPR等のTHBP合成に関わる酵素をコードしているかどうかを調べるには、cDNAを例えばエシェリヒア・コリまたはCOS細胞内で複製し得るベクターに組み込んで、そのベクターをエシェリヒア・コリまたはCOS細胞に導入し、酵素を発現させることによって行うことができる。本発明に係る形質転換細胞とは、通常、上記THBP合成に関わる少なくとも1種の酵素の遺伝子を、宿主細胞に導入することにより、ビオプテリン類を生産できるようになったものまたはビオプテリン類の生産能が向上したものをいう。したがって、宿主細胞は、本来ビオプテリン類の生産能力のないものであってもよいし、ビオプテリン類の生産能力をある程度有するものであってもよい。すなわち、宿主細胞の中には、元来上記THBP合成に関わる酵素のうち1〜3種いずれかの遺伝子を有し、該1〜3種の酵素を十分に発現する宿主細胞もある。そのような場合、その酵素に限っては、その酵素の遺伝子を宿主細胞に導入しなくてもよい。当然、ビオプテリン類生産能を高めるために導入してもよい。しかし、そうでない場合、すなわち上記酵素の遺伝子が存在しない場合は、その酵素の遺伝子を導入する必要が通常はあり、また該遺伝子は存在するが十分に酵素が発現しない場合は、その酵素の遺伝子を導入するのが好ましい。宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属菌、バチルス(Bacillus)属菌、アクチノマイセタレス(Actinomycetales)目菌などの原核生物であってもよいし、例えば、酵母、糸状菌、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、植物細胞などの真核生物であってもよい。エシェリヒア属菌の具体例としては、いわゆる大腸菌が挙げられ、そのなかでもエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60巻,160(1968)〕,JM101,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)〕,120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕などが挙げられる。なかでも、本発明においては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)JM101を用いるが好ましい。バチルス属菌としては、いわゆる枯草菌が挙げられ、そのなかでも例えば、バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)1A1株(trpC2)(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)、またはMI114〔ジーン(Gene),24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが挙げられる。本発明においては、中でも前者を用いるのが好ましい。アクチノマイセタレス(Actinomycetales)目菌としては、いわゆる放線菌が挙げられ、なかでもストレプトミセス(Streptomyces)属などが挙げられる。ストレプトミセス属に属するものとして、Streptomyces lividans 3131などが挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス属酵母、メタノール資化酵母または分裂酵母を用いることが好ましい。メタノール資化酵母としてはPichia pastorisが挙げられ、また、分裂酵母としてはSchizosaccharomyce pombeが挙げられる。サッカロマイセス属酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)KA31,サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R−,NA87−11A,DKD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピキア パストリス(Pichia pastoris)KM71などが挙げられる。なかでも、本発明においてはサッカロマイセス(Saccharomyces)属酵母が好ましく、特にSaccharomyces cerevisiae KA31を用いることが好ましい。糸状菌としては、例えば、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フサリウム(Fusarium、ヒュミコラ(Humicola)、ムコル(Mucor)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)およびトリコデルマ(Trichoderma)などの種が挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが挙げられる。また、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N;BmN細胞)なども用いられる。上記Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn,J.L.ら、イン・ヴィボ(in Vivo),13巻,213−217(1977))などが挙げられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが挙げられる(前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(1985))。動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7,Vero細胞、チャイニーズハムスター細胞CHO、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO、マウスL細胞、マウスAtT−20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞、293細胞、C127細胞、BALB/3T3細胞、Sp−2細胞などが挙げられる。植物細胞としては、タバコ細胞、ニンジン細胞等が挙げられる。本発明に係る宿主細胞は、上記宿主細胞の野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能をもつ変異型細胞を用いることができる。THBP生合成の出発物質であるGTPはプリン化合物の一種であるため、GTP合成能が増加したプリン合成経路の調節変異型細胞を用いれば、出発物質であるGTPの供給量が増加し、その結果ビオプテリン類の産生量も向上するからである。該プリン合成経路の調節変異型細胞を得るためには、公知の方法を用いてよい。例えば、プリンアナログを加えた培地で培養し、プリンアナログに耐性を有する突然変異株を選択する方法等が挙げられる。プリンアナログとしては自体公知の物質を用いてよいが、8−アザグアニンやデコイニン等が挙げられ、これらが好適に用いられる。具体的には、B.Subtilisの場合、該変異型細胞は8−アザグアニンやデコイニンのようなプリン類似体及びメチオニンスルホキシドのような他の拮抗体に耐性を有する突然変異株を得ることにより達成できることが報告されている(例えば、Ishii及びShiio、Agric.Biol.Chem.36:1511−1522,1972;Matsuiら、Agric.Biol.Chem.43:1739−1744,1979)。また、大腸菌の場合において、野生型細胞が有する8−アザグアニン耐性以上の8−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞を得るための好ましい態様を以下に述べる。宿主細胞である大腸菌JM101株が約100μg/ml以上の8−アザグアニン、約500μg/mlのデコイニンに対して感受性を持つため、約100μg/mlの8−アザグアニンまたは約500μg/mlのデコイニンを含む最少寒天培地を用いてN−メチル−N−ニトロ−ニトロソグアニジン処理による変異処理を行った大腸菌JM101株をプレーティングし、それぞれの耐性株を得ることができる。上記宿主細胞の野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能をもつ宿主細胞を遺伝子工学的に作成することができる。すなわち、GTP合成能を向上させる遺伝子、例えばGTP生合成系酵素の遺伝子を、野生型細胞または高GTP合成能を有する変異型細胞などの変異型細胞に導入した遺伝子組換え細胞を宿主細胞として用いてもよい。GTP合成能を向上させる遺伝子は、自体公知ものを用いてよい。該遺伝子として1種を野生型または変異型細胞に導入してもよいし、2種以上の遺伝子を野生型または変異型細胞に導入してもよい。具体的には、GTP合成能が向上した遺伝子組換え細胞の作製方法として、例えば、イノシン酸からグアニル酸への変換を行うIMPデヒドロゲナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子(Tiedeman,A.A.らJ.Biol.Chem.260:8676−8679,1985およびNucleic Acids Res.13:1303−1316,1985[GenBank M10101])を野生型または変異型細胞に導入する方法が挙げられる。野生型または変異型細胞にguaBA遺伝子などの遺伝子を導入する方法は、下記する方法など自体公知の方法を用いて容易に行うことができる。本発明においては、THBP合成に関わる少なくとも1種の酵素の遺伝子を上記宿主細胞に導入すればよい。すなわち、THBP合成に関わる酵素の遺伝子全てを導入してもよいし、該酵素のうち一部の酵素の遺伝子のみを導入してもよい。具体的には、例えば、(a)GCH、PTPSおよびSPRの遺伝子、(b)GCH、PTPSおよびSPRのうち任意の2種の遺伝子、(c)GCH、PTPSおよびSPRのうちいずれか1種の遺伝子を導入する場合が挙げられる。また、同じ酵素の遺伝子を複数回導入して、発現量を上げるのもよい。特に、GCH遺伝子は複数回導入するのが好ましく、GCH遺伝子の由来は同一であっても異種であってもよい。本発明における好ましい態様としては、GCHは葉酸合成に関わる酵素として大腸菌および酵母菌など多くの宿主細胞に存在しているため、PTPSおよびSPRの遺伝子を導入することが挙げられる。また、他の好ましい態様としては、例えば光合成グラム陰性細菌SynechocystisにおいてはGCHに加えてPTPSの存在も報告されており(Lee,S.Wら、FEMS Microbiology Letter 176:169−176,1999)、このような宿主細胞においてはSPRの遺伝子のみを導入することが挙げられる。さらには、ビオプテリン類生産能を本来より有している細胞に対してもTHBP合成に関わる酵素の遺伝子を導入することができる。こうすることで、酵素活性を高まり、ビオプテリン類生産能が高められるからである。PTPSおよびSPRの2種の酵素の遺伝子を導入し、これを発現させ、一方GCHについては宿主細胞が有するものを用いて、ビオプテリン類を産生させようとする場合、宿主細胞としては、野生型細胞が有する内在性のGTPシクロヒドラーゼI活性以上の酵素活性を有する変異型細胞を用いることが好ましい。かかる変異型細胞を得るための方法としては、染色体に存在するGCH遺伝子のプロモーターの変異株を取得する方法や染色体中のGCH遺伝子の上流へ新たなプロモーターを導入する方法、またはGCHの構造遺伝子の変異により、比活性が野生型細胞のものと比べて上昇したものへと改変する方法などが挙げられる。上記宿主細胞にテトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる酵素の遺伝子を導入する方法としては、自体公知の方法を用いてよい。かかる方法として、具体的には、例えば(a)該遺伝子を宿主細胞染色体に組み込む方法、または(b)ベクターを用いてプラスミドとして細胞内に存在させる方法等が挙げられる。なかでも、効率よくDNAを導入できるという観点からベクターを用いて行う方法が好ましい。上記(a)本発明に係る上記酵素の遺伝子を宿主細胞染色体に組み込む方法としては、ガラス管の片方を細く引いて、その中にDNAを入れ細胞に刺入し、電気泳動的に、または空気とか窒素ガスを送り込みその圧力で、DNAを導入するという方法が挙げられる。また、DNAを金または銀の極めて細かい粒子にまぶし、このDNAの付着した粒子を火薬または高圧ガスで宿主細胞に打ち込みDNAを導入するというパーティクルガン法も挙げられる。さらに、宿主細胞とDNAを一つの容器に入れ電圧をかけることにより、宿主細胞に一過性の穿孔を起こさせ、DNAを取り込ませるというエレクトロポーレーション〔Neumann,E.et al.エンボ・ジャーナル(EMBO J.)1,841−845(1982)〕等も挙げられる。ベクターを用いて本発明に係る遺伝子を宿主細胞に導入する方法としては、自体公知の方法を用いてよい。ベクターとしては、安定なmRNAを大量につくり、生じたmRNAが宿主細胞の中でも効率よく翻訳されるように作られている発現ベクターを用いるのが好ましい。また、複数の遺伝子を導入する場合は、同一の遺伝子であっても異なる遺伝子であっても、複製起点(ori)の異なるベクターを用いるのが望ましい。用いるベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13,pUC18,pUC19,pSTV28)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194)、酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15,pYES2)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neoなどが挙げられる。発現ベクターには、本発明に係る酵素を発現させるため、または発現に有利となるように、通常は調節配列を含む。各々の調節配列はその酵素タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。このような調節配列は、これらに限られないが、プロモーター、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、エンハンサー、シグナル配列、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、SV40複製オリジン(以下、SV40oriと略称する場合がある)および転写ターミネーターを含む。なかでも調節配列としては、少なくともプロモーター、および転写ならびに翻訳終止シグナルを含むのが好ましい。プロモーターとしては、宿主細胞により認識される塩基配列である適切なプロモーター配列であればいかなるものでもよい。宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、1ppプロモーター、T7プロモーターなどが挙げられる。中でも、trcプロモーター、lacプロモーターが好ましい。宿主細胞がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞がアクチノマイセタレス目菌である場合は、例えば抗生物質チオストレプトン誘導性のプロモーターであるtipA(Murakami,T.,et al.(1989)J.Bacteriol,,171,1459)等が挙げられる。宿主細胞が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GALプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどが挙げられる。中でも、GALプロモーターが好ましい。宿主細胞が糸状菌である場合は、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)のTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)のアスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)の中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)のリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリホスリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)のアセトアミダーゼまたはフサリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)のトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター(米国特許第4,288,627号、特表2000−507102に記載)などが挙げられる。宿主細胞が動物細胞である場合は、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、HSV−TKプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が植物細胞である場合は、カリフラワー・モザイク・ウィルスの35Sプロモーターなどが挙げられる。転写ターミネーターとしては、転写を終結させるために宿主細胞により認識される配列であればよい。例えば、動物細胞が宿主の場合は、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の転写ターミネーター配列を用いることができ、具体的には、シミアンウィルスのSV40ターミネーターなどが用いられる。宿主細胞が酵母である場合は、PHO5ターミネーター、PGKターミネーター、GALターミネーター、GAPターミネーター、ADHターミネーター、AOX1ターミネーターなどが挙げられる。宿主細胞が糸状菌である場合は、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼまたはフサリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られるターミネーターが挙げられる。発現ベクターにはタンパク質の分泌に係るシグナル配列も含み得る。シグナル配列としては、導入する遺伝子のシグナル配列を用いることもできるし、異なる遺伝子のシグナル配列を用いることもできる。異なる遺伝子のシグナル配列としては、宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合はアルカリフォスファターゼ・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主細胞がバチルス属菌である場合はα−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが挙げられる。宿主細胞が酵母である場合は、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列などが挙げられる。宿主細胞が糸状菌である場合は、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子、またはリゾムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子からのシグナルペプチドをコードした塩基配列などが挙げられる。宿主細胞が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。発現ベクターには、選択マーカーを含み得る。例えば、大腸菌や枯草菌などの原核生物では、各種の薬剤耐性遺伝子などを、酵母などの真核微生物では宿主の栄養要求性を相補する遺伝子などを選択マーカーとして用いることができる。より具体的には、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(メソトレキセート(MTX)耐性遺伝子)、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子(G418耐性)、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、URA3遺伝子等が挙げられる。発現ベクターには、本発明に係る酵素遺伝子の発現に有利である1または複数の因子、例えばアクティベーター(例えばトランス作用因子)、シャペロン、SD配列およびプロセッシングプロテアーゼをコードする1または複数の核酸配列も含み得る。選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかの因子も本発明に係る発現ベクターに用いることができる。本発明において、公知の発現ベクターを用いてもよい。例えば大腸菌宿主細胞用としてPIN−III−ompA2等を挙げることができる。さらに、放線菌宿主細胞用としてpIJ702、酵母宿主細胞用としてpNJ1053などが挙げられる。また、植物細胞が宿主細胞の場合、例えば、pBI121(Nucleic Acids Res.,12,8771−8721(1984))等が挙げられる。また、シャトルベクターpDG148(Karmazyn−Campelliら,Cell,52,697−704,1988)は、大腸菌および枯草菌に使用でき、本発明において好適に用いられる。本発明に係る上記THBP生合成に関わる酵素の遺伝子を含むcDNAなどを、上記ベクターに組み込む方法は、例えば、制限酵素で切断してDNAリガーゼで結合するなどの自体公知の方法を用いてよい。上記cDNA等については、上記ベクターに組み込みやすいように、予めエキソヌクレアーゼ処理、化学合成DNA断片の付加、PCR法もしくはリンカーの結合による制限酵素切断部位の付加、二本鎖cDNAやベクターDNAの末端に連結可能な端末をつけるためにG,C−鎖を伸ばすなど各種処理を行ってもよい。このようにして構築されたTHBP合成に関わることのできる酵素の遺伝子を含有するベクターを、宿主細胞に導入することによって本発明に係る形質転換細胞を製造することができる。該発現ベクターの宿主細胞へ導入して形質転換する方法としては、公知方法を用いてよい。エシェリヒア属菌等の原核生物が宿主細胞の場合、対数増殖期における細胞を回収後、よく知られているCaCl2法(Graham,F.L.and vander Eb,A.J.Virology 52,456−467(1973))によって導入できる。形質転換反応液中にMgCl2またはRbClを共存させれば形質転換効率は向上し得るので、本発明において共存させてもよい。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後、形質転換させることも可能である。用いる宿主細胞が真核生物の場合、DNAをリン酸カルシウム沈澱として感染させる方法、マイクロインジェクション法、赤血球細胞あるいはリポソームにプラスミドを包括して導入する方法、リゾフォスファチジルコリンのような試薬による細胞の処理法、またはウィルスベクターを用いる方法など通常の方法によって導入することができる。また、宿主細胞が酵母である場合は、酢酸リチウム法を用いることができる。より具体的には、エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics),168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),194巻,182−187(1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えばバイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6,47−55(1988)などに記載の方法に従って行われる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール.263−267(1995)(秀潤社発行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って行うことができる。植物細胞を形質転換するには、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)法(Methods in Enzaymol.,118,627−640(1986))、高速微粒子法[プラント・モレキュラー・バイオロジー(Plant Molecular Biology),11,433−439(1989)]、プロトプラスト法[ネイチャー(Nature),319,791−793(1986)]等に記載された方法に従って、本発明にかかる遺伝子を導入することにより行うことができる。なお、動物細胞を用いて、本発明に係る酵素を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記選択マーカーを指標にして形質転換細胞を選択し、さらに、このように選択マーカーを用いて得られた形質転換細胞に対して、繰り返しクローン選択を行うことにより本発明に係る酵素の高発現能を有する安定な形質転換細胞を得ることができる。本発明においては、上記の形質転換細胞を、導入したGCH、PTPSまたはSPR等のTHBP合成に関わる酵素の遺伝子が発現可能な条件下で通常は培養を行う。培養に際しては、培養温度、培地pH、溶存酸素レベルを一定に制御することが好ましい。例えば培地pHが低下する等により細胞の増殖が鈍くなるのを極力抑え、かつ増殖を促し、ひいては、より効率よくビオプテリン類を生産するため、上述のように培養条件を一定にするのが好ましいからである。宿主細胞がエシェリヒア属菌、バチルス属菌またはアクチノマイセタレス目菌である形質転換細胞を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が好ましく、その中には該形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有している培地が好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質など、無機物としては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、上記培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8程度が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、具体的には、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York1972〕などが挙げられるが、LB培地(実施例4参照)で前培養した後、NUCA培地(実施例4参照)で本培養するのが好ましい。ここに所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば3β−インドリルアクリル酸、クロラムフェニコールのような薬剤を加えることができる。また、誘導性のプロモーターを用いる場合には、誘導を起こす物質を培地に添加することが望ましい。例えば、lacプロモーターの場合はイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド(IPTG)、GALプロモーターの場合はガラクトースを添加することが好ましい。培養は約10〜50℃程度で約3〜72時間程度行うことが好ましく、所望により通気や撹拌を行うこともできる。バチルス属菌の培養は、通常約30〜40℃で約6〜40時間程度行い、所望により通気や撹拌を行うこともできる。培地は、公知の培地を用いることができる。具体的には、例えばLB培地(実施例4参照)で前培養した後、NU培地(実施例14参照)で本培養するのが好ましい。宿主細胞がアクチノマイセタレス目菌である場合は、通常約20〜40℃で約2〜7日間程度行い、所望により通気や撹拌を行うこともできる。培地としては、GP培地(グリセロール0.4wt%、ペプトン0.1wt%、イースト・エキス0.4wt%、硫酸マグネシウム0.05wt%、リン酸一カリウム0.2wt%、リン酸二ナトリウム0.5wt%、グリシン0.1wt%/1L)など公知の培地を用いることができる。酵母を培養する際の培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian,K.L.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77巻,4505(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter,G.A.ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81巻,5330(1984)〕が挙げられる。なかでも、SD−Ura−培地(実施例5参照)が好ましい。培地のpHは約5〜8程度に調整するのが好ましい。培養は約20℃〜40℃程度で約24〜84時間程度行うことが好ましく、所望により通気や撹拌を行うことができる。宿主細胞が糸状菌である場合も、自体公知の方法により培養できる。宿主細胞が昆虫細胞または昆虫である形質転換細胞を培養する際、培地としては、例えば、Grace’s Insect Medium(Grace,T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが挙げられる。培地のpHは約6.2〜6.4程度に調整するのが好ましい。培養は約27℃程度で約3〜5日間程度行うことが好ましく、所望により通気や撹拌を行うことができる。動物細胞を培養する際の培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(J.Amer.Med.Ass.)199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proc.Soc.Biol.Med.),73巻,1(1950)〕などが用いられる。培地のpHは約6〜8程度であるのが好ましい。培養は約30℃〜40℃程度で約15〜72時間程度行うのが好ましい。植物細胞を培養する際の培地としては、例えば、ムラシゲ・スクーグ(MS)培地、ホワイト(white)培地等が挙げられる。以下に本発明に係るビオプテリン類の製造方法の好ましい態様を述べる。大腸菌系のベクターとしてpSTV28を用い、GCH、PTPS、SPRのそれぞれのcDNAをラクトースプロモーター下流に配したプラスミド、pSTV28−GPSを作製する。該プラスミドはIPTGによる誘導が可能な発現ベクターである。この発現ベクターを大腸菌JM101株に導入し、0.5mMIPTGを含む培地で約48時間培養を行う。これにより、ビオプテリン類を製造することができる。また、ベクターとして酵母pYES2を用い、GCH、PTPS、SPRのそれぞれのcDNAをGAL1プロモーター下流に配したプラスミド、pYES2−FPSを作製する。かかるプラスミドは、ガラクトースによる発現誘導が可能な発現ベクターである。この発現ベクターをSaccharomyces酵母に導入し、ガラクトースによる誘導により各酵素遺伝子の発現を行う。これにより、ビオプテリン類を製造することができる。また、本発明に係るビオプテリン類の製造方法として次のような態様も挙げられる。シャトルベクターpDG148(Karmazyn−Campelliら,Cell,52,697−704,1988)を用い、GCH、PTPSおよびSPRのそれぞれのcDNAをspacプロモーターの下流に配したプラスミドpDG148MPSを作製する。該プラスミドは、IPTGによる誘導が可能な枯草菌用の発現プラスミドである。この発現ベクターをBacillus subtilis 1A1株(trpC2)に導入し、形質転換細胞を作製する。かかる形質転換細胞を約5μg/mlのカナマイシンを含むLB培地で約3時間前培養を行い、ついで、約1mMのIPTGおよび約5μg/mlのカナマイシンを含むNU培地で約20時間、約37℃で振盪培養する。これにより、ビオプテリン類を製造することができる。また、上記シャトルベクターpDG148からlacI遺伝子を欠失させることにより、IPTGの有無に関わらず、GCH、PTPSおよびSPRを恒常的に発現させることができる発現ベクターpDG148MPSΔIを作成することができる。かかる発現ベクターは、本培養の際にIPTGが必要ないこと以外は上記と同様にして培養すればよい。宿主細胞の中に元来存在するGTPから、形質転換細胞内で発現したGCH、PTPSまたはSPR等のTHBP合成に関わることのできる酵素により、THBPが産生される。産出されたTHBPは、細胞内で、または細胞膜を通過して細胞外、例えば培養液などの培地中に排出されて、第2図に示すように酸化されてDHBPとなり、さらに酸化されてBPとなりえる(Takikawaら、Eur.J.Biochem.161:295−302,1986)。すなわち、形質転換細胞の種類や例えば培養条件などの細胞外の環境などにより異なるため一概には言えないが、形質転換細胞内でTHBPのみが産出されるものもあるし、これの一部または全部が酸化されてDHBPもしくはBPまたはこれらの混合物となっている場合もある。さらに、形質転換細胞内で産出されたTHBPが細胞膜を通過して細胞外に排出される場合もある。その場合、培養液の組成により異なるため一概には言えないが、排出されたTHBPが培養液中でDHBPまたはBPに酸化されることもある。本発明においては、培養液またはその培養上清等の処理物中のビオプテリン類を以下の方法で精製単離してもよい。また、所望により培養液またはその培養上清等の処理物に酸化剤を添加するなどして酸化したあと、ビオプテリン類を精製単離してもよい。ビオプテリン類の中でもTHBPは酸化されやすい物質であるので、培養液またはその培養上清等の処理物を酸化し、THBPまたはDHBPをBPに酸化した後、化学的により安定なBPを精製単離するのが好ましい。培養液またはその培養上清等の処理物中のビオプテリン類を酸化させる方法は自体公知の方法を用いてよいが、培養液またはその培養上清等の処理物に公知の酸化剤を加えればよい。酸化剤としては、ヨウ化カリウムなどの過ヨウ素酸塩、二クロム酸カリウムもしくはナトリウム、過マンガン酸カリウム、ニトロソジスルホン酸カリウム、硝酸などが挙げられ、中でも、ヨウ化カリウムを用いるのが好ましい。上記培養物から本発明にかかるビオプテリン類を分離精製するには、自体公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、本発明にかかるビオプテリン類を形質転換細胞である培養菌体または細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームもしくは凍結融解などの方法、またはそれらの方法の組み合わせによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過など自体公知の方法で形質転換細胞と培養上清とを分離し、培養上清を集め、本発明にかかるビオプテリン類の溶解液を得る方法などが適宜用い得る。形質転換細胞内で産出されたTHBPが細胞膜を通過して細胞外に排出される場合は、形質転換細胞を破壊することなく、遠心分離やろ過など自体公知の方法で形質転換細胞と培養上清とを分離し、培養上清を集め、本発明にかかるビオプテリン類の溶解液を得る方法などが適宜用い得る。このようにして得られた培養液または培養上清などの培養液の処理物に含まれる本発明にかかるビオプテリン類の精製は、自体公知の分離・精製方法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法もしくはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法;アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法;逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして得られる本発明にかかるビオプテリン類が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することもでき、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することもできる。本発明におけるビオプテリン類の精製の好ましい態様としては、培養液を酸性条件の下、ヨウ化カリウム溶液により酸化してBPへと変換した後、沈殿操作、Dowex 1x8クロマトグラフィー、フロリジルクロマトグラフィーを経て、精製BPを得る方法が挙げられる。このようにして得られたビオプテリン類は、所望により公知手段を用いて、THBPへ変換可能である。例えば、BPまたはDHBPは、化学的な水素付加反応によりTHBPへ変換できる。化学的な水素付加反応は自体公知の方法を用いてよく、例えば、水素化アルミニウムリチウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、ジボラン、アルキルジボランなどと反応させる方法、またはRaney−Ni触媒による還元等の方法が挙げられる。これらの反応条件は公知の方法に従えばよい。また、還元条件によっては、BPからDHBPを得ることもできる。THBPは上述のように、各種酵素の補酵素であることが知られており、その薬理作用物質として期待されている物質である。また、DHBPまたはBPは、かかるTHBPの供給体として有用であるばかりか、薬理作用を示す可能性もある有用物質である。実施例本発明の実施例を以下に示す。なお、以下の遺伝子工学または生物工学の基本操作については、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)、モレキュラー・クローニング第2版(Molecular Cloning,2nd ed.)コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymol.),vol 194(1991)、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法 羊土社(1994)等に記載された方法に従って行った。また、市販のキットを用いる場合には、添付されている使用説明書の指示に従った。〔実施例1 GCH遺伝子、PTPS遺伝子およびSPR遺伝子の取得〕1.大腸菌由来のGCH(GTPシクロヒドラーゼI)遺伝子のクローニング報告されている方法(生物工学実験書[培風館、p97−98])により、大腸菌(W3110株)からゲノムDNAを抽出した。これを鋳型として、センスプライマーP1(配列番号1)及びアンチセンスプライマーP2(配列番号2)を用いて常法に従いPCRを行い、GCH遺伝子(foIE)〔Katzenmeier,G.ら,Biol Chem Hoppe Seyler 372:991−997,1991,[GenBank X63910]〕を取得した。次に、得られたGCH遺伝子を含むDNAを鋳型に、センスプライマーP3(配列番号3)及びアンチセンスプライマーP4(配列番号4)を用いたPCRを行い、GCH遺伝子の5’側及び3’側の非翻訳領域に、それぞれ制限酵素EcoRI及びSpeIの切断部位を付加した。このPCR産物をEcoRI及びSpeIで消化し、pProEX HTaベクター(GIBCO BRL)のEcoRI及びSpeI部位に導入し、pProEX−GCHを作製した。なお、PCRの条件、制限酵素処理およびライゲーション反応は常法に従った。次にpProEX−GCHにクローニングされた大腸菌GCH遺伝子をプラスミドpSTV28(宝酒造)にクローニングするため、pProEX−GCHを鋳型にセンスプライマーP5(配列番号5)及びアンチセンスプライマーP6(配列番号6)を用いてPCRを行い、5’側及び3’側の末端にそれぞれに制限酵素EcoRI及びSalI切断部位を有したGCH遺伝子を得た。得られたPCR産物を制限酵素EcoRIおよびSalIで切断後、pSTV28のEcoRIおよびSalI断片(3.0kb)(以下、EcoRI−SalI断片またはEcoRI,SalI断片と表記することもある。他も同様である。)と連結し、大腸菌GCH発現プラスミドpSTV28−GCHを得た(第3図)。pSTV28−GCHに含まれるGCH遺伝子(folE)は大腸菌ラクトース(lac)プロモーターにより転写され、発現したGCHはアミノ末端にpSTV28由来の7アミノ酸(第10図の下線部)が付加されたアミノ酸配列を持つ(第10図)。2.ラット由来のPTPS(6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素)遺伝子のクローニングラットより摘出した肝臓をコラゲナーゼ処理して取得した肝細胞から、TRIzol試薬(GIBCO BRL)を用いて全RNAを抽出した。DNaseI処理したラット肝全RNAを、Super Script Preamplification System(GIBCO BRL)を用いたRT−PCRに供し、PTPS遺伝子(Inoue,Y.ら,J.Biol.Chem.266:20791−20796,1991:[GenBank NM_017220])を含むcDNAを取得した。ここで、逆転写にはオリゴdTプライマーを用い、PTPS遺伝子を含む一本鎖DNAのPCRによる増幅にはセンスプライマーP7(配列番号7)及びアンチセンスプライマーP8(配列番号8)を用いた。取得したPTPS遺伝子を含むcDNAを鋳型に、センスプライマーP9(配列番号9)及びアンチセンスプライマーP10(配列番号10)を用いたPCRを行い、PTPS遺伝子を含むcDNAの5’側及び3’側の非翻訳領域に、それぞれ制限酵素EcoRI及びSpeIの切断部位を付加した。このPCR産物をEcoRI及びSpeIで消化し、pProEX HTcベクター(GIBCO BRL)のEcoRI及びSpeI部位に挿入し、pProEX−PTPSを作製した(第4図)。次に、pProEX−PTPSを鋳型にセンスプライマーP11(配列番号11)及びアンチセンスプライマーP12(配列番号12)を用いてPCRを行い、制限酵素EcoRI及びSalI切断部位を有したPTPS遺伝子を得た。得られたPCR産物を、制限酵素EcoRIおよびSalIで切断後、pUC18(Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.and Messing,J.Gene,33:103−119,1985)のEcoRIおよびSalI断片(2.7kb)と連結し,ラットPTPS発現プラスミドpUC18−PTPSを得た(第4図)。pUC18−PTPSに含まれるPTPS遺伝子は大腸菌lacプロモーターにより転写され、発現したPTPSはアミノ末端にpUC18由来の7アミノ酸(第11図の下線部)が付加されたアミノ酸配列を持つ(第11図)。3.ラット由来のSPR(セピアプテリン還元酵素)遺伝子のクローニングPTPS遺伝子を含むcDNAと同様の方法でSPR遺伝子(Citron,B.A.らProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:6436−6440 1990,[GenBank M36410])を含むcDNAを取得した。ただし、SPR遺伝子を含む一本鎖DNAのPCRによる増幅にはセンスプライマーP13(配列番号13)及びアンチセンスプライマーP14(配列番号14)を用いた。SPR遺伝子を含むcDNAを鋳型に、センスプライマーP15(配列番号15)及びアンチセンスプライマーP16(配列番号16)を用いたPCRを行い、SPR遺伝子を含むcDNAの5’側及び3’側の非翻訳領域に、それぞれ制限酵素BamHI及びSpeIの切断部位を付加した。このPCR産物をBamHI及びSpeIで消化し、pProEX HTbベクター(GIBCO BRL)のBamHI及びSpeI部位に挿入し、pProEX−SPRを作製した(第5図)。次に、ラットSPR遺伝子についてpProEX−SPRを鋳型にセンスプライマーP17(配列番号17)及びアンチセンスプライマーP18(配列番号18)を用いてPCRを行い、5’側及び3’側の末端にそれぞれに制限酵素HindIII切断部位を有するSPR遺伝子を得た後、得られたPCR産物を、制限酵素HindIIIで切断し、pUC19(Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.and Messing,J.Gene,33:103−119,1985)のHindIII断片(2.7kb)と連結してラットSPR発現プラスミドpUC19−SPRを作製した(第5図)。pUC19−SPRにコードされたSPR遺伝子についても大腸菌lacプロモーターにより転写され、発現したSPRはアミノ末端にpUC19由来の8アミノ酸(第12図の下線部)が付加されたアミノ酸配列を持つ(第12図)。4.酵母由来のGCH遺伝子(FOL2)のクローニングFOL2はGCHのホモログである。酵母(Saccharomyces cerevisiae,KA31株)のゲノムDNAを鋳型に、センスプライマーP23(配列番号23)及びアンチセンスプライマーP24(配列番号24)を用いてPCRを行い、5’側及び3’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素BamHI及びXhoI切断部位を有したFOL2遺伝子(Tettelin,H.らNalure 387:81−84,1997,[GenBank NC_001139])を含むDNAを取得した。このPCR産物をBamHI及びXhoIで消化し、pYES2/CTベクター(Invitrogen)のBamHI及びXhoI部位に挿入し、pYES2−FOL2を作製した(第6図)。〔実施例2 大腸菌用ビオプテリン類生産プラスミドpSTV28−GPSの作製〕大腸菌のTHBP合成酵素発現プラスミドであるpSTV28−GPSは以下の方法で作製した。まず実施例1に記載のpUC18−PTPSを鋳型にしてPCRを行い、lacプロモーターからPTPS遺伝子の終止コドンまでを含むDNAを増幅した。PCRのプライマーを設計するに当たり、センスプライマーにSalI部位を、アンチセンスプライマーにBamHI部位を設け、後のクローニングが容易になるようにした。それぞれのプライマーはセンスプライマーP19(配列番号19)、アンチセンスプライマーP20(配列番号20)の配列を持つ。得られたPCR産物はエタノール沈殿処理の後、TEバッファー(10mM Tris−HCl(pH8.0),1mM EDTA)に溶解し、制限酵素SalIおよびBamHIで切断した。次に、実施例1に記載のpUC19−SPRを鋳型にしてPCRを行い、lacプロモーターからSPR遺伝子の終結コドンまでを含むDNAを増幅した。PCRのプライマーにはセンスプライマーにBamHI部位を、アンチセンスプライマーにSphI部位を設けた。それぞれのプライマーはセンスプライマーP21(配列番号21)、アンチセンスプライマーP22(配列番号22)の配列を持つ。得られたPCR産物はエタノール沈殿処理の後、TEバッファー(10mM Tris−HCl(pH8.0),1mM EDTA)に溶解し、制限酵素BamHIおよびSphIで切断した。このようにして得られたPTPS遺伝子を含むSalI−BamHI断片およびSPR遺伝子を含むBamHI−SphI断片をpSTV28−GCHのXhoIおよびSphI消化物(3.9kb)と連結させ、pSTV28GPSを作製した(第7図)。pSTV28−GPSはGCH,PTPS,SPR遺伝子(第10図〜12に記載)のそれぞれがlacプロモーターにより転写される構造を有する。〔実施例3 酵母用ビオプテリン類生産プラスミドpYES2−FPSの作製〕pUC18−PTPSを鋳型に、センスプライマーP25(配列番号25)及びアンチセンスプライマーP26(配列番号26)を用いてPCRを行い、PTPS遺伝子の5’側及び3’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素BamHI及びXhoI切断部位を付加した。このPCR産物をBamHI及びXhoIで消化し、pYES2/CTベクターのBamHI及びXhoI部位に挿入し、pYES2−PTPSを作製した(第8図)。続いて、pUC19−SPRを鋳型に、センスプライマーP27(配列番号27)及びアンチセンスプライマーP28(配列番号28)を用いてPCRを行い、SPR遺伝子の5’側及び3’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素BamHI及びXhoI切断部位を有したSPR遺伝子を含むcDNAを取得した。このPCR産物をBamHI及びXhoIで消化し、pYES2/CTベクター(Invitrogen)のBamHI及びXhoI部位に挿入し、pYES2−SPRを作製した(第8図)。次に、pYES2−PTPSを鋳型に、センスプライマーP29(配列番号29)及びアンチセンスプライマーP30(配列番号30)を用いてPCRを行い、PTPS遺伝子の上流にSphI切断部位を付加したGAL1プロモーター、及び下流にSpeI切断部位を付加したCYC1転写終結シグナルを有するDNA断片を得た。なお、このDNA断片は使用したDNAポリメラーゼ(pyrobest DNA Polymerase[宝酒造])の性質から平滑末端となっている。5’末端をリン酸化した該DNA断片を、SpeI消化後末端平滑化したpYES2−SPRに挿入し、pYES2−PSを作製した。続いてpYES2−FOL2を鋳型に、センスプライマーP31(配列番号31)及びアンチセンスプライマーP32(配列番号32)を用いてPCRを行い、FOL2遺伝子の上流にSpeI切断部位を付加したGAL1プロモーター、及び下流にSpeI切断部位を付加したCYC1転写終結シグナルを有するDNA断片を得た。この断片をSpeI消化後、pYES2−PSのSpeI切断部位に挿入し、pYES2−FPSを作製した。pYES2−FPSにおいてはS.cerevisiae由来のGCH遺伝子、ラット由来PTPS遺伝子およびラット由来SPR遺伝子がそれぞれGAL1プロモーターにより転写される構造を有しており、天然型酵素と同じアミノ酸配列を持つ酵素が発現する(第9図)。〔実施例4 大腸菌によるビオプテリン類の生産〕大腸菌JM101株を塩化カルシウム法(Mandel and Higa,J.Mol.Biol.,53159−162 1970)によりpSTV28−GPSで形質転換しJM101/pSTV28−GPSを得た後、これを培養してビオプテリン類の生産能を調べた。まず、LB培地で一晩培養したJM101/pSTV28−GPSを前培養液とし、その50μlを0.5mM IPTG(イソプロピルチオガラクトピラノシド)を含むNUCA培地3mLに接種し、37℃で48時間培養した。なおLB培地およびNUCA培地は以下の組成から成る。[LB培地1L中の組成:10gトリプトン、5g酵母エキス、5g NaCl]、[NUCA培地1L中の組成:20gグリセロール、4g酵母エキス,10gカザミノ酸、4g K2HPO4、4g KH2PO4、2.7g Na2HPO4、1.2g(NH4)2SO4、0.2g NH4Cl、2g MgSO4・7H2O、40mg FeSO4・7H2O、40mg CaCl2・2H2O、10mg MnSO4・nH2O、10mg AlCl3・6H2O、4mg CoCl2・6H2O、2mg ZnSO4・7H2O、2mg Na2MoO4・2H2O、1mg CuCl2・7H2O、0.5mg H3BO4、30mgクロラムフェニコール]産生されたTHBPは水溶液で容易に酸化され、DHBPおよびBPとなるため、JM101/pSTV28−GPSがTHBPを生産したかどうかについては培養液をヨード酸化し、BPに変換して生産量を測定した。培養液を遠心分離し、菌体を除いた後、培養液に対して10分の1量のヨウ化カリウム液(0.9%I2,1.8%KIを含む1規定塩酸液)を添加し、遮光して1時間放置した。次にこの培養液を脱イオン水で20倍希釈し、これを10mMナトリウムリン酸緩衝液で平衡化した4.6mmx250mmのC18逆相カラム(COSMOSIL 5C18−AR,ナカライテスク)に流速0.8mL/分でインジェクトし、350nm励起、440nm蛍光検出器を用いてBPを定量した。その結果、培養上清にはBP標準品およびP(プテリジン)標準品に一致するピークが検出され(第13図)、JM101/pSTV28−GPSがビオプテリン類を生成したことが明らかとなった。ピークエリアより生産されたビオプテリン類の量を算出したところ、培養液1Lあたりの生産量は約20mgであった。〔実施例5 酵母によるビオプテリン類の生産〕S.cerevisiae KA31株(MAT α ura3 leu2 his3 trpl)を酢酸リチウム法によりpYES2−FPSで形質転換した。SD−Ura−培地により形質転換細胞を選択し、FPS株を得た。〔SD−Ura−培地1L中の組成:グルコース20g、Yeast nitrogen base(アミノ酸・硫酸アンモニウム不含)1.7g、硫酸アンモニウム5g、アデニン硫酸塩20mg、Arg 20mg、Asp 100mg、Glu 100mg、Ile 30mg、Lys 30mg、Met 20mg、Phe 50mg、Ser 400mg、Thr 200mg、Tyr 30mg、Val 150mg、His 20mg、Leu 100mg、Trp 20mg〕また、同様にベクター(pYES2/CT)による形質転換細胞をコントロール(Mock)として作製した。得られた形質転換細胞をOD600nm=0.4となるまで5mlのSCD−Ura−培地で培養した後、等量のSCGal−Ura−培地に置換し発現誘導を行った。なお培養温度は30℃とした。SCD−Ura−培地1L中の組成;Yeast nitrogen base(アミノ酸・硫酸アンモニウム不含)1.7g、硫酸アンモニウム5g、カザミノ酸5g、グルコース20g、アデニン硫酸塩20mg、Trp 20mgSCGal−Ura−培地1L中の組成;Yeast nitrogen base(アミノ酸・硫酸アンモニウム不含)1.7g、硫酸アンモニウム5g、カザミノ酸5g、ガラクトース20g、アデニン硫酸塩20mg、Trp 20mg発現誘導後24時間以降で、FPS株の培養液にプテリジン化合物に特徴的な黄色の着色が認められ、発現させた3種の酵素が菌体内で機能していることが外観より判った。誘導後の菌体の増殖はFPS株、Mock株共に良好であった(第14図)。THBPあるいはその酸化体の産生を確認するために、誘導後72時間における培養上清を実施例4と同様に酸化処理し、HPLC分析及びTLC分析に供した。なお、HPLC分析は実施例4と同様の方法で行った。TLC分析については、薄層クロマトグラフ用シリカゲル薄層板(シリカゲル60F254,層厚0.25mm,10cm×20cm)を用い、展開溶媒としてクロロホルム・メタノール・酢酸・水混液(45:10:5:2)を使用した。薄層板にサンプルを20μl、BP及びP標準品をそれぞれ100ngスポットし、風乾後傾斜上昇法により展開した。展開距離が約12cmとなった時点で展開を終了し、薄層板を風乾後、紫外線(主波長254nm)を照射し吸収スポットを検出した。HPLC分析結果を第15図に示す。FPS株においてのみBPに相当するピークが認められ、ピークエリアの面積比から、FPS株は誘導72時間で0.76μg/mlのBPに相当するビオプテリン類を培養上清中に産生したことが判った。第16図に培養上清のTLC分析結果を示す。FPS株の培養上清中にBP標準品と同等の移動度を示すスポットが確認された。TLC分析は、実施例5に記載したようにヨウ化カリウム液で酸化した培養上清20μlを分析して、BPのスポットの紫外線吸収強度から培養上清20μlあたり13.7μgのBPを産生していることがわかったが、この値はHPLC分析の結果から算出される培養上清1mlあたり0.76μgの値と一致する。〔実施例6 ビオプテリン類生産大腸菌の作製〕THBPの前駆体であるGTPを野生株よりも多量に生産できる宿主菌を作製するため、プリン合成の調節変異株を以下のようにして取得した。まず20,50,100,および500μg/mlの8−アザグアニンおよびデコイニンを含むM9最少寒天培地で大腸菌JM101に対するこれらの薬剤の感受性を調べたところ、100μg/ml以上の8−アザグアニン、500μg/ml以上のデコイニンに対して感受性を持つことが明らかとなった。M9最少寒天培地の組成;グルコース2g/L,Na2HPO4 6g/L,KH2PO4 3g/L,NaCl 0.5g/L,NH4Cl 1g/L,MgSO4 2mM,CaCl2 0.1mM,寒天15g/L、pH7.4そこでN−メチル−N−ニトロ−ニトロソグアニジンによる変異処理(Miller,1972,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York)を行った大腸菌JM101を、100μg/mlの8−アザグアニン、または500μg/mlのデコイニンを含有するM9最少寒天培地のプレートに播き、37℃で培養して耐性変異株を得た。得られたそれぞれの耐性変異株より50株ずつを選択し、塩化カルシウム法により発現プラスミドpSTV28−GPSを導入した。このようにして得られた株を先のNUCA培地で48時間培養し、それぞれの株のビオプテリン類の生産量を比較した。その結果、8−アザグアニン耐性株の中から親株(JM101/pSTV28−GPS)に対し、約10倍のビオプテリン類生産能を持つAG14/pSTV28−GPS株が得られた。すなわち大腸菌において8−アザグアニン耐性を付与することにより、ビオプテリン類生産能が上昇した株が取得できることが明らかとなった(第1表)。なお本菌株については、培養液にはBPに加えDHBPが検出され、生産されたTHBPの一部は自然酸化されDHBPまたはBPとして存在していることが明らかとなった(第17図)。〔実施例7 ジャーファーメンターを用いたビオプテリン類生産大腸菌の培養とBPの精製〕ビオプテリン類生産菌AG14/pSTV28−GPS株について、3Lジャーファーメンターを用いた培養を行った。ジャーファーメンターの培地は0.5mM IPTGを含む前述のNUCA培地を用いた。まず、AG14/pSTV28−GPS株をLB培地で一晩培養し、その10mlを、0.5mM IPTGを含む2LのNUCA培地に接種し、37℃で溶存酸素レベルを30%に維持しながら培養した。培養初期に添加した2%グリセロールが枯渇した後は、80%グリセロールを逐次添加して48時間培養を行った。培養液の一部についてHPLC分析を行った。すなわち、生産されたTHBPを実施例4と同様にヨウ化カリウム液で酸化してBPに変換した後、HPLCを用いた蛍光分析により分析した。HPLC分析は、実施例5と同様に行った。その結果、ピークエリアより算出されるBPの生産量から換算するに、培養48時間で350mg/LのTHBPが生産されたことがわかった。また、得られた培養液よりBPを得るため、上記培養液200mlを遠心分離して菌体を除去し、培養上清に10分の1のヨウ化カリウム液(0.9%I2,1.8%KIを含む1規定塩酸液)を添加してBPへの酸化を行った。その後、遮光して1時間放置し、5M水酸化ナトリウム溶液を添加してpH7.0に調整した。次に、本溶液を氷冷してBPを析出・沈殿させ、得られた沈殿物を遠心分離により回収し、これに純水を加えた後、塩酸でpH2に調整し、沈殿を溶解させた。この液をDowex 1x8カラム(10mmX100mm)にチャージし、純水20mlで洗浄した後、0.5M NaClを用いて流速1ml/分で溶出させた。得られた溶出液は2mlずつ採取し、8番目から16番目の画分をプールした。次にこのプール画分の半量を0.5Mギ酸で平衡化したフロリジルカラム(10mmX100mm)にチャージし、0.5Mギ酸20mlで洗浄した後、2N HClにより溶出させた。得られた溶出液は1.8mlずつ採取し、4番目から16番目の画分をプールした。これにより純度98%のBPを2mg得た。〔実施例8 培養条件の至適化とビオプテリン類生産量の上昇〕実施例17に記載の3Lジャーファーメンターを用いた培養において、培養温度、培地pH、溶存酸素レベルを一定に制御した培養を行った。各条件は、培養温度37℃、pH6.5、溶存酸素レベル30%とし、培地pHは28%アンモニア水の添加により、また溶存酸素レベルは攪拌回転数の上昇により制御した。炭素源であるグリセロールは、培養スタート時に2%を添加し、その枯渇後は80%グリセロールを10ml/時間の流速で連続的に添加した。その結果、HPLC分析のピークエリアより算出されるBPの生産量から換算するに、培養48時間で2g/LのTHBPが生産されたことがわかった。(第18図)。〔実施例9 guaBA遺伝子の増幅効果によるビオプテリン類生産量の上昇〕PCRにより大腸菌(W3110株)ゲノムDNAよりguaBA遺伝子(Tiedeman,A.A.らJ.Biol.Chem.260:8676−8679,1985およびNucleic Acids Res.13:1303−1316,1985[GenBank M10101])のクローニングを行った。大腸菌(W3110株)ゲノムDNAは報告されている方法(生物工学実験書[培風館、p97−98])により調製した。センスプライマーP33(配列番号33)及びアンチセンスプライマーP34(配列番号34)を用いて常法に従いPCRを行い、大腸菌guaBA遺伝子を含有するDNAを取得した。次に、得られたguaBA遺伝子をベクターpCR2.1(Invitrogen)へサブクローニングし、pCR2.1−guaBAを作製した。次にpCR2.1−guaBAをBamHIおよびXhoIで切断後、guaBA遺伝子を含む3kbの断片をpMW218(ニッポンジーン)のBamHIおよびXhoI断片(3.9kb)と挿入してpMW218−guaBAを作製した(第19図)。このプラスミドを塩化カルシウム法によりAG14/pSTV28−GPS株に導入し、AG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)を作製した。形質転換株の選択および培養は、カナマイシン(25μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を含む培地で行った。作製された菌株を、実施例4に示した方法により培養し、HPLC分析のピークエリアより生産量を測定したところ580mg/LのBPが生産されたことがわかった(第1表)。〔実施例10 GCHの発現量増加によるビオプテリン類生産量の上昇〕pSTV28−GCHおよびpUC18−PTPSをEcoRIおよびSalIで処理してfolE遺伝子およびラットPTPS遺伝子を単離し、それぞれをpTWV228(宝酒造)のマルチクローニング部位に存在するEcoRIおよびSalI部位に挿入して、pTWV228−GCHおよびpTWV228−PTPSを作製した。同様にpUC19−SPRをHindIIIで処理してラットSPR遺伝子を単離し、pTWV229(宝酒造)のマルチクローニング部位に存在するHindIIIに挿入して、pTWV229−SPRを作製した。作製された3種のプラスミドのそれぞれをAG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)株に導入し、実施例4に示した方法によりビオプテリン類生産量を測定した。形質転換株の選択および培養には、アンピシリン(25μg/ml)、カナマイシン(25μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を含む培地で行った。作製された各菌の生産量は、AG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA,pTWV228−GCH)が524mg/L、AG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA,pTWV228−PTPS)が337mg/L,AG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA,pTWV229−SPR)が465mg/Lであった。またSDS−PAGEによる分析では新たにプラスミドが導入されたことより、各酵素の発現量が上昇していることが確認された。以上の結果より、THBP生産に関わる3種の酵素遺伝子については、その発現量を増加させることでビオプテリン類生産量を改善でき、特にGCH遺伝子の発現量を増加させることでビオプテリン類生産量をさらに改善できることが判った。〔実施例11 枯草菌GCH遺伝子(mtrA)の利用によるビオプテリン類生産の上昇〕PCRにより枯草菌(Bacillus subtilis 1A1株)ゲノムDNAより枯草菌GCH遺伝子であるmtrA(Gollnick,P.らProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8726−8730,1990,[GenBank M37320])のクローニングを行った。枯草菌ゲノムDNAは報告されている方法(遺伝子発現実験マニュアル[講談社サイエンティフィク、p31−33])により調製した。センスプライマーP35(配列番号35)及びアンチセンスプライマーP36(配列番号36)を用いて常法に従いPCRを行い、枯草菌mtrA遺伝子を含むDNAを取得した。次に、得られたPCR産物を鋳型にして、センスプライマーP37(配列番号37)及びアンチセンスプライマーP38(配列番号38)を用いてもう一度PCRを行った後、EcoRIおよびXbaIで切断後、pUC18のEcoRI−XbaI消化物と連結してpUC18−mtrAを作製した。次にpUC18−mtrAよりmtrA遺伝子をEcoRIおよびXbaIで切り出し、これをpSTV28−GPSのEcoRI−SphI消化物(3.0kb)およびpSTV28−GPSのXbaI−SphI消化物(1.4kb)と連結してpSTV28−MPSを作製した(第20図)。次に得られたpSTV28−MPSでAG14/pMW218−guaBA株を形質転換し、AG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)を作製し、実施例4に示した方法によりTHBP生産量を測定した。なお培養は、カナマイシン(25μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を含む培地で行った。その結果、枯草菌のGCH遺伝子を有する株[AG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)]は高いTHBP生産量(770mg/L)を示し、枯草菌のGCH遺伝子(mtrA)を用いることで、ビオプテリン類生産量がさらに向上することが示された(第1表)。〔実施例12 guaBA増幅株および枯草菌GCH遺伝子導入株のジャーファーメンターによる培養〕guaBA増幅株であるAG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)と枯草菌GCH遺伝子導入株であるAG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)について、実施例7および8の方法に従い2Lスケールの培養を行った。その結果、培養42時間においてHPLC分析のピークエリアより算出されるBPが、AG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)では2.4g/L、およびAG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)では4g/L生産された(第21図)。[実施例13 枯草菌用発現ベクターpDG148MPSおよびpDG148MPSΔIの作製]枯草菌用発現ベクターpDG148MPSおよびpDG148MPSΔIは以下の手順により作製した(1)pUC18SDの作製(第22図参照)相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドP39(配列番号39)とP40(配列番号40)を、一方でP41(配列番号41)とP42(配列番号42)を混合して2本鎖のDNA断片を2つ作製した。それぞれの断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼにより各5’末端にリン酸基を付加する反応を行った後、pUC18のHindIII−EcoRIのサイトにクローニングした。得られたプラスミドpUC18SDのHindIII−EcoRI間の約45bpの配列は、枯草菌の遺伝子発現に適したSD配列(シャイン・ダルガーノ配列)、およびMSNITNS(メチオニン−セリン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−アスパラギン−セリン)のアミノ酸配列で始まる翻訳開始領域をコードするDNA配列を含む。(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)(2)pUC18ΔEの作製(第23図参照)pUC18をEcoRIで完全に消化し、さらにMung Bean Nucleaseを加え37℃で15分間インキュベートし、エタノール沈殿にて精製し、ライゲーション反応を行いpUC18ΔEを作製した。得られたプラスミドはEcoRIで切断されないことを確認した。DNAシークエンシングによりEcoRIの認識配列5’−GAATTC−3’は5’−GATT−3’に変化していることを確認した。(3)pUC18ΔESDmtrAの作製(第24図参照)mtrA遺伝子のクローニングのため、枯草菌ゲノムDNAを鋳型にP43(配列番号43)およびP44(配列番号44)を用いてPCRを行い、次に増幅されたDNAを鋳型にして、P45(配列番号45)およびP46(配列番号46)、P45(配列番号45)およびP47(配列番号47)を用いてPCRを行い制限酵素部位を導入した。得られたDNA断片の末端をEcoRIおよびPstIで消化後、pUC18SDより調製したHindIII−EcoRI DNA断片(SD配列)とpUC18ΔE由来の2.6kb HindIII−PstI DNA断片とを連結し、pUC18ΔESDmtrAを作製した。第31図はpUC18ΔESDmtrA上にクローニングされたmtrAのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はmtrAのアミノ末端に付加されるCcpAタンパク由来のアミノ酸配列(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)を示す。(4)pUC18SDPTPSの作製(第25図参照)pUC18SDを鋳型とし、プライマーP50(配列番号50)とP48(配列番号48)を用いてPCRを行った後、得られたDNA断片の末端をXbaIおよびEcoRIで消化し、SD配列を含むDNA断片を調製した。同様に、実施例1において第4図で示す工程で作製したpUC18−PTPSを鋳型としてプライマーP50(配列番号50)とP49(配列番号49)を用いてPTPS遺伝子を含む0.45kbのEcoRI−SalI断片を調製した。これらをpUC18由来の2.6kb XbaI−SalIDNA断片と連結しpUC18SDPTPSを作製した。第32図はpUC18SDPTPS上にクローニングされたPTPSのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はPTPSのアミノ末端に付加されるCcpAタンパク由来のアミノ酸配列(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)を示す。(5)pUC18ΔESDSPRの作製(第26図参照)pUC18SDを鋳型とし、プライマーP51(配列番号51)とP53(配列番号53)を用いてPCRを行った後、得られたDNA断片の末端をSalIおよびEcoRIで消化し、SD配列を含むDNA断片を調製した。同様に、実施例1において第5図で示す工程で作製したpUC19−SPRを鋳型としてプライマーP52(配列番号52)とP53(配列番号53)を用いてSPR遺伝子を含む0.8kbのEcoRI−SphI断片を調製した。これらをpUC18ΔE由来の2.6kb SalI−SphI DNA断片と連結しpUC18ΔESDSPRを作製した。第33図はpUC18ΔESDSPR上にクローニングされたSPRのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はSPRのアミノ末端に付加されるCcpAタンパク由来のアミノ酸配列(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)を示す。(6)pSL1180PSの作製(第27図参照)上述のように第25図で示す工程で作製したpUC18SDPTPSをXbaIおよびSalIで消化し、0.5kbの断片(SD配列+PTPS)を調製した。次に、上述のように第26図で示す工程で作製したpUC18ΔESDSPRをSalIおよびSphIで消化し、0.85kbの断片(SD配列+SPR)を精製した。これらの断片をpSL1180のXbaI、SphI消化物(3.4kb)と連結し、pSL1180PSを作製した。(7)pSLII80MPSの作製(第28図参照)上述のように第24図で示す工程で作製したpUC18ΔESDmtrAをHindIIIおよびXbaIで消化し、0.63kb断片を調製し、これをpSL1180PSのHindIIIおよびXbaIで消化して得られる4.7kb断片と連結してpSL1180MPSを作製した。(8)枯草菌用発現ベクターpDG148MPSの作製(第29図参照)上述のように第28図で示す工程で作製したpSL1180MPSをHindIIIおよびSphIで消化し、mtrA、PTPS、SPR遺伝子を順に配置された2.0kbのDNA断片を調製した。一方、大腸菌および枯草菌に使用できるシャトルベクターpDG148(Karmazyn−Campelliら,Cell,52,697−704,1988)をHindIIIおよびSphIで消化して8.2kbのDNA断片を調製し、先の2.0kbのDNA断片と連結して枯草菌用発現ベクターpDG148MPSを作製した。なお、第29図において、Pspacはspacプロモーターを、lacIはlacI遺伝子を、lacOはlacIタンパクによる発現調節領域を、Kmはカナマイシン耐性遺伝子を、Apはアンピシリン耐性遺伝子を、oriはプラスミドの複製開始点を表す。この発現ベクターpDG148MPSは、spacプロモーター(Pspac)の下流にlacO配列を、またマルチクローニングサイトの下流に枯草菌内で発現が誘導されるlacI遺伝子がコードされている。したがって枯草菌内ではlacIタンパクによりspacプロモーターによる転写は抑制されている。しかしながら、培地中に誘導物質であるIPTGを添加することにより、spacプロモーターによる転写が活性化し、下流の遺伝子の発現が誘導される。mtrA、PTPS、SPR遺伝子の上流にはそれぞれ枯草菌の遺伝子発現に適したSD配列およびMSNITNS(メチオニン−セリン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−アスパラギン−セリン)のアミノ酸配列で始まる翻訳開始領域をコードするDNA配列を配置してある。オペロン様に配置されたこれら3遺伝子はspacプロモーターにより転写が誘導される。(9)枯草菌用発現ベクターpDG148MPSΔIの作製(第30図参照)上述のように第28図で示す工程で作製したpSL1180MPSを制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化し、mtrA、PTPS、SPR遺伝子を順に配置した2.0kbのDNA断片を調製した。これを、上述のpDG148のHindIIIおよびBamHI消化物(6.9kb)と連結させ枯草菌用発現ベクターpDG148MPSΔIを作製した。なお、第30図において、Pspacはspacプロモーターを、lacOはlacIタンパクによる発現調節領域を、Kmはカナマイシン耐性遺伝子を、Apはアンピシリン耐性遺伝子を、oriはプラスミドの複製開始点を表す。この発現ベクターpDG148MPSΔIは、spacプロモーター(Pspac)の下流にlacO配列を有しているが、pDG148からlacI遺伝子部分を欠失させているため、枯草菌内ではspacプロモーターに対する抑制は生じない。したがって下流の遺伝子の発現は恒常的に誘導されている。mtrA、PTPS、SPR遺伝子の上流にはそれぞれ枯草菌の遺伝子発現に適したSD配列およびMSNITNSのアミノ酸配列で始まる翻訳開始領域をコードするDNA配列を配置してある。オペロン様に配置されたこれら3遺伝子はspacプロモーターにより転写が誘導される。[実施例14 Bacillus subtilisによるビオプテリン類の生産]Bacillus subtilis 1A1株(trpC2)(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)を以下の方法によりpDG148MPSまたはpDG148MPSΔIで形質転換した。形質転換に使用したpDG148MPSおよびpDG148MPSΔIの各プラスミドは、大腸菌と枯草菌の両方に形質転換可能なシャトルベクターpDG148(Karmazyn−Campelliら,Cell,52,697−704,1988)由来のベクターであり、大腸菌においてはアンピシリン耐性が、枯草菌においてはカナマイシン耐性が選択マーカーとして利用できる。TBABGプレートに枯草菌1A1株をストリークし、12時間の前培養を行った。[TBABGプレート1L中の組成:トリプトン10g、Beef Extract 3g、NaCl 5g、寒天末15g、グルコース1.8g]プレートから菌体をかきとり、2mlのCI培地に懸濁した。[CI培地の組成:(NH4)2SO4 0.2%、K2HPO4 1.4%、KH2PO4 0.6%、Na3Citrate・2H2O 0.1%、MgSO4 5mM、glucose 0.5%、カザミノ酸(casamino acid)0.02%、トリプトファン(trp)50μg/ml]得られた懸濁液をOD600nm=0.08になるようにCI培地で希釈し、37℃にて振盪培養を行った。培養中適宜OD600nm値を測定し、増殖が定常期に入るのを確認した。2.5mlの培養液を遠心分離(2500rpm、10分、室温(RT))し、集菌したものを5mlのCII培地に懸濁し、30分程度振盪培養を行い、コンピテントセルとした。[CII培地の組成:(NH4)2SO4 0.2%、K2HPO4 1.4%、KH2PO4 0.6%、Na3Citrate・2H2O 0.1%、MgSO4 5mM、glucose 0.5%、カザミノ酸(casamino acid)0.01%、トリプトファン(trp)5μg/ml]コンピテントセル1mlに対し、recA+株である大腸菌JM101株より調製したpDG148MPSあるいはpDG148MPSΔIを1μg混合し、37℃で2時間緩やかに振盪培養を行った。その後、培養液を5μg/mlのカナマイシンを含むTBABGプレートにストリークし、37℃で約12時間培養し、1A1/pDG148MPS、1A1/pDG148MPSΔIの各形質転換体を得た。得られた各形質転換体コロニーを3mlの5μg/mlのカナマイシン(Km)を含むLB培地にて約3時間前培養を行った。その後、2%glucose、1mM IPTG、5μg/ml Kmを含むNU培地(3.5ml)に接種し、20時間振盪培養を37℃において行った。同様に各株のコントロールとして枯草菌1A1株についてもカナマイシンを含まない培地において同様の培養を行った。[NU培地の組成(1Lあたり):酵母エキス 4g、KH2PO4 4g、K2HPO4 4g、Na2HPO4 2.8g、NH4Cl 0.2g、MgSO4・7H2O 2g、FeSO4 0.04g、CaCl2・2H2O 0.04g、MnSO4・5H2O 0.01g、AlCl3・6H2O 0.01g、CoCl2・6H2O 0.004g、ZnSO4・7H2O 0.002g、Na2MoO4・2H2O 0.002g、CuCl2・2H2O 0.001g、H3BO3 0.0005g]その結果、コントロールの株を含め全ての株において、OD600nmの値は10−12を示した。菌体の増殖は良好であり、形質転換およびIPTG添加による発現誘導の影響は認められなかった。培養開始後20時間における培養上清を実施例4に記載の方法で酸化処理し、HPLC分析に供した。HPLC分析結果を第34図に示す。プラスミドを導入していない1A1株(右端)では標準品BPの溶出位置にピークを認められなかったが、他2株(1A1/pDG148MPS、1A1/pDG148MPSΔI)についてはBP標準品の溶出位置にピークを認めることができ、作製した枯草菌がBP生産能を有することが明らかとなった。ピークエリアの面積比から計算すると、BPの生産量はいずれも約0.45μg/mlであった。産業上の利用可能性本発明は、薬理効果が期待されるビオプテリン類を、安価な培地原料をもとにし、大量に工業的に生産できるという効果を奏す。その結果、ビオプテリン類、特にその薬理作用についての研究を行いやすくなり、新規医薬の開発を促進することができる。また、本発明は、THBPの酸化物であるDHBPおよびBPの生産が可能となるという効果を奏す。その結果、ビオプテリン類の代謝についての研究が行いやすくなる。【配列表】【図面の簡単な説明】第1図は、テトラヒドロビオプテリンの生合成経路を示す。第2図は、テトラヒドロビオプテリンの酸化・分解経路を示す。第3図は、pSTV28−GCHの作製工程を示す。なお、PCR(P1、P2)は、センスプライマーP1とアンチセンスプライマーP2を用いたPCRを表す。PCR(P3、P4)およびPCR(P5、P6)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、Cmはクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。また、trcは、trcプロモーターを表し、lacはlacプロモーターを表す。第4図は、pUC18−PTPSの作製工程を示す。なお、PCR(P7、P8)は、センスプライマーP7とアンチセンスプライマーP8を用いたPCRを表す。PCR(P9、P10)およびPCR(P11、P12)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、trcは、trcプロモーターを表し、lacはlacプロモーターを表す。第5図は、pUC19−PTPSの作製工程を示す。なお、PCR(P13、P14)は、センスプライマーP13とアンチセンスプライマーP14を用いたPCRを表す。PCR(P15、P16)およびPCR(P17、P18)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、trcは、trcプロモーターを表し、lacはlacプロモーターを表す。第6図は、pYES2−FOL2の作製工程を示す。なお、PCR(P23、P24)は、センスプライマーP23とアンチセンスプライマーP24を用いたPCRを表す。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、URA3は酵母での選択マーカーを表す。PGAL1はGAL1プロモーターを表し、CYC1 TTはCYC1遺伝子の転写終結シグナルを表す。第7図は、pSTV28−GPSの作製工程を示す。なお、PCR(P19、P20)は、センスプライマーP19とアンチセンスプライマーP20を用いたPCRを表す。PCR(P21、P22)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、Cmはクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。Oriは複製起点を表す。第8図は、pYES2−PTPSおよびpYES2−SPRの作製工程を示す。なお、PCR(P25、P26)は、センスプライマーP25とアンチセンスプライマーP26を用いたPCRを表す。PCR(P27、P28)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、URA3は酵母での選択マーカーとして用いたURA3遺伝子を表す。lacはlacプロモーターを表し、PGAL1はGAL1プロモーターを表し、CYC1 TTはCYC1遺伝子の転写終結シグナルを表す。第9図は、pYES2−FPSの作製工程を示す。なお、PCR(P29、P30)は、センスプライマーP29とアンチセンスプライマーP30を用いたPCRを表す。PCR(P31、P32)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、URA3は酵母での選択マーカーを表す。また、PGAL1はGAL1プロモーターを表し、CYC1 TTはCYC1遺伝子の転写終結シグナルを表す。第10図は、pSTV28−GCH上にクローニングされたGCHのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部は、GCHのアミノ末端に付加されるpSTV28由来の配列を示す。第11図は、pUC18−PTPS上にクローニングされたPTPSのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部は、PTPSのアミノ末端に付加されるpUC18由来の配列を示す。第12図は、pUC19−SPR上にクローニングされたSPRのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部は、SPRのアミノ末端に付加されるpUC19由来の配列を示す。第13図は、ビオプテリン類生産大腸菌JM101/pSTV28−GPSの培養上清のC18逆相カラムによるHPLC分析の結果を示す。第14図は、ビオプテリン類生産酵母(FPS株)の増殖曲線を示す。第15図は、ビオプテリン類生産酵母(FPS株)の培養上清のC18逆相カラムによるHPLC分析の結果を示す。第16図は、ビオプテリン類生産酵母(FPS株)の培養上清のTLC分析の結果を示す。第17図は、ビオプテリン類生産大腸菌AG14/pSTV28−GPSの培養上清のC18逆相カラムによるHPLC分析の結果を示す。第18図は、ビオプテリン類生産大腸菌AG14/pSTV28−GPSの培養におけるOD660およびBP生産量ならびにP生産量の経時変化を示す。第19図は、pMW218−guaBAの作製工程を示す。なお、PCR(P33、P34)は、センスプライマーP33とアンチセンスプライマーP34を用いたPCRを表す。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、kmはカナマイシン耐性遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第20図は、pSTV28−MPSの作製工程を示す。なお、PCR(P35、P36)は、センスプライマーP35とアンチセンスプライマーP36を用いたPCRを表す。PCR(P37、P38)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を表し、kmはカナマイシン耐性遺伝子を表す。また、Oriは複製起点を表す。第21図は、AG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)とAG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)の培養時のOD660とBP生産量の経時変化を示す。なお、■はAG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)のOD660の経時変化を示し、●はAG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)のOD660の経時変化を示し、□はAG14/(pSTV28−GPS,pMW218−guaBA)のBP生産量の経時変化を示し、○はAG14/(pSTV28−MPS,pMW218−guaBA)のBP生産量の経時変化を示す。第22図は、pUC18SDの作製工程を示す。なお、Apはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第23図は、pUC18ΔEの作製工程を示す。なお、Apはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第24図は、pUC18ΔESDmtrAの作製工程を示す。なお、PCR(P43、P44)は、センスプライマーP43とアンチセンスプライマーP44を用いたPCRを表す。PCR(P45、P46)およびPCR(P45、P47)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を、mtrAはmtrA遺伝子を、SDはSD配列および翻訳開始領域をコードするDNA配列を含む遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第25図は、pUC18SDPTPSの作製工程を示す。なお、PCR(P50、P48)は、センスプライマーP50とアンチセンスプライマーP48を用いたPCRを表す。PCR(P50、P49)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を、PTPSはPTPS遺伝子を、SDはSD配列および翻訳開始領域をコードするDNA配列を含む遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第26図は、pUC18ΔESDSPRの作製工程を示す。なお、PCR(P53、P51)は、センスプライマーP53とアンチセンスプライマーP51を用いたPCRを表す。PCR(P53、P52)も同様である。Apはアンピシリン耐性遺伝子を、SPRはSPR遺伝子を、SDはSD配列および翻訳開始領域をコードするDNA配列を含む遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第27図は、pSL1180PSの作製工程を示す。なお、Apはアンピシリン耐性遺伝子を、PTPSはPTPS遺伝子を、SPRはSPR遺伝子を、SDはSD配列および翻訳開始領域をコードするDNA配列を含む遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第28図は、pSL1180MPSの作製工程を示す。なお、Apはアンピシリン耐性遺伝子を、PTPSはPTPS遺伝子を、SPRはSPR遺伝子を、mtrAはmtrA遺伝子を、SDはSD配列および翻訳開始領域をコードするDNA配列を含む遺伝子を表す。また、lacはlacプロモーターを表す。第29図は、pDG148MPSの作製工程を示す。なお、Kmはカナマイシン耐性遺伝子を、Apはアンピシリン耐性遺伝子を、PTPSはPTPS遺伝子を、SPRはSPR遺伝子を、mtrAはmtrA遺伝子を表す。Pspacはspacプロモーターを、lacOはlacO遺伝子を、lacIはlacI遺伝子を表す。Oriは複製起点を表す。第30図は、pDG148MPSΔIの作製工程を示す。なお、Kmはカナマイシン耐性遺伝子を、Apはアンピシリン耐性遺伝子を、PTPSはPTPS遺伝子を、SPRはSPR遺伝子を、mtrAはmtrA遺伝子を表す。Pspacはspacプロモーターを、lacOはlacO遺伝子を、lacIはlacI遺伝子を表す。Oriは複製起点を表す。第31図は、pUC18ΔESDmtrA上にクローニングされたmtrAのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はmtrAのアミノ末端に付加されるCcpAタンパク由来のアミノ酸配列(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)およびそれに対応する塩基配列を示す。第32図は、pUC18SDPTPS上にクローニングされたPTPSのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はPTPSのアミノ末端に付加されるCcpAタンパク由来のアミノ酸配列(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)およびそれに対応する塩基配列を示す。第33図は、pUC18ΔESDSPR上にクローニングされたSPRのDNA塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はSPRのアミノ末端に付加されるCcpAタンパク由来のアミノ酸配列(Fujitaら、Microbiology,140:6571−6580,1998)およびそれに対応する塩基配列を示す。第34図は、本発明に係る形質転換細胞である1A1/pDG148MPSおよび1A1/pDG148MPSΔI、ならびに比較例としてのBacillus subtilis 1A1株の培養上清のHPLCによる分析結果を示す。 形質転換した細胞によりビオプテリン類を製造する方法であって、(a)テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子の少なくとも一つで宿主細胞を形質転換し、(b)得られた形質転換細胞を培養してテトラヒドロビオプテリンを生産し、(c)所望により、生産されたテトラヒドロビオプテリンを酸化し、(d)生産されたテトラヒドロビオプテリン、ならびに該テトラヒドロビオプテリンが酸化されたジヒドロビオプテリンおよびビオプテリンからなる群から選ばれる1種以上のビオプテリン類を採取することを特徴とするビオプテリン類の製造方法。 請求の範囲第1項に記載のビオプテリン類の製造方法において、培養液中またはその処理物中のビオプテリン類を酸化した後、ビオプテリンを採取することを特徴とする請求の範囲第1項に記載のビオプテリン類の製造方法。 請求の範囲第1項または第2項に記載のビオプテリン類の製造方法において、採取したジヒドロビオプテリンおよび/またはビオプテリンを還元してテトラヒドロビオプテリンを製造することを特徴とする請求の範囲第1項または第2項に記載のビオプテリン類の製造方法。 テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素が、GTPシクロヒドラーゼI、6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素およびセピアプテリン還元酵素からなる群から選ばれる1〜3種類の酵素であることを特徴とする請求の範囲第1項〜第3項に記載のビオプテリン類の製造方法。 形質転換を6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子およびセピアプテリン還元酵素の遺伝子を有する発現ベクターにより行うことを特徴とする請求の範囲第1項〜第3項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のGTPシクロヒドラーゼI活性以上のGTPシクロヒドラーゼI活性を有する変異型細胞であることを特徴とする請求の範囲第5項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞に導入するGTPシクロヒドラーゼI遺伝子が、枯草菌由来のmtrA遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第4項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞が、原核生物細胞である請求の範囲第1項〜第7項に記載のビオプテリン類の製造方法。 原核生物が、大腸菌、枯草菌または放線菌である請求の範囲第8項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞が、真核生物細胞である請求の範囲第1項〜第7項に記載のビオプテリン類の製造方法。 真核生物が、酵母または糸状菌である請求の範囲第10項に記載のビオプテリン類の製造方法。 酵母が、メタノール資化酵母または分裂酵母である請求の範囲第11に記載のビオプテリン類の製造方法。 酵母が、サッカロマイセス酵母である請求の範囲第11項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞が、野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする請求の範囲第1項〜第13項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞が、野生型細胞が有する8−アザグアニン耐性以上の8−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする請求の範囲第14項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞が、IMPデヒドロデナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求の範囲第14項または第15項に記載のビオプテリン類の製造方法。 宿主細胞に、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子を導入した請求の範囲第1項〜第16項に記載のビオプテリン類の製造に用いる形質転換細胞。 宿主細胞が、野生型細胞が有するGTP合成能以上のGTP合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする請求の範囲第17項に記載の形質転換細胞。 宿主細胞が、野生型細胞が有する8−アザグアニン耐性以上の8−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする請求の範囲第18項に記載の形質転換細胞。 宿主細胞が、IMPデヒドロデナーゼおよびGMPシンターゼをコードするguaBA遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求の範囲第18項または第19項に記載の形質転換細胞。 宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のGTPシクロヒドラーゼI活性以上のGTPシクロヒドラーゼI活性を有する変異型細胞であって、該宿主細胞に6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子およびセピアプテリン還元酵素の遺伝子を導入した請求の範囲第18項に記載の形質転換細胞。 宿主細胞に導入するGTPシクロヒドラーゼI遺伝子が、枯草菌由来のmtrA遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第17項〜第21項に記載の形質転換細胞。 本発明は、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子の少なくとも一つで形質転換されている形質転換細胞、およびそれを用いたビオプテリン類の製造方法を提供し、本発明によればビオプテリン類を安価な原料から大量に工業的に有利に生産することができる。


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