生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原 |
| 出願番号： | 2000562398 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C07K 14/82,A61K 39/00,A61P 35/00,A61P 35/02,C07K 7/00 |
特許情報キャッシュ
杉山 治夫 岡 芳弘 JP 4422903 特許公報(B2) 20091211 2000562398 19990730 癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原 株式会社癌免疫研究所 505443953 高島 一 100080791 杉山 治夫 岡 芳弘 JP 1998218093 19980731 20100303 C07K 14/82 20060101AFI20100210BHJP A61K 39/00 20060101ALI20100210BHJP A61P 35/00 20060101ALI20100210BHJP A61P 35/02 20060101ALI20100210BHJP C07K 7/00 20060101ALI20100210BHJP JPC07K14/82A61K39/00 HA61P35/00A61P35/02C07K7/00 C07K 14/00 C07K 7/00 C12N 15/00 CA/REGISTRY/MEDLINE/WPIDS/BIOSIS(STN) 米国特許第０５７２６２８８（ＵＳ，Ａ） 米国特許第０５６２２８３５（ＵＳ，Ａ） 特表２００２−５２５０９９（ＪＰ，Ａ） Mol Cell Biol.(1991),Vol.11,No.3,p.1707-1712 Curr Opin Immunol.(1993),Vol.5,No.5,p.719-725 Curr Opin Immunol.(1993),Vol.5,No.5,p.709-713 Immunogenetics(1995),Vol.41,No.4,p.178-228 2 JP1999004130 19990730 WO2000006602 20000210 21 20060712 ▲高▼ 美葉子 技術分野本発明は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の産物に基づく癌抗原に関する。この癌抗原は、白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、又は固形癌、例えば胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等、並びにさらにはＷＴ１を発現するすべての癌に対する抗癌ワクチンとして有用である。背景技術異物を排除するための免疫機構には、一般に、抗原を認識して抗原提示細胞として機能するマクロファージ、該マクロファージの抗原提示を認識して種々のリンホカインを産生して他のＴ−細胞等を活性化するヘルパーＴ−細胞、該リンホカインの作用により抗体産生細胞に分化するＢ−リンパ球等が関与する液性免疫と、抗原の提示を受けて分化したキラーＴ−細胞が標的細胞を攻撃し破壊する細胞性免疫とがある。現在のところ、癌の免疫は主として、キラーＴ−細胞が関与する細胞性免疫によるものと考えられている。キラーＴ−細胞による癌免疫においては、主要組織適合抗原（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）クラスＩと癌抗原との複合体の形で提示された癌抗原を認識した前駆体Ｔ−細胞が分化増殖して生成したキラーＴ−細胞が癌細胞を攻撃し、破壊する。この際、癌細胞はＭＨＣクラスＩ抗原と癌抗原との複合体をその細胞表面に提示しており、これがキラーＴ−細胞の標的とされる（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，７０９，１９９３；Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，７１９，１９９３；Ｃｅｌｌ，８２，１３，１９９５；Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ，１４６，１６７，１９９５）。標的細胞である癌細胞上にＭＨＣクラスＩ抗原により提示される前記の癌抗原は、癌細胞内で合成された抗原蛋白質が細胞内プロテアーゼによりプロセシングされて生成した約８〜１２個のアミノ酸から成るペプチドであると考えられている（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，７０９，１９９３；Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，７１９，１９９３；Ｃｅｌｌ，８２，１３，１９９５：Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１４６，１６７，１９９５）。現在、種々の癌について抗原蛋白質の検索が行われているが、癌特異抗原として証明されているものは少ない。Ｗｉｌｍｓ腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１（ＷＴ１遺伝子）は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神発達遅滞などを合併するＷＡＧＲ症候群の解析からＷｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして染色体１１ｐ１３から単離された（Ｇｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４３，ｐ．７７４−７７８（１９９０））ものであり、ゲノムＤＮＡは約５０ｋｂで１０のエキソンから成り、そのｃＤＮＡは約３ｋｂである。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，１７０７，１９９１）。ＷＴ１遺伝子はヒト白血病で高発現しており、白血病細胞をＷＴ１アンチセンスオリゴマーで処理するとその細胞増殖が抑制される（特開平９−１０４６２７号公報）ことなどから、ＷＴ１遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。さらに、ＷＴ１遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現しており（特願平９−１９１６３５）、ＷＴ１遺伝子は白血病及び固形癌における新しい腫瘍マーカーであることが判明した。しかしながら、ＷＴ１遺伝子発現生成物が癌ワクチンとして有用な癌特異抗原であることは立証されていない。発明の開示従って本発明は、ＷＴ１遺伝子発現生成物が癌抗原である可能性を確認し、新規な癌抗原を提供しようとするものである。本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、ＷＴ１遺伝子の発現生成物のアミノ酸配列中で、マウス及びヒトのＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩとの結合において、アンカーアミノ酸として機能すると予想される少なくとも１個のアミノ酸を含有する連続する７〜３０個のアミノ酸から成るポリペプチドを合成し、これらのペプチドがＭＨＣ蛋白質と結合することを確認すると共に、ＭＨＣクラスＩ抗原と結合した場合にキラーＴ−細胞を誘導し、且つ標的細胞に殺細胞効果を及ぼすことを確認して本発明を完成した。従って本発明は、マウスＷＴ１発現産物、又はその部分を含んで成る癌抗原を提供する。好ましい態様において、本発明は、ＷＴ１のｃＤＮＡに対応する配列番号：１に示すアミノ酸配列において、ＭＨＣ抗原との結合のためのアンカーアミノ酸を含む６〜３０個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原を提供する。さらに、本発明は、ヒトＷＴ１のｃＤＮＡに対応する配列番号：２に示すアミノ酸配列において、ＭＨＣ抗原との結合のためのアンカーアミノ酸を含む７〜３０個のアミノ酸から成るペプチドを活性成分とする癌抗原を提供する。本発明はまた、上記の癌抗原を含んで成る癌ワクチンを提供する。発明の実施の形態本発明においては、癌抗原ペプチドを設計する際の基礎として、マウスＭＨＣクラスＩのＫｂ及びＤｂ、並びにヒトＨＬＡのＡ＊０２０１を選択し、これらと高い親和性を有すると予想されるペプチドを選択した。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ．４１，ｐ．１７８−２２８（１９９５）の記載から、Ｋｂへの結合のアンカーアミノ酸として５番目のＰｈｅ及びＴｒｙ並びに８番目のＬｅｕ及びＭｅｔ等が予想され、またＤｂへの結合のアンカーアミノ酸として５番目のＡｓｎ並びに９番目のＭｅｔ及びＩｌｅ等が予想される。また、癌細胞の表面においてＭＨＣクラスＩにより提示される癌抗原ペプチドのサイズはおよそ８〜１２個であることが知られている。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、配列番号：１に示すＷＴ１遺伝子産物のアミノ酸配列において、アンカーアミノ酸を含む、連続する７〜３０個のアミノ酸から成るペプチドである。アミノ酸の数は好ましくは８〜１２個であり、例えば８又は９個である。本発明においては、その具体例として、ＭＨＣクラスＩのＫｂに結合するペプチドとして、アミノ酸８個からなる下記ペプチド：Ｋｂ ４５ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ（配列番号：３）Ｋｂ３３０ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ（配列番号：４）ＭＨＣクラスＩのＤｂに結合するペプチドとして、アミノ酸９個から成る下記のペプチド：Ｄｂ１２６ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：５）Ｄｂ２２１ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｍｅｔ（配列番号：６）Ｄｂ２３５ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：７）を使用した。上記配列において下線を付したアミノ酸がアンカーとして機能すると予想されるアミノ酸である。次に、これらのペプチドの内、Ｋｂ４５及びＫｂ３３０についてはＭＨＣクラスＩのＫｂとの結合性を、Ｄｂ１２６，Ｄｂ２２１及びＤｂ２３５についてはＭＨＣクラスＩのＤｂとの結合性を、抗原ペプチドを提示していないが（ｅｍｐｔｙ）、Ｋｂ及びＤｂは発現されているセルライン（ＲＭＡ−Ｓ）を用いて測定した。すなわち、ＲＭＡ−Ｓを２６℃にて培養してＭＨＣクラスＩを高発現せしめ、この培養細胞を被験ペプチド溶液と３７℃にて１時間インキュベートした。これにより、ペプチドと結合しないＭＨＣ分子は不安定になって細胞表面から消失し、ペプチドを結合したＭＨＣクラスＩ分子のみが残る。２次に、ＭＨＣクラスＩ（Ｋｂ，Ｄｂ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体によりＲＭＡ−Ｓ細胞を染色した。最後に、ＦＡＣＳ解析により、細胞当りの平均蛍光量から結合解離定数を計算した（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，４７，１，１９９５）。その結果、次の結果が得られた。Ｋｂ ４５ −４．５７８４８３８（ｌｏｇ）Ｋｂ３３０ −５．７６１７７３２Ｄｂ１２６ −６．２８３４９６８Ｄｂ２２１ −５．７５４５３９８Ｄｂ２３５ −６．１４５７６２４以上の通り、いずれもＫｂ又はＤｂと強〜中程度の結合親和性（ｋｄ値）を有しているが、最も高い結合親和性を示すＤｂ１２６ペプチドを以後の実験において用いた。また、ヒトについては、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ．４１，ｐ．１７８−２２８（１９９５）の記載から、ヒトのＨＬＡ−Ａ＊０２０１への結合アンカーアミノ酸として、Ｎ−末端から２番目のＬｅｕ及びＭｅｔ、並びにＮ−末端から９番目のＶａｌ及びＬｅｕが予想される。そこで、ヒトＷＴ１蛋白質のアミノ酸配列（Ｍｏｌ．Ｃｏｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１，ｐ．１７０７−１７１２，１９９１）（配列番号：２）中で、上の条件に合致する、９個のアミノ酸から成る２種類のペプチドを合成した。Ｄｂ１２６；Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：５）（マウスにおけるＤｂ１２６の配列と同じ）ＷＨ１８７；Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ（配列番号：８）（下線はアンカーアミノ酸を示す。）上記ペプチドと、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合能を次のようにして測定した。上記ペプチドと、ｅｍｐｔｙなＨＬＡ−Ａ＊０２０１をもつＴ２細胞（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０，１７６３，１９９３；Ｂｌｏｏｄ，８８，２４５０，１９９６）を３７℃、１時間インキュベート後、ＨＬＡ−Ａ２．１を認識する蛍光標識モノクローナル抗体で、Ｔ２細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析で、細胞当りの平均蛍光量から結合解離定数を計算した。結 合 能ペプチド Ｋｄ（Ｍ）Ｄｂ１２６ １．８９×１０−５ＷＨ１８７ ７．６１×１０−６２種類のペプチドは、ともに中等度以上の結合親和性を有する。ヒトＭＨＣに対応するペプチドとして、上記Ｄｂ１２６及びＷＨ１８７を用いて、以下の実験を行った。本発明はまた前記抗原を有効成分とする癌ワクチンに関する。このワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。このワクチンは、経口投与、又は非経口投与、例えば腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与、鼻腔内投与等により投与することができる。さらに、本発明のワクチンの投与方法として、患者の末梢血から単核球を集め、その中から樹状細胞を取り出し、本発明のペプチドをパルスして患者に皮下投与などで患者に戻す方法も行われる。ワクチンは、前記有効成分としての投与ペプチドのほかに、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバンド、例えば水酸化アルミニウムのごとき鉱物ゲル；リソレシチン、プルロニックポリオールのごとき界面活性剤；ポリアニオン；ペプチド；又は油乳濁液を含むことができる。あるいは、リポゾーム中へ混合し、又は多糖及び／又はワクチン中に配合される他の集合体を含むことができる。投与量は一般に、１日当り０．１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。本発明はまた、上記のポリペプチドワクチンをコードするＤＮＡもワクチン（ＤＮＡワクチン）として使用することができる。すなわち、ＷＴ１又はその部分をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを、適切なベクター、好ましくは発現ベクターに挿入した後、動物に投与することにより、癌免疫を生じさせることができる。その具体例を実施例９に示す。実施例次に、実施例により、本発明のペプチドが癌抗原及び癌ワクチンとして有用なことを、明らかにする。実施例１Ｄｂ１２６ペプチド１００μｇ、ブタ由来の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）２００μｇ、及びフロイント不完全アジュバント０．５ｍｌをＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に、１週毎に２回注射して免疫処理した。この免疫処理の１週間後にマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞の浮遊液を調製した。他方、Ｄｂ１２６ペプチドをパルスした同系マウスの放射線照射脾細胞を、ペプチド５０μｇ／ｍｌを含む溶液と３７℃にて３０分間インキュベートし、抗原提示細胞とした。前記の免疫処理した脾細胞と放射線照射した脾細胞を混合して、５日間共培養し、キラーＴ−細胞を誘導調製した。他方Ｄｂ１２６ペプチドによりパルス（１００μｇ／ｍｌのペプチド溶液と３７℃にて３０分間インキュベート）したＥｕｒｏｐｉｕｍラベルＥＬ−４細胞（Ｋｂ及びＤｂを発現している）を標的細胞とし、通常の方法を用いて、次の操作によりＫｉｌｌｉｎｇアッセイを行った（表１）。その結果、Ｄｂ１２６をパルスしたＥＬ−４細胞を標的にした場合は、殺細胞効果が見られたが、Ｄｂ１２６をパルスしていないＥＬ−４細胞標的した場合は、殺細胞効果はほとんど見られなかった。次に、Ｋｉｌｌｉｎｇアッセイにより有意な殺細胞効果を示した脾細胞試料を、蛍光標識した抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ８抗体で染色しフローサイトメトリーにより、ＣＤ４及びＣＤ８の発現を解析した。その結果、図１に示すごとく、非免疫対照細胞に比べて、Ｄｂ１２６ペプチドで免疫処理した脾細胞においては、キラーＴ−細胞により代表されるＣＤ８＋細胞が増加し、ヘルパーＴ−細胞等により代表されるＣＤ４＋細胞に対するＣＤ８−細胞の比率が逆転増加していた。実施例２Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄由来の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ；ＤＣ）を次の様にして調製した。常法に従い、骨髄細胞をＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養し、骨髄由来樹状細胞を調製した（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２５５，１９９５）。７日間培養した樹状細胞と１０μＭのＯＶＡＩＩ（Ｏｖａｌｂｕｍ ｉｎ ＩＩ）及び１μＭのＤｂ１２６ペプチドと共に３時間インキュベートした後、洗浄した。次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのｆｏｏｔ ｐａｄｓとｈａｎｄｓとに上記ＤＣ細胞を皮内注射し、５日目に所属リンパ節を取り出し、細胞浮遊液を調製した。他方、Ｄｂ１２６ペプチドでパルスし、放射線照射したＢ７．１−ＲＭＡ−Ｓ細胞（Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅであるＢ７．１をコードする遺伝子をトランスフェクトしたＲＭＡ−Ｓ細胞）を調製した。次に、上記のリンパ節由来細胞浮遊液とＢ７．１−ＲＭＡ−Ｓ細胞とを混合して培養することによりインビトロで再刺激した。次に、インビトロでの再刺激の５日目に、５１ＣｒでラベルしたＲＭＡ−Ｓ細胞を標的としてＫｉｌｌｉｎｇアッセイを行った。再刺激５日目に回収されたリンパ球全体の１／８をエフェクター細胞として用いた時を、最大のＥ／Ｔ比（１．０）とした。図２及び図３に示すごとく、Ｄｂ１２６ペプチドにより免疫されたマウスのリンパ節由来のエフェクター細胞は、該ペプチドでパルスされた標的細胞を殺したのに対して、該ペプチドでパルスされない標的細胞は殺さなかった。また、実施例１と同様にして行ったフローサイトメトリーでＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の比を解析したところ、ＣＤ４：ＣＤ８−１：１．４〜１．７であり、非免疫マウス細胞（対照）に比べて、Ｄｂ１２６ペプチドで免疫されたマウス細胞においては、ＣＤ８＋細胞が増加し、ＣＤ４＋細胞：ＣＤ８＋細胞の比（対照細胞においては約２：１）が免疫された細胞においては逆転していた。実施例３ペプチドＤｂ１２６又はＷＨ１８７（４０μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベートした後に放射線照射したＴ２細胞５×１０４個とＨＬＡ−Ａ＊０２０１をもつ健常人の末梢単核球１×１０６個とを共培養した。一週間後、ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベートした後に放射線照射したＴ２細胞を上記の共培養系に加え、再刺激を行なった。その翌日から、ヒトＩＬ−２（最終濃度１００ ＪＲＵ／ｍｌ）を培養液に加えた。以後、ペプチドでパルス後に放射線照射されたＴ２細胞での刺激を５回くり返した後、ペプチドをパルスされたＴ２細胞、あるいは、ペプチドをパルスされていないＴ２細胞を標的にして、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行なった。また、誘導されたＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳ解析した。Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙは常法に従いＥｕｒｏｐｉｕｍでラベルしたＴ２細胞にペプチドをパルスしたものを標的として行った。Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｔａｒｇｅｔ比（Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ）は１０：１共培養時間：３時間培養液中のペプチド濃度：５μｇ／ｍｌ結果を図４に示す。図４のＡはＤｂ１２６ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、Ｄｂ１２６ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示し、図４のＢはＷＨ１８７ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、ＷＨ１８７ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示す。いずれの場合でも、ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対してより強い殺細胞効果が見られた。ＦＡＣＳ解析の結果を図５〜図１０に示す。図５〜７にＤｂ１２６ペプチドで誘導したヒトのＣＴＬの結果を示し、ほとんどの細胞がＣＤ８陽性であった。図８〜図１０はＷＨ１８７ペプチドで誘導されたヒトのＣＴＬの結果を示す。ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞がほぼ同数であった。実施例４Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解活性のＭＨＣ拘束性を試験するため、ペプチドでパルスしたＴ２細胞に対するＣＴＬの細胞毒性活性をブロックするために抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体を用いた。Ｄｂ１２６ペプチドでパルスしたＴ２細胞の特異的細胞溶解を５：１のＥ／Ｔ比において、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対するブロッキングモノクローナル抗体（ＢＢ７．２）の存在下又は不存在下で測定した。結果を図１１に示す。この図において＊印は抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体の代りに抗Ｈ−２Ｋｂモノクローナル抗体を使用した結果を示す。この図から明らかな通り、６０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−Ａ２．１モノクローナル抗体の添加により、細胞毒性は、Ｔ２細胞の細胞溶解のバックグラウンドまで低下した。アイソタイプが同じ無関係のモノクローナル抗体（抗Ｈ−２Ｋｂモノクローナル抗体Ｙ３）はＴ２細胞の溶解に効果を有しなかった。実施例５Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬが、生来的にＷＴ１を発現するＨＬＡ−Ａ２．１陽性白血病細胞を殺すことができるか否かを試験した。標的細胞としてＴＦ１細胞（ＷＴ−１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）、ＪＹ細胞（ＷＴ１を発現せず、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性）、及びＭｏｌｔ−４細胞（ＷＴ１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１陰性）を用い、７．５：１（ａ）又は１５：１のＥ：Ｔ比において、細胞毒性を測定した。結果を図１２に示す。Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬは生来的にＷＴ１を発現しＨＬＡ−Ａ２．１陽性の白血病細胞ＴＦ１に対して有意な細胞毒性を示したが、Ｍｏｌｔ−４（ＷＴ１を発現し、ＨＬＡ−Ａ２．１−陰性）又はＪＹ細胞（ＷＴ１を発現せず、ＨＬＡ−Ａ２．１−陽性）に対してはバックグラウンドレベルの細胞溶解を示した。実施例６Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬが、生来的にＷＴ１を発現する腫瘍細胞を認識しそして細胞溶解するか否かを試験した。ＷＴ１を発現する腫瘍細胞（ＦＢＬ３）もしくはＷＴ１を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）（図１３）、又はＷＴ１遺伝子をトランスフェクトされたＣ１４９８細胞もしくはＴＷ１遺伝子をトランスフェクトされていないＣ１４９８細胞（図１４）について、特異的細胞溶解を図１３及び図１４に示すＥ／Ｔ比において測定した。図１３に示す通り、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬは、生来的にＷＴ１を発現するＦＢＬ３細胞を溶解したがＷＴ１を発現しないＲＭＡ細胞を溶解しなかった。図１４に示す通り、さらに、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬは、ＷＴ１を発現しない親Ｃ１４９８細胞に比べて、マウスＷＴ１遺伝子をトランスフェクトされたＣ１４９８細胞を殺した。これにより、ＣＴＬによる殺細胞のために標的化された分子が確かにＷＴ１ペプチドであることが確認された。これらの結果は、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬが、ＷＴ１蛋白質の細胞内プロセシングにより天然に産生され、そしてＷＴ１発現細胞のＨ−２Ｄｂ分子上に存在するＤｂ１２６ペプチド又は関連ペプチドを認識することができることを示唆している。実施例７ＣＴＬの細胞溶解活性がＭＨＣ拘束性であるか否かを試験するため、Ｈ−２クラス１分子に対する抗体の存在下で測定を行った。すなわち、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬによる、Ｄｂ１２６ペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞、Ｈ−２Ｋｂ（２８．１３．３Ｓ）、Ｈ−２Ｄｂ（２８．１１．５Ｓ）又はＨ−２Ｌｄ（ＭＡ１４３）に対する、タイターを調整したモノクローナル抗体の存在下で試験した。対照モノクローナル抗体としてアイソタイプが一致したモノクローナル抗体を使用した。結果を図１５に示す。Ｈ−２Ｄｂに対する抗体の濃度の増加に依存して、Ｄｂ１２６ペプチドでパルスしたＲＭＡ−Ｓ細胞に対するＣＴＬの細胞溶解活性が抑制されたが、Ｈ−２Ｋｂ又はＨ−２Ｌｄに対する抗体はＣＴＬの細胞溶解活性を抑制しなかった。これらの結果は、ＣＴＬがＨ−２Ｄｂ拘束的に細胞溶解活性を発揮することを示している。実施例８Ｄｂ１２６ペプチドによる積極的免疫化により生体内腫瘍免疫が惹起されるか否かを試験した。Ｄｂ１２６ペプチドによりパルスされたＬＰＳ活性化脾細胞（図１６中の実線）、ＬＰＳ活性化脾細胞のみ（網線）、又はリン酸緩衝液のみ（ＰＢＳ）（破線）により、１週間に１回マウスを免疫した。３週間の免疫の後、３×１０７個のＦＢＬ３白血病細胞を腹腔内注射した。結果を図１６に示す。Ｄｂ１２６ペプチドにより免疫されたマウスは腫瘍チャレンジを克服しそして生存したが、非免疫マウス及びＬＰＳ活性化脾細胞のみで免疫されたマウスは腫瘍チャレンジを拒絶することができず、死亡した。免疫されたマウス及び非免疫マウスの両方について、腫瘍細胞の前記腹腔内接種の後３日間で腹水が観察された。非免疫マウスにおいては腹水が増加し続け、そしてマウスは死んだ。他方、免疫マウスにおいては、腹水はその後徐々に減少し、マウスは腫瘍チャレンジを完全に拒絶し、そして生存した。非免疫マウスにおいて、自然的退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）が時々観察された。この退行は、Ｆｒｉｅｎｄ白血病ウイルス（ＦＢＬ３白血病細胞はこのウイルスにより形質転換される）に対して特異的なＣＴＬの自然的誘導によるものと予想される。なぜなら、このようなＣＴＬ誘導は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて時おり観察されるからである。実施例９ ＤＮＡワクチン６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１００μｇのＷＴ１を発現するプラスミッドＤＮＡ（マウスＷＴ１ｃＤＮＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．３，ｐ．１７０７−１７１２（１９９１），ｐ．１７０９の左欄）のＳｕｎ ３ＡＩ断片をＣＭＶ−ＩＥプロモーターに連結し、ＷＴ１を持続発現するプラスミッドを作製）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｏｄ．Ｓｕ，ＵＳＡ．，９２，１１１０５−１１１０９（１９９５））を１０日毎に、計３回筋肉注射した。最後の筋肉注射の１０日後、マウスの脾を取り出し脾細胞を調整し、この脾細胞と、ＷＴ１を発現しているｍＷＴ１Ｃ１４９８細胞（４０Ｇｙ放射線照射）と６日間、３７℃で共培養を行なった後、標的細胞として、ＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）とＷＴ１を発現していないＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ）を用いて、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（Ｅｕｒｏｐｉｕｍでラベル）を行った。なお、Ｃ１４９８はＷＴ１を発現しないマウス骨髄性白血病細胞株である。ＷＴ１を発現している、Ｃ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）細胞を殺すが、ＷＴ１を発現していない細胞は殺さない細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘導された。結果を図１７に示す。対照として、上記と同様の実験を行ったが、ＷＴ１を発現しているプラスミッドの代りに、ＷＴ１を発現しない（ＷＴ１ｃＤＮＡをもたない）プラスミッドをマウスに筋肉注射した。上記の実験と同じように脾細胞を採取し、ＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＰＭ５Ｇ−ｍＷＴ１）でｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後、Ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。図１８に示す通り、ＷＴ１ｃＤＮＡをもたないコントロールプラスミッドＤＮＡの筋肉注射からは、ＷＴ１タンパク特異的ＣＴＬは誘導されなかった。上記の結果から、本発明のペプチドは確かに癌抗原として機能し、癌細胞に対するキラーＴ−細胞（癌細胞傷害性Ｔ細胞）を誘導増殖させたことが立証された。従って、本発明の癌抗原ペプチドは、ＷＴ１遺伝子の発現の上昇を伴う白血病及び固形癌に対する癌ワクチンとして有用である。【配列表】【図面の簡単な説明】図１は、実施例１における、Ｄｂ１２６ペプチドで免疫した細胞と非免疫細胞のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の比率を示すグラフである。図２は、実施例２における、Ｄｂ１２６ペプチドにより免疫した細胞の、Ｄｂ１２６ペプチドでパルスした標的細胞とパルスしていない標的細胞に対する殺細胞作用を比較したグラフである。図３は、図２と同じ意味のグラフである。図４において、Ａは、実施例３における、Ｄｂ１２６ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、Ｄｂ１２６ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示し、Ｂは実施例３における、ＷＨ１８７ペプチドを用いて誘導したＣＴＬの、ＷＨ１８７ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する殺細胞効果を示すグラフである。図５は、Ｄｂ１２６ペプチドにより誘導されたＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳにより解析した結果を示すチャートである（ＣＤ１９細胞及びＣＤ３細胞）。図６は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についての、図５と同様のチャートである。図７は、ＣＤ５６細胞についての図５と同様のチャートである。図８は、ＷＨ１８７ペプチドにより誘導したＣＴＬの表面マーカーをＦＡＣＳにより解析した結果を示すチャートである（ＣＤ１９細胞及びＣＤ３細胞）。図９は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８細胞についての、図８と同様のチャートである。図１０は、ＣＤ５６細胞についての、図８と同様のチャートである。図１１は、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬによる、Ｄｂ１２６ペプチドをパルスしたＴ２細胞に対する特異的細胞溶解に対する抗ＨＬＡ−Ａ２．１抗体の影響を示すグラフである。図１２は、ＷＴ１を発現している標的細胞又はＷＴ１を発現していない標的細胞に対する、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解活性を比較したグラフである。ａはＥ：Ｔ比が７．５：１の場合の結果を示し、ｂはＥ：Ｔ比が１５：１の場合の結果を示す。図１３は、生来的にＷＴ１を発現する腫瘍細胞（ＦＢＬ３）及びＷＴ１を発現しない腫瘍細胞（ＲＭＡ）に対する、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解効果を比較したグラフである。図１４は、ＷＴ１遺伝子により形質転換された細胞及び形質転換されていない同じ細胞に対する、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬの細胞溶解効果を比較したグラフである。図１５は、Ｄｂ１２６ペプチド特異的ＣＴＬの細胞毒性に対する、抗Ｈ−２クラスＩ抗体の影響を示すグラフである。図１６は、Ｄｂ１２６ペプチドをワクチンとして使用してマウスを免疫した場合の、インビボ免疫効果を示すグラフである。図１７は、ＷＴ１を発現するプラスミドをＤＮＡワクチンとしてマウスに投与した場合の免疫効果を示すグラフである。図１８は、図１７の対照であって、ＷＴ１を発現しないプラスミドを投与した場合に免疫効果が生じないことを示すグラフである。 Ｄb 126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：５）、又はWH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val（配列番号：８）のペプチド。 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン用医薬組成物。