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| タイトル： | 特許公報(B2)_グリシンを微生物学的に製造する方法 |
| 出願番号： | 2000164001 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12P 13/04,C12R 1/15,C12R 1/05 |
特許情報キャッシュ
青木 肇也 大坪 一政 JP 4497659 特許公報(B2) 20100423 2000164001 20000601 グリシンを微生物学的に製造する方法 旭化成ケミカルズ株式会社 303046314 松井 佳章 100151965 伊藤 穣 100095902 武井 英夫 100103436 鳴井 義夫 100108693 青木 肇也 大坪 一政 20100707 C12P 13/04 20060101AFI20100617BHJP C12R 1/15 20060101ALN20100617BHJP C12R 1/05 20060101ALN20100617BHJP JPC12P13/04C12P13/04C12R1:15C12P13/04C12R1:05 C12P 13/00-13/24 C12R 1/05 C12R 1/15 MEDLINE/CAplus/BIOSIS/WPIDS(STN) JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) PubMed 特開平０３−２８０８８９（ＪＰ，Ａ） 特開昭５２−０２５７３８（ＪＰ，Ａ） 特開平０５−３１０６７７（ＪＰ，Ａ） 特開平０３−０１９６９５（ＪＰ，Ａ） 特開平１０−１７９１８３（ＪＰ，Ａ） 特開平０３−２８０８９５（ＪＰ，Ａ） 特開平０４−３０４８９２（ＪＰ，Ａ） 6 2001340097 20011211 9 20070531 戸来 幸男 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は，グリシンの微生物学的製造方法に関する。さらに詳しくは、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアの反応で得られるグリシノニトリルをコリネバクテリウム属またはアルカリゲネス属に属する微生物の作用による加水分解反応に付し、ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、または該反応条件と閉鎖系の反応条件下もしくは生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で選択的にグリシンを回収することを特徴とするグリシンの微生物学的製造方法に関する。得られるグリシンは食品添加物、洗浄剤、医農薬合成原料として有用である。本発明の製造法は、有用なグリシンを効率よく工業的に製造するため利用することができる。【０００２】【従来の技術】グリシンは、従来、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアからシュトレッカー法にて一旦グリシノニトリルを合成し、これを苛性ソーダ等のアルカリで加水分解しグリシンソーダとアンモニアに変換した後、硫酸等の酸で中和し製造されている。この時、アンモニアはアルカリで加水分解される際、蒸発して回収され、グリシンは酸で中和後、晶析法で回収される（特開昭４３−２９９２９号、特開昭５１−１９７１９号、特開昭４９−１４４２０号、特開昭４９−３５３２９号）。このように従来法は、アルカリや酸を多量に用いる欠点に加え、中和工程で塩類が多量に副成されるため廃棄物が多く、環境負荷が大きい欠点があった。さらに、中和副成する塩類はグリシンに溶解度が酷似しているため、グリシンを精製回収する為には、晶析操作を複数回繰り返したり母液を循環する等の煩雑な操作が必要であった（特開昭５１−３４１１３号）。【０００３】一方、グリシノニトリルを酵素的に加水分解しグリシンを得る方法も知られている。特公昭５８−１５１２０号明細書には、ブレビバクテリウムＲ３１２株を苛性カリ等でｐＨ８に調整した反応液に懸濁し加水分解反応に用いる方法が、また、特開平３−６２３９１号明細書には、コリネバクテリウムＮ−７７４株をリン酸緩衝液でｐＨ７．７に調整した反応液に懸濁し反応に用いる方法が開示されている。しかし、これらの方法は、実施例によるとグリシンを得るためには、グリシン重量の１倍から１０倍に相当する多量の菌体を用いる必要があり、さらに、反応液のｐＨを調整するため緩衝液が用いられる問題があった。すなわち、多量の菌体を用いるため培地や菌体を多量に浪費する欠点があり、また、ｐＨ調整剤として緩衝液を用いるため緩衝液消費や廃棄が避けられない欠点があった。さらに、緩衝液はアンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる問題もある。【０００４】ロドコッカス属、アルスロバクター属、カセオバクター属、シュードモナス属、エンテロバクター属、アシネトバクター属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、またはストレプトマイセス属の微生物を用いる特開平３−２８０８８９号明細書においては、菌体使用量は生成グリシン重量の約２０分の１に改良されているが、反応時間が約４０時間と長い欠点がある、さらに、緩衝液を反応に用いる問題は解決されていない。【０００５】このように、従来の微生物を用いたグリシノニトリルからグリシンを生産する方法は、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たりの活性が低いため、菌体や培地を多量に消費し廃棄する欠点があった。さらに、反応液のｐＨを調整するために緩衝液や酸またはアルカリを消費し、シュトレッカー法と同様に、それらの廃棄が避けられない欠点を持っていた。また、従来の微生物を用いた方法では、アンモニアを回収する工夫は開示されていないが、緩衝液や酸を用いると、緩衝液や酸がアンモニアを中和して塩を形成し、アンモニアの回収を妨げる問題に加え、酸またはアルカリを使用すると、シュトレッカー法と同様に、グリシンの回収を妨げることが予想される。このように、従来の微生物を用いる方法も、工業的に実施できるものではなかった。【０００６】【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグリシノニトリルから、微生物を用いてグリシンを生産するにあたり、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシンの製造法を提供することを目的とする。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明者は、このような工業的諸問題を解決するため、菌体当たり、かつ単位時間当たり高い活性を持ち、反応系で生成したグリシンやアンモニアを分解または消費せず、グリシンとアンモニアを別々に、定量的に、かつ容易に回収できる反応系を構築すべく、適した微生物の探索と反応方法の検討を鋭意行った。驚くべきことに、ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下で反応が進行し、単位時間当たり高い活性を持つ微生物を見いだすことがでた。さらに、こうした高活性菌体の中に、閉鎖系の反応条件下、あるいは減圧反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアンモニアを反応と同時に分離する条件下で好ましく働く微生物を見いだすことができ、本発明を完成するに至った。【０００８】すなわち、本発明によれば、ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは減圧反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグリシノニトリルの水溶液にコリネバクテリウム属またはアルカリゲネス属に属する微生物を作用させることで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わず、グリシンとアンモニアを別々に回収するグリシンの製造法が提供される。【０００９】【発明の実施の形態】本発明について、以下具体的に説明する。本発明に使用できる微生物として、コリネバクテリウム（Corynebacterium ）属とアルカリゲネ（Alcaligenes ）属に属する微生物が適していることが新たに発見された。本発明に適した微生物として具体的には、コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５株、コリネバクテリウム・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４１９株、アルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０株の微生物が使用できる。コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５株（以下、Ｃ５と略称する）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され微工研菌寄第８９３１号の受託番号を付与されており、微生物学的性質は、特開昭６３−１２９９８８号公報に示すとおりである。【００１０】本発明に使用される微生物の培養には、通常用いられる炭素源、例えば、グルコース、グリセリン、有機酸、デキストリン、マルトース等が用いられ、窒素源としてはアンモニアとその塩類、尿素、硝酸塩および有機窒素源、例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス等が用いられる。また、培地にはリン酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛等の無機栄養源が適宜添加される。培養はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、温度２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃で好気的に行われる。本発明の微生物の培養において、上記の培地に酵素誘導剤を加えてもよい、例えば、ラクタム化合物（γ−ラクタム、δ−ラクタム、ε−カプロラクタム等）、ニトリル化合物、アミド化合物等を用いてもよい。【００１１】本発明の微生物は、そのまま工業使用できるが、適当な変異剤で突然変異を誘発する方法もしくは遺伝子工学的手法により改良された変異株、例えば、酵素を構成的に生産する変異株を育成し用いることもできる。本発明の菌体とは、培養液から採取した菌体または菌体処理物（菌体の破砕物、菌体破砕物より分離した酵素、および菌体または菌体から分離抽出された酵素を固定化した処理物）である。培養液からの菌体の採取は、公知の方法で行うことができる。本発明において用いるグリシノニトリルは、公知の方法で合成することができる。例えば、ホルムアルデヒドと青酸およびアンモニアから得る方法、あるいはホルムアルデヒドと青酸を反応させ一旦グリコロニトリルを合成し、継いでアンモニアを作用させて得る方法で合成される。どちらも、シュトレッカー法として総称されている。【００１２】本発明においては、上述の方法で分離した菌体および菌体処理物はｐＨを調整しない反応条件下でグリシノニトリル水溶液に懸濁しすることで、速やかに加水分解反応が進行し、生成するアンモニアを反応と同時に分離することによりグリシンを製造することができる。すなわち、通常、前記微生物菌体または菌体処理物を、例えば０．０１〜５重量％、およびグリシノニトリルを１〜３０重量％含むｐＨを調整しない水性懸濁液をオートクレーブ等の閉鎖的反応容器、または生成するアンモニアを反応分離する装置が付属した反応容器に仕込み、温度として例えば０〜６０℃の条件、好ましくは１０〜５０℃の条件を用いて、反応時間を例えば１〜２４時間、好ましくは３〜８時間反応させればよい。この場合、グリシノニトリルを薄い濃度で仕込み経時的に追加添加したり、反応温度を経時的に変化させてもよい。【００１３】本発明においては、反応生成するアンモニアは密閉型反応容器中に一旦蓄積するか反応と同時に反応分離することができる。反応分離方法は、反応蒸留法や不活性ガスの流通法で実施することができる。反応蒸留を行う場合、加水分解反応容器に、アンモニアと同伴する水を冷却回収する冷却器の付いた単管搭、棚段搭、または充填塔を備え、反応水溶液の沸騰圧以下、例えば、６０℃で２０．０ｋＰａ以下から０℃で０．６ｋＰａ以下の減圧条件下で、連続的にまたは間欠的に減圧反応蒸留することが好ましい。さらに好ましくは１２．６ｋＰａから１．３ｋＰａの圧力条件下で、減圧反応蒸留することができる。不活性ガスを流通する場合、不活性ガスの吹き込みノズルと、アンモニアや同伴する水を不活性ガスから回収する冷却トラップとを備え、微加圧から減圧条件下で連続的にまたは間欠的に、アンモニアを不活性ガスに同伴し反応液から分離することができる。さらに、アンモニア分離を促進するため減圧反応蒸留を不活性ガス流通条件下で行うこともできる。【００１４】かくして、グリシノニトリルは、ほぼ１００％のモル収率で加水分解し、生成するアンモニアの全部は密閉型反応容器中に、一旦グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液として生成蓄積させることができる。また、生成するアンモニアの全部または殆どは、反応と同時に反応蒸留法や不活性ガスの流通法で反応液から分離し冷却回収される。もし、グリシンアミドが残存する場合は、グリシンアミドの加水分解活性をもつ菌体もしくは酵素を追添加することにより、完全にグリシンおよびアンモニアに転換することも可能である。グリシンのアンモニウム塩を含むグリシンの高濃度水溶液からのグリシンの回収は、例えば、反応液から菌体を遠心濾過、膜分離等によって除いた後、グリシンは晶析法、イオン交換法または貧性溶媒による分別沈澱法にて回収できる、また、アンモニアは一部の水と一緒に蒸発後、蒸留や抽出によって回収することができる。本発明を実施例に基づいて説明する。【００１５】【実施例１】（１）グリシノニトリルの合成ホルマリンに等量の青酸をを作用させて、一旦生成したグリコロニトリル水溶液に、過剰量のアンモニア水溶液を添加し３０重量％グリシノニトリル水溶液を得た。（２）菌体の培養コリネバクテリウム・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４１９を、下記の条件で培養した。【００１６】（３）グリシノニトリルの加水分解菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。密閉した１００ｍｌの硝子オートクレーブに、乾燥菌体量として８５ｍｇと基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを１７ｍｌの蒸留水で調合し、２０℃にて反応を開始した。反応開始２時間後、ｐＨは１０になっていた。この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。【００１７】そこで、２時間毎に反応温度を５℃昇温し、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３ｍｌを追加添加して反応液を液体クロマトグラフィー法で分析した。この操作を４回切り返し、合計１０時間反応を行った。得られた３２ｇの反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアはネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンとアンモニアが定量的に生成していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は７１ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は７．１ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの３０ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し、４．９ｇのグリシンを晶析回収した。一方、冷却回収した蒸発水溶液中のアンモニアは１．２５ｇであった。【００１８】【実施例２】実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。（１）菌体の培養コリネバクテリウムｓｐ．Ｃ５を、下記の条件で培養した。【００１９】（２）グリシノニトリルの加水分解菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ドライアイストラップに接続したミストセパレーター、温度計、およびサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．１６gを仕込み、基質の３０重量%グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを１時間当たり３リットルフィードしながら、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析し、グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成していた。【００２０】そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。この操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が１５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は３００ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは、液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成し、トレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は５２ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は１０ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの３０３ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグリシンを晶析回収した。【００２１】【実施例３】実施例１で合成した３０重量％グリシノニトリル水溶液を用い、菌体と反応方式を代えて実施した。（１）菌体の培養アルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０を、下記の条件で培養した。【００２２】（２）グリシノニトリルの加水分解菌体は、得られた培養液から遠心分離により集菌し、蒸留水等で洗浄したものを反応に用いた。撹拌器の付いた１０００ｍｌの恒温ジャケット槽型３つ口セパラブルフラスコに、底部まで届く窒素ガスの吹き込みノズル、ドライアイストラップを経て減圧ポンプに接続した単管型の蒸留塔、圧力センサー、温度計、および液送ポンプに接続したサンプリング管を備えた。このセパラブルフラスコに乾燥菌体量として１．４ｇを仕込み、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌと蒸留水１７０ｍｌを調合した。ガス流量計を用いて少量の窒素ガスを１時間当たり3リットルフィードしながら、減圧ポンプでフラスコ内の圧力を１０ｋＰａに調整し、３０℃にて反応を開始した。反応開始１時間後、この反応液を液体クロマトグラフィー法で分析したところ、グリシノニトリルが消失し、グリシンが定量的に生成していた。【００２３】そこで、基質の３０重量％グリシノニトリル水溶液３０ｍｌを追加添加した。２時間毎にこの操作をさらに３回繰り返し、合計５時間反応を行った。ドライアイストラップには固体が２５ｇ回収された。固体を５０ｍｌの水に溶かしネスラー法により定量したところ、アンモニアが１４ｇ回収されていた。反応液は２９４ｇ回収された。この反応液のうち２ｇを用い、生成したアンモニアをネスラー法により定量し、原料のグリシノニトリルと生成したグリシンは液体クロマトグラフィー法で分析した。グリシノニトリルはなくなり、グリシンが定量的に生成し、トレース量のアンモニアが残存していた。乾燥菌体当たりのグリシンの生成量は４２ｇ／ｇ乾燥菌体であり、グリシンの生成活性は８ｇ／ｇ・Ｈｒであった。残りの２９２ｇは遠心濾過し菌体を取り除いた後、沸騰下で１／１０に濃縮し放冷して５６ｇのグリシンを晶析回収した。【００２４】【発明の効果】本発明の製造方法は、ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下、または該反応条件と閉鎖的反応条件下もしくは減圧反応蒸留や不活性ガスを流通しながら生成するアンモニアを反応と同時に系外に分離する反応条件下で、ホルムアルデヒド、青酸、およびアンモニアとの反応で得られるグリシノニトリルの水溶液に、コリネバクテリウム（Corynebacterium ）属またはアルカリゲネス（Alcaligenes ）属に属する微生物を作用させることで、乾燥菌体当たり、かつ単位時間当たり高活性であって菌体や培地の多量廃棄を伴わず、反応液のｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加や廃棄を伴わず、グリシンとアンモニアが定量的に生成し、これらの分解および消費を伴わなず、グリシンとアンモニアを別々に回収できる効果を有する。 ｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件下で、グリシノニトリルの水溶液に微生物としてコリネバクテリウムｓｐ．５株（微工研菌寄第１０２２４号）、コリネバクテリウム・ニトリロフィラスＡＴＣＣ２１４１９又はアルカリゲネス・フェカリスＡＴＣＣ８７５０を作用させ、グリシン及びアンモニアを回収することを特徴とするグリシンの製造法。 反応条件がｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ閉鎖的反応条件であることを特徴とする請求項１記載の方法。 反応条件がｐＨを調整するための酸、アルカリまたは緩衝液の添加をしない反応条件で、かつ反応液中に生成するアンモニアを反応液から分離する反応条件であることを特徴とする請求項１記載の方法。 アンモニアを反応液から分離する方法が反応蒸留であることを特徴とする請求項３記載の方法。 反応蒸留を減圧下で行うことを特徴とする請求項４記載の方法。 反応蒸留を不活性ガスの存在下で行うことを特徴とする請求項４または５記載の方法。