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| タイトル： | 特許公報(B2)_構成糖に１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖 |
| 出願番号： | 2000017183 |
| 年次： | 2010 |
| IPC分類： | C12P 19/18,C07H 3/10,C08B 37/00 |
特許情報キャッシュ
▲桧▼作 進 竹田 靖史 安部 淳一 室屋 賢康 吉永 一浩 藤末 真実 石場 秀人 JP 4550202 特許公報(B2) 20100716 2000017183 20000126 構成糖に１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖 檜作 富美子 503302643 檜作 和子 503302654 檜作 薫 503302665 安部 淳一 599150975 日本澱粉工業株式会社 390015004 大島 正孝 100080609 ▲桧▼作 進 竹田 靖史 安部 淳一 室屋 賢康 吉永 一浩 藤末 真実 石場 秀人 20100922 C12P 19/18 20060101AFI20100902BHJP C07H 3/10 20060101ALI20100902BHJP C08B 37/00 20060101ALI20100902BHJP JPC12P19/18C07H3/10C08B37/00 G CA/REGISTRY(STN) JSTPlus(JDreamII) 特表平０９−５０５９８８（ＪＰ，Ａ） J.Appl.Glycosci.,Vol.46,No.3(1999)p.340 Carbohydr.Res.,Vol.305,No.1(1997)p.73-82 Tetrahedron,Vol.52,No.4(1996)p.1095-1121 J.Appl.Glycosci.,Vol.46,No.4(1999)p.439-444 4 2001204490 20010731 8 20070118 特許法第３０条第１項適用 平成１１年８月３１日 日本応用糖質科学会発行の「ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＰＰＬＩＥＤ ＧＬＹＣＯＳＣＩＥＮＣＥ 第４５巻 第３号 ｐ．３４０、３９０」に発表 高堀 栄二 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は構成糖に１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する新規な糖鎖およびその製造方法に関する。【０００２】【従来の技術】糖鎖は単糖が２個以上脱水縮合した構造を持つ化合物である。これまでに、澱粉をはじめとする各種糖のポリマーを化学的、酵素学的処理により分解する方法、単糖同士を化学的、酵素学的処理により重合する方法、あるいは、一つの糖鎖からもう一つの糖鎖へ糖を転移する方法を用いて合成されており、いくつかについては工業化がなされている。これら糖鎖の多くはグルコース、キシロースあるいはそれらのエピマーや誘導体で構成されており、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトース等のアンヒドロ糖が構成糖として含まれる糖鎖に関する報告はない。【０００３】１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースは、担子菌などの微生物あるいは紅藻などの植物組織に存在する酵素であるα−１,４グルカンリアーゼの作用により澱粉あるいは澱粉分解物を基質として生産することができる。１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースはグルコースが脱水した興味ある特異な構造をしている。これまでの解析の結果から、グルコース等の他の単糖類に比較して還元力が高いこと、抗菌活性を有しているなど特徴的な性質を持つことが明らかとなっている。【０００４】【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを構成糖として含む新規糖鎖を提供することにある。【０００５】本発明の他の目的は、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを構成糖として含む新規糖鎖の製造方法を提供することにある。【０００６】本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。【０００７】【課題を解決するための手段】 本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、還元末端に構成糖として１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖であって、下記式 Ｇ−（Ｇ）ｎ−ＡＦここで、Ｇはグルコース骨格であり、ＡＦは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース骨格であり、そしてｎは０〜２０の数である、但し、上記グルコース骨格には側鎖として他のグルコース単位がグリコシド結合していてもよい、で表わされることを特徴とする糖鎖を製造する方法によって達成される。【０００８】 また、本発明の上記目的および利点は、第２に、シクロデキストリンと１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースとを糖鎖転移触媒としてのシクロデキストリン合成酵素の存在下に接触をせしめて、シクロデキストリンを構成する単糖単位もしくは部分糖鎖単位を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースへ転移せしめることを特徴とする、還元末端に構成糖として１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖を製造する方法によって達成される。【０００９】【発明の実施の形態】以下、まず本発明の製造方法について説明する。【００１０】原料である１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースは澱粉やグリコーゲンをα−１,４−グルカンリアーゼで分解して得られる。【００１１】α−１,４−グルカンリアーゼは海藻やきのこに含まれることが報告されている。本発明者らは海藻オゴノリよりα−１,４−グルカンリアーゼを精製し、この酵素を澱粉（例えばワキシーコーンスターチ）に作用させ１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを合成した。この１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを精製し糖鎖合成に用いた。【００１２】また、もう一方の原料である多糖類としては、例えばグルカン類が好ましく用いられる。これらのうち、シクロデキストリン、澱粉、可溶性澱粉、マルトデキストリンの如きα−１,４−グルカン鎖を持つ糖類およびその誘導体がさらに好ましい。【００１３】 これらの原料は糖鎖転移触媒の存在下に接触せしめられる。糖鎖転移触媒としては、シクロデキストリン合成酵素が用いられる。【００１４】例えば糖鎖合成の酵素反応は１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースと澱粉などのα−１,４−グルカンにシクロデキストリン合成酵素を作用させることによって行うことができる。シクロデキストリン合成酵素はシクロデキストリン合成の他に糖鎖の転移反応を触媒する。従って、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースとα−１,４−グルカン共存下にこの酵素を作用させると、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの非還元末端に種々の重合度の糖を転移し１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを構成糖に持つ糖鎖を合成することができる。【００１５】上記の糖鎖合成反応は、好ましくは、水性媒体中で実施される。水性媒体としては、水あるいは場合により水と水混和性有機媒体例えばアルコールからなる混合媒体が用いられる。反応温度およびｐＨは使用する糖鎖転移触媒の種類により至適値が異なるが、例えば１０〜６５℃および３〜８のｐＨの範囲で実施することができる。【００１６】また、原料である基質の濃度は、例えば１〜４０ｇ／１００ｍｌであることができる。反応終了後、通常、使用した酵素を失活させたのち、あるいは、酵素を担体に固定化して反応を行った場合は、反応液が酵素との接触を終了した後、常法に従い、生成物を分離することができる。かくして、本発明によれば、構成糖に１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖（糖分子鎖）が製造され且つ提供される。【００１７】 構成糖に１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する本発明の糖鎖は、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを糖鎖の還元末端に有する１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース以外の部分がマルトデキストリン糖鎖であるのが好ましい。【００１８】本発明によれば、特に下記式Ｇ−（Ｇ）n−ＡＦここで、Ｇはグルコース骨格であり、ＡＦは１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトース骨格であり、そしてｎは０〜２０の数である、但し、上記グルコース骨格には側鎖として他のグルコース単位がグリコシド結合していてもよい。で表わされる糖鎖が好ましく提供される。【００１９】本発明の新規糖鎖は、アミノ基を持つ種々の化合物、例えば蛋白質のアミノ基と反応し、アミノ基に糖鎖を結合させる糖鎖供与体として使用することができる。【００２０】以下、実施例により本発明をさらに詳述する。【００２１】【実施例】実施例１２０ｍｇ／ｍｌの１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトース１００ｍｌと５０ｍｇ／ｍｌのβ−シクロデキストリン１００ｍｌを混合しｐＨを５に調製した後、その混合液にシクロデキストリン合成酵素５０Ｕを添加し３５℃で４８時間反応させた。反応終了後、反応液を９５℃まで加温し酵素を失活させた。その反応液をＨＰＬＣ（ＴＯＳＯ ＮＨ２−６０）で分析した結果、図１に示すように重合度２から１１の糖鎖が合成されていることが明らかとなった。【００２２】次に、これらの糖鎖が１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有することを確認するための実験を行った。まず、上記の反応生成物をゲルろ過クロマトグラフィーにより各重合度の糖鎖を分取した。分取した各重合度の糖鎖を最終濃度が０．５Ｎになるように塩酸を加え、沸騰浴中で３０分加熱し塩酸加水分解し構成糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で解析した。重合度が２の糖鎖ではグルコースと１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの標準サンプルと同じ保持時間の位置に量比が１対１である２つのピークが検出された（図２）。重合度３の糖鎖では、それぞれの標準サンプルと同じ保持時間にグルコース対１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースが２：１の量比となる２つのピークが検出された（図３）。さらに、重合度４、５、６以上の糖鎖（重合度ｎ）も同様に調べた結果、同様に、それぞれの標準サンプルと同じ保持時間の位置にグルコース対１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースが（ｎ−１）：１の量比となる２つのピークが検出された。以上の結果は、反応生成物が１分子あたり１個の１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトース残基を含むことを示している。次に、シクロデキストリン合成酵素反応生成物である各重合度の糖鎖の混合物にグルコアミラーゼを作用させた。その結果、図4に示す通り、グルコースと重合度２の糖とを得た。グルコアミラーゼはグリコシド結合したグルコース鎖の非還元末端から１グルコース残基ずつ分解することを特徴とする酵素である。従って、これらの糖鎖は重合度２の糖以外の部分はグルコースからなること、さらに、重合度２の糖の非還元末端はグルコースであることを示している。次に、この重合度２の糖の加水分解物をＨＰＬＣで分析した。その結果、グルコースと１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの標準サンプルと同じ保持時間の位置に前者対後者の量比が１対１となる２つのピークが検出された。さらに、それぞれのピーク位置の溶液を分取して解析を行った。グルコースの保持時間と同位置に検出された物質を、グルコースを定量する際に一般的に用いられるグルコースオキシダーゼ法で定量したところ、ピーク面積から推定される量と同量のグルコースが検出された。グルコースオキシダーゼは極めてグルコースに特異性の高い酵素であることから、この結果は、グルコースの保持時間と同位置に検出された物質がグルコースであることを示している。一方、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの保持時間と同位置に検出された物質に対して、NMRによる解析を行ったところ、図５に示す純度９９％の１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの標準サンプルのパターン（１,５−Ｄ−アンヒドロフラクトースを重水に１０％になるよう溶解し、ＪＥＯＬ ＧＳＸ−５００スペクロメーターで測定した。ケミカルシフトはテトラメチルシランを基準物質としてｐｐｍで表した。外部標準物質として１,４−ジオキサン（６７.４０ｐｐｍ）をコントロールに用いた。）と同一のパターンを示した。従って、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの保持時間と同位置に検出された物質が１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースであることを示している。以上の結果を総合すると、合成された糖鎖は、還元末端が１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースからなり、それにグルコースがグリコシド結合したものであると結論される。【００２３】１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖の合成原料としてはβ−シクロデキストリンの代わりにα−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等の環状オリゴ糖、澱粉、可溶性澱粉などα−１,４グルカンを含む糖類あるいはそれらの誘導体を用いることができる。例えば、１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースと可溶性澱粉を１対２の比で混合しシクロデキストリン合成酵素を可溶性澱粉１ｇあたり１０Ｕ加え、温度３５℃で４８時間反応させると１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの約５０％が糖鎖へと変換した。【００２４】実施例２１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースと可溶性澱粉を１対２の比で混合しシクロデキストリン合成酵素を可溶性澱粉１ｇあたり１０Ｕ加え、温度３５℃で４８時間反応させると１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの約５０％が糖鎖へと変換した。このオリゴ糖を実施例１と同様に構成糖を調べた結果、還元末端に１,５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含む重合度２〜１０の糖鎖であった。【図面の簡単な説明】【図１】シクロデキストリン合成酵素による酵素反応終了後のＨＰＬＣチャート（ＴＯＳＯ ＮＨ２−６０）。【図２】重合度２のオリゴ糖を塩酸加水分解して得られた加水分解生成物のＨＰＬＣチャート（三菱化成 ＣＫ０８Ｓ）。【図３】重合度３のオリゴ糖を塩酸加水分解して得られた加水分解生成物のＨＰＬＣチャート（三菱化成 ＣＫ０８Ｓ）。【図４】重合度３の糖鎖をグルコアミラーゼ処理した反応液のＨＰＬＣチャート（三菱化成 ＣＫ０８Ｓ）。【図５】純度９９％以上の１,５‐Ｄ‐アンヒドロフラクトースのＮＭＲチャート。 還元末端に構成糖として１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖であって、下記式 Ｇ−（Ｇ）ｎ−ＡＦここで、Ｇはグルコース骨格であり、ＡＦは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース骨格であり、そしてｎは０〜２０の数である、但し、上記グルコース骨格には側鎖として他のグルコース単位がグリコシド結合していてもよい、で表わされることを特徴とする糖鎖。 １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース以外の構成糖部分がマルトデキストリン糖鎖である請求項１の糖鎖。 オリゴ糖、環状オリゴ糖あるいは多糖類と１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースとを糖鎖転移触媒としてのシクロデキストリン合成酵素の存在下に接触をせしめて、多糖類を構成する単糖単位もしくは部分糖鎖単位を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースへ転移せしめることを特徴とする、還元末端に構成糖として１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖を製造する方法。 シクロデキストリンと１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースとを糖鎖転移触媒としてのシクロデキストリン合成酵素の存在下に接触をせしめて、シクロデキストリンを構成する単糖単位もしくは部分糖鎖単位を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースへ転移せしめることを特徴とする、還元末端に構成糖として１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する糖鎖を製造する方法。