生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_サソリ由来神経ペプチド |
| 出願番号： | 1998529837 |
| 年次： | 2009 |
| IPC分類： | C07K 14/435,A61K 38/00,A61P 43/00,A61P 37/06 |
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ブルーノ・ルブラン レジヌ・ロミ・ルブラン 南方 宏之 中嶋 暉躬 端野 純子 JP 4212651 特許公報(B2) 20081107 1998529837 19971225 サソリ由来神経ペプチド サントリー株式会社 草間 攻 ブルーノ・ルブラン レジヌ・ロミ・ルブラン 南方 宏之 中嶋 暉躬 端野 純子 JP 1996359815 19961226 JP 1997312871 19971030 20090121 C07K 14/435 20060101AFI20081225BHJP A61K 38/00 20060101ALI20081225BHJP A61P 43/00 20060101ALI20081225BHJP A61P 37/06 20060101ALI20081225BHJP JPC07K14/435A61K37/02A61P43/00 111A61P37/06 C07K 14/00 - 14/825 BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) CAplus(STN) REGISTRY(STN) UniProt/GeneSeq PubMed JSTPlus(JDreamII) JMEDPlus(JDreamII) JST7580(JDreamII) 国際公開第９５／００３０６５（ＷＯ，Ａ１） Biochem. J., 1996, 315, p.977-981 Eur. J. Biochem., 1996, 242, p.491-498 Comp. Biochem. Physiol., 1992, 103C(2), p.299-302 Current Pharmaceutical Design, 1996, 2, p.389-396 Neuron, 1995, 15, p.5-10 5 JP1997004810 19971225 WO1998029446 19980709 13 20041215 三原 健治 技術分野本発明は新規な神経ペプチドに関し、さらに詳細には、サソリの一種ヘテロメトルス スピニファー（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ ｓｐｉｎｎｉｆｅｒ）の毒腺から得られるサソリ毒素関連ペプチドに関する。背景技術サソリは蛛形綱サソリ目に属する節足動物の総称であり、全世界に約６００種が生息する。サソリは一般に猛毒の動物であると考えられているが、実際には致命的な毒素を持つサソリは種類が限られており、例えば、アフリカの砂漠に生息するＢｕｔｈｕｓ ｕｓｔｒａｌｉｓ、メキシコ産のＣｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｅｘｉｌｉｃａｕｄａや、南ヨーロッパ産のＢ．ｏｃｃｉｔａｕｄａ等、数種にすぎない。また、現在までに、種々のサソリ毒素が単離されており（Ｄｒｅｙｅｒ．Ｆ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５巻 ９４−１２８頁 １９９０年）、それらは神経毒であると考えられている。これらの毒素の生理作用の研究から、Ｋ+チャンネルに対する作用が注目されており、例えば、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｍａｒｇａｒｉｔａｔｕｓの毒腺から得られたマルガトキシン（ＭｇＴＸ，ガルシア−カルボ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８巻 １８８６６−１８８７４頁，１９９３年）およびＬｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｒｂｒａｅｓの毒腺から得られたアジトキシン２（ＡｇＴＸ２，ガルシア等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３巻 ６８３４−６８３９頁，１９９４年）は、電圧開閉型Ｋ+チャンネルの遮断剤（ブロッカー）であることが知られている。これらはいずれも、分子内に３個のジスルフィド結合を有し、３８アミノ酸残基からなるペプチドである。また、最近、分子内に４個のジスルフィド結合を有し、３５アミノ酸残基からなるペプチドであるピーアイ１（Ｐｉ１，オラメンディ−ポーチュガル等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１５巻 ９７７−９８１頁，１９９６年）も報告されている。一方、Ｔ細胞からのＩＬ−２の産生には細胞内へのＣａ2+の流入が必要であるとされており、最近、活性化に伴うＴ細胞へのＣａ2+の流入にはＫ+チャンネルのひとつであるＫｖ１．３が関与していることが明らかにされた（Ｌｅｏｎａｒｄ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９巻 １００９４−１００９８頁，１９９２年）。さらにＬｉｎ等は、Ｋｖ１．３の阻害によりＴ細胞へのＣａ2+の流入、増殖およびＩＬ−２産生が抑制されることを報告している（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７巻 ６３７−６４５頁，１９９３年）。これらの観点から判断すると、サソリ毒素が所有する種々の生理活性により、このものを医薬等へ応用することが期待できる。しかしながら、サソリ毒素を医薬等に応用するためには、有害な毒性と有用な生理活性とを分離することが必須であり、そのためには、より多くのサソリ毒素を単離し、その構造活性相関を明らかにする必要がある。このような現状に鑑み、新たなサソリ毒素関連ペプチドを提供し、サソリ毒素の医薬等に対する応用に寄与することが、本発明が解決すべき課題である。発明の開示本発明者らは、サソリの一種であるヘテロメトルス スピニファー（Ｈ．ｓｐｉｎｎｉｆｅｒ）の毒腺から、アフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させたラット脳の電圧開閉型Ｋ+チャンネルＫｖ１．３（ＲＣＫ３とも称される）の阻害活性を指標に、新たなサソリ毒素関連ペプチドを単離すべく鋭意研究を行い、ＨｓＴＸ１と命名した、配列番号１で表され、分子内に４個のジスルフィド結合を有するペプチドを単離・精製して、その一次構造および高次構造を決定するとともに、このＨｓＴＸ１が、従来報告されているサソリ毒素に比較して、はるかに強いＫ+チャンネルの阻害活性を示すこと、およびヒト末梢血Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を抑制することを見いだして本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、次のアミノ酸配列：を有し、Ｃ末端がアミド化されていてもよく、分子内に０〜４個のジスルフィド結合を有するペプチドを、電圧開閉型Ｋ+チャンネルのブロッカーおよびＩＬ−２産生抑制剤として提供することができる。なかでもより具体的態様としては、ジスルフィド結合が、Ｃｙｓ3−Ｃｙｓ24，Ｃｙｓ9−Ｃｙｓ29，Ｃｙｓ13−Ｃｙｓ31およびＣｙｓ19−Ｃｙｓ34からなる群から選ばれたものである上記のアミノ酸配列を有するペプチドを提供することができる。さらに本発明は、その最も好ましい態様として、Ｃ末端がアミド化されており、分子内に４個のジスルフィド結合を有し、その結合がＣｙｓ3−Ｃｙｓ24，Ｃｙｓ9−Ｃｙｓ29，Ｃｙｓ13−Ｃｙｓ31およびＣｙｓ19−Ｃｙｓ34にある上記のアミノ酸配列を有するペプチドを提供することができる。【図面の簡単な説明】第１図は、ラットＫｖ１．３チャンネルに対する本発明のペプチドの濃度依存的な阻害活性を示す図である。図中、白丸（○）は天然体ＨｓＴＸ１の活性データを、黒四角（■）は合成ＨｓＴＸ１の活性データを、また黒三角（▲）はＣ末端がカルボン酸であるＨｓＴＸ１−ＣＯＯＨの活性データを示す。第２図は、ＰＭＡおよびｉｏｎｏｍｙｃｉｎで刺激したヒト末梢血Ｔ細胞のＩＬ−２産生に対するＨｓＴＸ１の濃度依存的な阻害活性を示す図である。発明を実施するための最良の形態本発明のペプチドは、例えば、サソリの一種であるヘテロメトルス スピニファー（Ｈ．ｓｐｉｎｎｉｆｅｒ）をはじめ、本発明のペプチドを含有するサソリから毒腺を摘出し、これを例えば０．５Ｍ程度の酢酸でペプチドを抽出して粗抽出物を得る。次いで、この粗抽出物から、通常、ペプチド精製に用いられるイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いて分離・精製することにより得ることができる。本発明のペプチドのうち、天然由来のペプチドであるＨｓＴＸ１は、（１）アミノ酸配列から、分子内に８個のＣｙｓ残基が存在すること。（２）質量分析のデータから、ペプチドが単量体で存在すること。（３）得られた分子量のデータが、Ｃ末端がアミド化され、分子内に４個のジスルフィド結合が存在するとして計算した分子量のデータと一致すること。以上の３点から、Ｃ末端がアミド化され、分子内に４個のジスルフィド結合が存在することが明らかである。本発明のペプチドにおけるジスルフィド結合の数およびその結合位置は特に限定されない。本発明のペプチドのなかでも、天然由来のペプチドは、後記する実施例からも明らかなように、ジスルフィド結合を４個有し、その結合位置がＣｙｓ3−Ｃｙｓ24，Ｃｙｓ9−Ｃｙｓ29，Ｃｙｓ13−Ｃｙｓ31およびＣｙｓ19−Ｃｙｓ34にあることが判明した。この天然体のペプチドは、ジスルフィド結合を含まないペプチドに無作為に４個のジスルフィド結合を導入した後、天然体と一致するペプチドを精製することにより得ることができる。ジスルフィド結合を含まないペプチドの合成は、通常のペプチド合成機（例えば、アプライド・バイオシステム社製４３３Ａ型ペプチド合成機）を用いる固相法によるのが簡便であり、ジスルフィド結合の導入には、空気酸化、フェリシアン化カリウムによる酸化（Ｈｏｐｅら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７巻 １５６３−１５６６頁 １９６２年）等の酸化反応を用いることができる。また、ジスルフィド結合を導入したペプチドから、天然体と一致するペプチドを精製するには、例えばＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｃ−１８ＨＰＬＣ）で、保持時間が天然体と一致する画分を単離する方法を用いることができる。また本発明のペプチドは、常法に従って、遺伝子組換え技術を適宜応用することにより得ることもできる。上記する合成法によれば、一次構造が同一でありながら、ジスルフィド結合の数および様式が、天然体とは異なるペプチドも得ることができる。したがって、配列番号１で表され、分子内に０〜４個のジスルフィド結合を有し、その結合様式が分子内の任意の箇所のＣｙｓ同士でジスルフィド結合したペプチドである限り、これらペプチドも本発明の技術的範囲に包含される。さらにまた、このようなペプチドは、本発明の天然体のペプチドと同様の生理活性を有する限りにおいて、そのアミノ酸の一部欠失、置換、付加があるペプチドであっても、本発明の電圧開閉型Ｋ+チャンネルに対する遮断作用物質およびＩＬ−２産生抑制剤であるペプチドとしての技術的範囲に包含される。なお、後述する評価例２に示すように、Ｃ末端がカルボン酸であるペプチドもＫ+チャンネルに対する阻害活性を有するものであり、したがって、かかるＣ末端がカルボン酸であるペプチドも本発明の技術的範囲に包含される。本発明のペプチドのなかでも、天然体のペプチドは、分子内に４個のジスルフィド結合を有し、３４個のアミノ酸残基からなる神経ペプチドの最初の例であり、アフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させたラット脳のＫｖ１．３電圧開閉型Ｋ+チャンネルを、極めて低濃度で遮断し、ヒト末梢血Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を抑制する。したがって、本発明が提供するペプチドおよびその類縁体は、サソリ毒素関連ペプチドの神経生理学における生化学試薬としての用途のみならず、医薬、動物薬への適応にも繋がるものと考えられる。医薬への応用の例としては、臓器移植、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）、自己免疫疾患などへ適応される免疫抑制剤としての活用をあげることができる。本発明のペプチドを医薬品として用いる場合には、その投与形態は特に限定されず、経口的あるいは非経口的のいずれであってもよい。そのような投与剤形としては、例えば、注射剤、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、腸溶剤、吸入剤、トローチ剤、軟膏剤、坐剤、舌下錠等の製剤上の各種剤形ををあげることができ、これらの製剤を症状に応じてそれぞれ単独で、または組み合わせて使用することができる。また、これらの製剤化にあっては、目的に応じ、それ自体公知の方法に従って賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤など医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を適宜用いて行うことができる。なお、本発明のペプチドを医薬としてヒトに投与する場合の有効投与量は一概に限定されず、その有効活性の程度、投与すべき対象患者の年齢、性別、体重等ならびに対象疾患の症状等により異なる。しかしながら、通常、成人に対して経口投与の場合には、１日あたり０．１〜１００ｍｇの範囲内で、また非経口投与の場合には、１日当たり０．０１〜１０ｍｇの範囲内で適宜選択することが可能である。実施例次に実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。実施例１．ＨｓＴＸ１の精製ａ．粗抽出ヘテロメトルス スピニファー（Ｈ．ｓｐｉｎｎｉｆｅｒ）の毒腺の凍結乾燥物５０ｍｇ（フランス・ラトキサン社より入手）を、約５ｍｌの０．５Ｍ酢酸でホモジナイズし、３，０００×ｇで２０分間遠心分離した。沈殿は同様にホモジナイズ後遠心分離する操作を３回繰り返し、得られた上清を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過して、粗抽出液を得た。ｂ．逆相カラムクロマトグラフィー（１）上記ａで得られた粗抽出液の原料換算１２．５ｍｇ分を１バッチとして、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＳＧ−１２０（資生堂，φ１０×２５０ｍｍ）を用いるＣ−１８ＨＰＬＣに付し、流速３ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ水溶液（ｐＨ２．２）中で６分間展開した後、０．１％ＴＦＡ水溶液中、１００分間で０％から５０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出し、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら、ピークを示す画分を分取した。得られたフラクションを、アフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させたラット脳のＫｖ１．３電圧開閉型Ｋ+チャンネルの阻害活性を指標に分画し、保持時間３８分〜４１分に溶出された活性画分を集めた。ｃ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィー次いで、上記ｂで得られた活性画分を、ｐＨ６．８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東ソー，φ７．５×７５ｍｍ）を用いる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中で５分間展開した後、８０分間で０Ｍから０．８０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら、ピークを示す画分を分取した。ステップｂと同様にアッセイし、保持時間６４分〜６９分に溶出された活性画分を集めた。ｄ．逆相カラムクロマトグラフィー（２）上記ｃで得られた活性画分を、ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（メルク社製，リクロスフェアー１００オングストローム，ビーズサイズ５μｍ，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ水溶液（ｐＨ２．２）で３分間展開した後、０．１％ＴＦＡ水溶液中、３５分間で５％から１８％までの溶媒Ｂ（２−プロパノール：アセトニトリル＝２：１の混液）の直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。ＨｓＴＸ１は、保持時間２７．５分の箇所にシングルピークとして溶出された。この分画を集めて凍結乾燥し、合計で１３０μｇのＨｓＴＸ１を得た。実施例２．ＨｓＴＸ１の製造決定ａ．アミノ酸組成の測定得られたＨｓＴＸ１を、減圧下封管中で定沸点６Ｎ−ＨＣｌを用いて１１０℃、２０時間処理して加水分解し、アミノ酸分析器を用いてアミノ酸組成を測定した。得られたアミノ酸組成を、下記の表１に示す。ｂ．アミノ酸配列の決定ステップ１．ジスルフィド結合の還元と修飾ＨｓＴＸ１は、２０％のｎ−プロパノールを含む０．５Ｍ重炭酸バッファー（ｐＨ８．３）中、ジスルフィド結合に対して５当量のトリブチルホスフィンと、トリブチルホスフィンに対して２当量の４−ビニルピリジンを用いて、窒素気流中、３７℃で遮光下に２時間反応させて、Ｃｙｓ残基をＳ−ピリジルエチル化（ＰＥ化と略記する）した。得られたＰＥ化ペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（メルク社製，リクロスフェアー１００オングストローム，ビーズサイズ５μｍ，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、５５分間に，０．１％ＴＦＡ／水の混液中、アセトニトリルの５％から６０％の直線濃度勾配で、精製した。ステップ２．アミノ酸配列の決定上記ステップ１で得られたＰＥ化ペプチドは、島津ＰＰＳＱ１０型アミノ酸シーケンサー（島津製作所製）を用いてアミノ酸配列を決定した。その結果、ＨｓＴＸ１は配列番号１のアミノ酸配列で示され、分子内に４個のジスルフィド結合を有するペプチドであることが判明した。ステップ３．分子量の測定ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定されたＨｓＴＸ１の分子量は、３８１５．６３であり、この結果は、配列番号１のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端がアミド化され、分子内に４個所のジスルフィド結合を有するとして計算した分子式、Ｃ149Ｈ246Ｎ54Ｏ46Ｓ9の分子量である３８１５．６１と良く一致した。ステップ４．ジスルフィド結合位置の決定ａ）部分的還元的アルキル化および配列の決定ＨｓＴＸ１の部分的還元的アルキル化を、Ｊｏｎｅｓ等の方法（Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ．，１０巻 １３８−１４３頁 １９９６年）を若干修飾して行った。すなわち、上記で得られた２〜３ナノモルのＨｓＴＸ１の０．１Ｍ酢酸アンモニウム／アセトニトリル溶液（９０：１０，ｐＨ４）２５μｌ溶液を、２モル当量のトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で、５０℃にて１０分間インキュベートした。次いで、１００モル当量の過剰量のＮ−フェニル−マレイミドを加え、５０℃にて３０分間反応を行った。反応混合物に２００μｌの０．１％ＴＦＡ水溶液を加えた後、逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣ（メルク社製，リクロスフェアー，φ４×１２５ｍｍ）に付し、０．１％ＴＦＡ水溶液中、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、８０分間で５％から４５％までのアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる測定で、モノ還元−ジアルキル化されたペプチドが得られ、このものをさらに還元的アルキル化を行うことなく、配列決定を行なった。その結果、部分的還元的アルキル化されたペプチドのＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる測定では、分子内の１つのジスルフィド結合が還元され、かつアルキル化された遊離のシステイン残基の存在が確認された。エドマン分解（Ｅｄｏｍａｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）により変換された３−フェニル−２−チオヒダントイン（ＰＴＨ）でのシステイン残基は、ＨＰＬＣにより１９位および３４位にあると同定された。これらの結果から、ＨｓＴＸ１に存在する１つのジスルフィド結合は、Ｃｙｓ19−Ｃｙｓ34にあると判定された。ｂ）酵素による分解一方、ＨｓＴＸ１のトリプシンによる分解を、Ｐｏｒｏｓｚｙｍｅ（登録商標）固定化トリプシンカートリッジ（パーセプティブ バイオシステム製，アメリカ）を用いて行った。すなわち、４０℃に設定したオーブン中で、カートリッジをＨＰＬＣシステム上に装着し、消化緩衝液（１０ｍＭの塩化カルシウム，５０ｍＭのトリス−塩酸，ｐＨ８）：アセトニトリル（９５：５，ｖ／ｖ）中で、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化させた。後記する実施例３で合成した合成ＨｓＴＸ１の１ナノモルを５０μｌの消化緩衝液に溶解し、５０μｌ／ｍｉｎの流速でカラムに注入した。２０分反応させた後溶出をやめ、反応混合物を、次いで３つのカラム充填量（１００μｌ）の消化緩衝液：アセトニトリル（９５：５，ｖ／ｖ）溶液にて溶出し、それぞれの溶出液を、６μｌの６Ｎ−ＨＣｌ（最終ｐＨ〜２）を含有するポリエチレンチューブ中に集め、直ちに−８０℃で保存した。得られた反応混合物を、逆相Ｃ１８−ＨＰＬＣ（メルク社製，φ４×１２５ｍｍ）に付し、０．１％ＴＦＡ水溶液中、８０分間で０％から４５％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出させ、溶出開始３分後より、流速１ｍｌ／ｍｉｎにて２３０ｎｍのＵＶ吸収をモニターしながら、ピークを示す画分を得た。得られた画分は、物理化学的分析（質量分析、配列決定）を行うまで凍結させた。２４分後に溶出したトリプシンのフラグメントを、更にＡｓｐＮ−エンドペプチダーゼ（１０ｍＭのｐＨ８．１のトリス−塩酸１μｌ中、約４０ピコモルのペプチドに対するペプチダーゼの比率は、約４％ｗ／ｗ）による分解を行い、ミクロプレート上にて直接ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を行った。この酵素分解で４個のフラグメントを得ることができた。反応の収率は定量的であり、反応中ジスルフィド結合のランダムな再編成は起こらなかった。得られたフラグメントの質量分析ならびに配列決定によりジスルフィド結合様式を解析した。その結果、トリプシンで消化させて、２４分後に溶出した画分のペプチドには、９，１３，２９および３１位にハーフシスチン残基を含む２個のジスルフィド結合が含まれていることが判明した。このフラグメントの約４０ピコモルを、更にＡｓｐＮ−エンドペプチダーゼにより分解した後、ミクロプレート上にて直接ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定を行った結果からは、２つのフラグメント中には、Ｃｙｓ13−Ｃｙｓ31およびＣｙｓ9−Ｃｙｓ29に相当するジスルフィド結合が存在することが確認された。以上の結果より、本発明のＨｓＴＸ１は、Ｃｙｓ3−Ｃｙｓ24，Ｃｙｓ9−Ｃｙｓ29，Ｃｙｓ13−Ｃｙｓ31およびＣｙｓ19−Ｃｙｓ34の４箇所にジスルフィド結合を有することが明らかになった。ステップ５．円偏光二色性によるコンフォメーション解析本発明のペプチド、すなわち、天然体ＨｓＴＸ１、後記実施例３で得た合成ＨｓＴＸ１およびそのＣ末端カルボン酸体であるＨｓＴＸ１−ＣＯＯＨ、ならびにキャリブドトキシン（ＣｈＴＸ：ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ，ペプチド研究所製，日本）の４者の紫外線スペクトルを、Ｊａｓｃｏ Ｊ−６００円二色計（ｄｉｃｈｒｏｇｒａｐｈ）により、（＋）−カンファー１０−スルホン酸を基準物質として測定した。測定には１ｍｍの透過厚のセルを用いて行い、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）中にて室温下、２６０〜１９０ｎｍの波長でのスペクトルを測定した。スペクトルデータは、スキャン比率１００ｎｍ／ｍｉｎをもつ０．１ｎｍのインターバルにて、５００分間行なった。試験に用いた各ペプチドの濃度を、アミノ酸分析により８０μｇ／ｍｌにそろえた。データは残基に対する分子楕円率で示し、解析をＣｏｍｐｔｏｎおよびＪｏｈｎｓｏｎの方法（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５５巻，１５５−１６７頁，１９８６年）により行った。その結果、本発明のペプチドである後記実施例３で得られた合成ＨｓＴＸ１、ならびにそのＣ−末端カルボン酸体であるＨｓＴＸ１−ＣＯＯＨの円二色性スペクトル（ＣＤスペクトル）は、天然体のＨｓＴＸ１のＣＤスペクトルとほとんど同一のものであった。ＨｓＴＸ１の二次構造の比較のために、ＣｈＴＸのＣＤスペクトルと対比してみると、ＣｈＴＸのＣＤスペクトルは、ＨｓＴＸ１のＣＤスペクトルに比較し、極小吸収ならびに極大吸収がわずかにシフトしていることが判明した。すなわち、ＨｓＴＸ１の２２０ｎｍに見られた極小吸収は、ＣｈＴＸでは２１８ｎｍへとシフトし、ＨｓＴＸ１の１９０ｎｍに見られた極大吸収は、ＣｈＴＸでは１９５ｎｍへとシフトしていた。これらの結果から、ＣｈＴＸ、本発明のペプチドであるＨｓＴＸ１−ＣＯＯＨ、合成ＨｓＴＸ１ならびに天然体ＨｓＴＸ１の４者には、α−ヘリックス構造（それぞれ、３６％，２９％，３４％および２８％）、β構造（それぞれ、１８％，２１％，２０％および２０％）ならびにβターン構造（それぞれ１９％，１４％，１２％および１４％）が存在することが明らかとなった。これらの構造解析データからは、ＨｓＴＸ１の折りたたみ構造は、ＣｈＴＸの折りたたみ構造と似通っているものと思われた。Ｐｉ１（文献前出）およびマウロトキシン（ｍａｕｒｏｔｏｘｉｎ，カラット等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４２巻，４９１−４９８頁，１９９６年）の両者は、同様な折りたたみ構造を示すものの、マウロトキシンは特異的なジスルフィド結合パターンを有しているとされている。このことは、ＣｈＴＸのパラメーターを用いて推定した、上記ＨｓＴＸ１の構造の妥当性を示すものである。実施例３．固相法によるＨｓＴＸ１の合成ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−ＳＡＬ樹脂（渡辺化学工業製）を担体として、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）を用い、アプライドバイオシステム社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用いて、ＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）の固相法により合成した。（但し、Ｆｍｏｃ＝９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ，ＳＡＬ＝Ｓｕｐｅｒ Ａｃｉｄ Ｌａｂｉｌｅ，Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−Ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−６−ｓｕｌｆｏｎｙｌ，Ｔｒｔ＝Ｔｒｉｔｙｌ，ｔＢｕ＝ｔ−Ｂｕｔｙｌ，Ｂｏｃ＝ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。）ペプチド樹脂からのペプチドの切り放しと粗ペプチドの脱保護は、ＴＦＡ：チオアニソール：エタンジチオール（９０：５：５，ｖ／ｖ）混液を、ペプチド樹脂１ｇ当たり約１０ｍｌ加え、室温で１．５〜３時間処理して脱保護および切断を行い、エーテルを加えてペプチドを沈澱させ、沈澱をエーテルで３回洗浄して粗ペプチドを得た。粗ペプチドはＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。得られた精製ペプチドを、１ｍＭの酸化型グルタチオンと１ｍＭの還元型グルタチオンを含む、０．５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に溶解し、室温で３０時間空気酸化して、ジスルフィド結合を導入した。反応終了後、ＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（メルク社製，リクロスフェアー１００オングストローム，ビーズサイズ５μｍ，φ４×１２５ｍｍ）を用いるＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、５％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液（ｐＨ２．２）で３分間展開した後、０．１％ＴＦＡ水溶液中、３０分間で５％から２０％までのアセトニトリルの直線濃度勾配で、２３０ｎｍのＵＶ吸収でモニターしながら溶出した。天然のＨｓＴＸ１は、このＨＰＬＣの系で保持時間２６．６分の箇所にシングルピークとして溶出されるので、同一の保持時間２６．６分に溶出されるピークを分取して、合成ＨｓＴＸ１を得た。得られた合成品に天然品を混合して、上記ＨＰＬＣの系で分析したところ、保持時間２６．６分にシャープなシングルピークとして検出された。また、合成品は、ＭＳ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、分子量は３８１５．６７と測定され、天然品で測定された分子量、３８１５．６３と良く一致した。実施例４．ＨｓＴＸ１の注射用製剤の調製実施例３で得た合成ＨｓＴＸ１ １ｍｇを注射用蒸留水２０ｍｌに溶解させ、０．２２μｍのフィルター濾過を行い、除菌後、１ｍｌづつアンプルに無菌充填し、ＨｓＴＸ１の注射用製剤を調製した。評価例１．Ｋ+チャンネル阻害試験Ｋ+チャンネルに対する阻害試験は、ラット脳の電圧開閉型Ｋ+チャンネルであるＫｖ１．３（スチューマー等，ＥＭＢＯ Ｊ．，８号 １１巻 ３２３５−３２４４頁，１９８８年に記載）の遺伝子（神経生物学分子研究所 ハンブルグ ドイツのＯ．ポングス教授より恵与された）を、慣用技術に従ってｐＡＳ１８ベクターに挿入し、プラスミドをＥｃｏＲ１で処理したのち、クローンをトランスクリプションキット（米国・スタラータジーン社製）を用いて、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼでイン・ビトロに転写した。得られたｃＲＮＡは電気生理実験の１６−７２時間前にアフリカツメガエルの卵母細胞に注入した。Ｋｖ１．３を発現させた卵母細胞を、５０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＮＤ９６溶液（０．３ｍＭ ＣａＣｌ2，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，２ｍＭ ＫＣｌ，９６ｍＭ ＮａＣｌを含む、ｐＨ７．６の５ｍＭヘペス緩衝液）を充たした容量１００μｌの実験槽に入れ、ＮＤ９６溶液を４ｍｌ／ｍｉｎの流量でリザーバーから灌流した。測定すべき試料は、ＮＤ９６溶液に溶解し、リザーバーから灌流させる方法で添加した。実験毎のリザーバーの切替えはテフロンバルブで行った。全ての実験は室温（約２２℃）で行った。卵母細胞に２本の、３ＭＫＣｌを充たした微小電極（内部抵抗０．５−２ＭΩ）を差し込み、実験槽の電位を０Ｖに固定したモードで、Ａｘｏｃｌａｍｐ−２型二電極電位固定アンプ（アクソン機器製）を用いて電位固定した。電流は１ｋＨｚのローパスフィルター（−３ｄＢ，８ポール−ベッセル型フィルター／サイバー アンプ，アクソン機器製）を通し、デジデータ１２００型インターフェース（アクソン機器製）を用いて１０ｋＨｚでサンプリングし、デジタル化して、オフライン分析のために光磁気ディスクに保存した。電位のプログラム、記録および保存したデータの解析は、コンパックＰＣコンピューターにピークランプソフトウェア（アクソン機器製）を走らせて行った。測定は、固定電位は−８０ｍＶ、固定電流は−４０ｎＡ以下で行った。その結果、本発明のペプチドであるＨｓＴＸ１は、５０％阻害濃度（ＩＣ50）が１２±１．６ｐＭという極めて強いＫ+チャンネルのブロック作用を示した。これは、同様の作用を示すサソリ毒素であるＰｉ１（文献前出）の約８００倍の強さである。評価例２．ラットＫｖ１．３チャンネルに対するＨｓＴＸ１の作用本発明のＨｓＴＸ１のＫｖ１．３チャンネルに対する阻害活性を、アフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させた電圧開閉型Ｋ+チャンネルにおける、外向電流の濃度依存による阻害を測定することにより行った。その結果、１０ｐＭ濃度のＨｓＴＸ１は、コントロール（薬物添加なし）に比較して、測定したすべての電圧において外向電流の流れを、ほぼ５０％阻害することが判明した。阻害の回復率をみると、１００ｐＭのＨｓＴＸ１を短時間灌流させた後にコントロールと同様に、薬物添加なしに灌流を行うと、電流の流れは経時的にコントロールの８５％まで回復した。このことから、ＨｓＴＸ１のＫ+チャンネルに対する阻害は、ほぼ可逆的なものであることが判明した。ラットＫｖ１．３チャンネルに対する本発明のペプチドの、濃度依存的な阻害活性カーブを図１に示した。図の結果からも明らかなように、本発明のペプチドである天然体のＨｓＴＸ１と、実施例３で得た合成ＨｓＴＸ１は、全く同一の阻害パターンを示し、その５０％阻害濃度（ＩＣ50）は、天然体ＨｓＴＸ１で１２ｐＭであり、合成ＨｓＴＸ１で約１３ｐＭであり、両者共に極めて強いＫ+チャンネルの阻害作用を示していることが理解される。これに対して、ＨｓＴＸ１のＣ末端がカルボン酸のままであるＨｓＴＸ１−ＣＯＯＨはＩＣ50が６９ｐＭであり、本発明のＨｓＴＸ１に比較し、５分の１程度の活性であった。したがって本発明のペプチドは、Ｃ末端がＣＯＯＨであっても活性を示すが、Ｃ末端がアミド化されることにより特異的なＫ+チャンネル阻害活性を示すことが理解される。評価例３．他の電圧開閉型Ｋ+チャンネルに対するＨｓＴＸ１の作用本発明のＨｓＴＸ１について、他の電圧開閉型チャンネルにおける阻害活性を同様に試験した。使用した電圧開閉型チャンネルとしては、ラット脳の電圧開閉型Ｋ+チャンネルであるサブタイプのＫｖ１．１およびＫｖ１．６の遺伝子からのクローンを用い、前記と同様にアフリカツメガエルの卵母細胞中における実験を行った。その結果、Ｋｖ１．１およびＫｖ１．６は、合成ＨｓＴＸ１により阻害されているものの、そのＩＣ50は、いずれのＫ+チャンネルでも約３００ｐＭ程度であり、Ｋｖ１．３チャンネルに比較してその阻害活性は３０分の１程度であった。この結果から、本発明のペプチドであるＨｓＴＸ１は、Ｋｖ１．３チャンネルに対して特異的な阻害作用を有することが判明した。評価例４．ヒト末梢血Ｔ細胞のＩＬ−２産生に対するＨｓＴＸ１の作用ＨｓＴＸ１について、活性化Ｔ細胞からのＩＬ−２産生に対する抑制作用を試験した。ヘパリン処理健常人末梢血から、モノ・ポリ分離液（大日本製薬製）を用いて遠心分離法により単核白血球を分離し、これをナイロンウールカラムに充填して３７℃３０分間インキュベート後、非付着細胞を単離した。得られた精製Ｔ細胞を１０％非働化牛胎児血清（ウイタカー社製）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、最終濃度が１×１０6／ｍｌとなるよう９６穴平底プレートにまき、刺激剤としてホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（１ｎｇ／ｍｌ）およびｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（２５０ｎｇ／ｍｌ）を加えて３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。ＨｓＴＸ１を培養開始時に０．１，１，１０，１００ｎＭの濃度となるように添加し、ウェルあたりの最終液量を２００μｌとした。２０時間後に培養上清を回収し、各上清中のＩＬ−２の濃度をヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（エンドジェン社製）で測定した。その結果を第２図に示した。図に示すように、本発明のＨｓＴＸ１は、すべての濃度においてヒト末梢血Ｔ細胞のＩＬ−２産生を有意に抑制した（ダンネット検定法）。なお、本発明のＨｓＴＸ１の０．１，１，１０および１００ｎＭの濃度におけるＩＬ−２産生の抑制率は、それぞれ２８．６，４５．７，４６．０および４６．７％であった。上記実施例および評価例において、本発明者らは新たなサソリ毒素関連ペプチドとして、ＨｓＴＸ１と命名したペプチドを単離・合成し、その一次構造および高次構造ならびに電圧開閉型Ｋ+チャンネルおよびＩＬ−２産生抑制に対する生理活性を明らかにした。したがって、ＨｓＴＸ１と類似の一次構造および／または高次構造を有するペプチドであるかぎり、アミノ酸の一部欠失、置換、付加があるペプチドであっても、それらは本発明の電圧開閉型Ｋ+チャンネルに対する遮断活性およびＩＬ−２産生抑制ペプチドとしての技術範囲に包含される。産業上の利用可能性本発明によれば、配列番号１で示され、分子内に０〜４個のジスルフィド結合を有するペプチドおよびその関連ペプチドを、サソリ毒素関連ペプチドとして提供することができる。本発明のペプチドのうちＨｓＴＸ１は、分子内に４個のジスルフィド結合を有し、３４アミノ酸残基からなる神経ペプチドの最初の例であり、Ｋｖ１．３に対する阻害活性がほぼ可逆的であることから、その毒性は十分低いことが予想される。また、本発明のペプチドのうちＨｓＴＸ１は、ヒト末梢血Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を少なくとも０．１ｎＭ以上の濃度で有意に抑制した。ＩＬ−２はＴ細胞の分化増殖を促進するサイトカインであり、この産生抑制はＴ細胞の活性化抑制につながると考えられる。したがって本発明のペプチドおよびその類縁体は、サソリ毒素関連ペプチドの神経生理学における生化学試薬としての用途のみならず、医薬、動物薬への応用にも繋がることが期待され、医薬品への応用としては、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）、自己免疫疾患、臓器移植への適応などがあげられる。配列表配列番号：１配列の長さ：３４配列の型：アミノ酸配列の種類：ペプチド起源：生物名：サソリ（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ ｓｐｉｎｎｉｆｅｒ）配列の特徴：他の特徴：Ｃ末端アミド化存在位置：３４特徴を決定した方法：Ｅ配列： 次のアミノ酸配列：で示され、分子内に４個のジスルフィド結合を有し、その結合がＣｙｓ3−Ｃｙｓ24、Ｃｙｓ9−Ｃｙｓ29、Ｃｙｓ13−Ｃｙｓ31、及びＣｙｓ19−Ｃｙｓ34である、Ｃ末端がアミド化されていてもよいペプチド。 Ｃ末端がアミド化されている請求項１に記載のペプチド。 請求項１又は２に記載のペプチドからなる電圧開閉型Ｋ+チャンネル遮断作用剤。 請求項１又は２に記載のペプチドからなるＩＬ−２産生抑制剤。 請求項１又は２に記載のペプチドからなる免疫抑制剤。