生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_痴呆症鑑別試薬 |
| 出願番号： | 1998059127 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C12Q 1/533 |
特許情報キャッシュ
藤田 素樹 林 泰三 内田 浩二 松尾 雄志 JP 4143160 特許公報(B2) 20080620 1998059127 19980225 痴呆症鑑別試薬 オリエンタル酵母工業株式会社 000103840 松本 久紀 100097825 戸田 親男 100075775 藤田 素樹 林 泰三 内田 浩二 松尾 雄志 20080903 C12Q 1/533 20060101AFI20080814BHJP JPC12Q1/533 C12Q 1/533 BIOSIS/MEDLINE/WPIDS(STN) CAplus(STN) PubMed JSTPlus(JDreamII) 特開平０８−３２２５９５（ＪＰ，Ａ） Mech. Ageing. Dev.，１９８０年，Vol.14，No.1-2，pp.203-209 Arch. Gerontol. Geriatr.，１９８４年，Vol.3，No.2，pp.161-165 生物試料分析，１９９６年，Vol.19，No.4，pp.227-236 FASEB J.，１９９８年，Vol.12，No.1，pp.17-34 8 1999239500 19990907 10 20050223 特許法第３０条第１項適用 平成９年１０月３日 日本電気泳動学会開催の「第４８回日本電気泳動学会総会」において文書をもって発表 小金井 悟 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、痴呆疾患の鑑別システムに関するものであり、更に詳細には、アルツハイマー型痴呆（ＤＡＴ）と脳血管性痴呆（ＶＤ）とを効果的に鑑別するシステムに関するものである。【０００２】【従来の技術】ホスホグリセリン酸ムターゼ（Phosphoglyceric acid mutase）（ＰＧＡＭということもある：ＥＣ５．４．２．１）は、解糖系酵素の一つで、２，３−ビスホスホグリセリン酸（2,3-bisphosphoglycerate : Glycerate-2,3-P2）の存在下、２−ホスホグリセリン酸（2-phosphoglycerate : Glycerate-2-P）と３−ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerate : Glycerate-3-P）の相互交換を触媒する。【０００３】哺乳動物にはＰＧＡＭをコードする遺伝子が二つ存在する。Ｍサブユニット（分子量約３万）の遺伝子は成人の骨格筋、心筋で発現され、これらの組織ではＭＭホモダイマー（Ｍ型ＰＧＡＭ、Ｍ−ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＭＭ、ＰＧＡＭ−Ｍ又はＭ型アイソザイムともいう）が存在する。Ｂサブユニット（分子量約３万）の遺伝子は成人の脳、肝、腎および赤血球で発現され、これらの組織ではＢＢホモダイマー（Ｂ型ＰＧＡＭ、Ｂ−ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＢＢ、ＰＧＡＭ−Ｂ又はＢ型アイソザイムともいう）が存在する。従って、Ｍ型ＰＧＡＭは筋肉特異的アイソザイムに、またＢ型ＰＧＡＭは非筋肉型あるいは脳型アイソザイムに分類される。ＭおよびＢの両サブユニットの遺伝子は心筋で特異的に発現されており、この組織ではＢ型およびＭ型ＰＧＡＭに加えてＭＢヘテロダイマー（ＭＢ型ＰＧＡＭ、ＭＢ−ＰＧＡＭ、ＰＧＡＭ−ＭＢ又はＭＢ型アイソザイムともいう）も存在する。【０００４】YatesらはＰＧＡＭアイソザイムを分別定量できるisoelectric focusingを使って、正常血漿中のＰＧＡＭ活性が専らＢ型アイソザイムに由来することを示した。また、Markertは正常ヒト胎児および成人の脳では、主にＰＧＡＭのＢ型アイソザイムが存在するが、脳腫瘍組織ではＭＢ型およびＭ型アイソザイムが認められ、発現レベルが腫瘍の悪性度と相関すること、それに対して筋肉特異的酵素であるクレアチンキナーゼ（Creatine kinase:CK）ではそのような変化は認められないことを示した。しかし、これまで、血清中のＰＧＡＭアイソザイムの変動と各種脳性疾患病態との関連についてはあまり調べられておらず、本発明者らが先に特許出願したＢ型ＰＧＡＭの脳卒中マーカーとしての利用が報告されている程度である（特開平８−３２２５９５）。また、痴呆症との関連についての報告もなく、ましてやＤＡＴとＶＤとの鑑別に至っては全く何も知られていない。【０００５】【発明が解決しようとする課題】どの疾患においても正確にして迅速な診断が不可欠であるが、特に痴呆症においては、ＤＡＴとＶＤとではその治療法を大きく異にするため、これらの正確にして迅速且つ簡便な早期鑑別システムの開発が強く求められている。【０００６】【課題を解決するための手段】本発明は、上記した当業界の要望に応える目的でなされたものであって、ＤＡＴとＶＤとを鑑別する方法を求めて各方面から研究した結果、ＰＧＡＭが有用であることをはじめてつきとめただけでなく、血中のＰＧＡＭを測定することによりＤＡＴとＶＤとの鑑別が可能であることもはじめて発見した。【０００７】鑑別マーカーの測定にあたり、血清等の血液サンプルを試料として使用できることは、細胞等を試料としなければならない場合に比して、採取、取扱い、測定の面できわめてすぐれていることにほかならないし、そのうえ、血中の全ＰＧＡＭの測定のほか、ＰＧＡＭアイソザイムの内、血中の主成分であるＢ型アイソザイムを測定することにより両者の鑑別が可能であること、換言すれば、全ＰＧＡＭにかえて血中のＢ型ＰＧＡＭを測定すれば両者の鑑別が可能であることもはじめて見出し、これらの有用新知見に基づき、遂に本発明の完成に至ったものである。【０００８】すなわち、本発明者らは、ＰＧＡＭ（全ＰＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭ）がＤＡＴとＶＤの鑑別マーカーとして有用であることをはじめて明らかにしただけでなく、血液サンプル中のＰＧＡＭを測定することにより両者の鑑別が可能であること、なかんずく、全ＰＧＡＭはもとより、血液中のＢ型ＰＧＡＭを測定するだけで充分両者の鑑別が可能であることもつきとめた。そして更に、両者鑑別のためのＰＧＡＭ、Ｂ型ＰＧＡＭの測定方法として、本発明者らが先に開発した方法（特開平８−３２２５９５）が適用可能なことも確認して、本発明の完成に至ったものである。以下、本発明を詳しく説明する。【０００９】本発明に係るＰＧＡＭの測定方法を、先ず、血中の主成分であるＢ型アイソザイムについて述べる。Ｂ型ＰＧＡＭを測定する方法は、血清等の血液サンプルをＰＧＡＭ阻害剤によって処理し、特定のアイソザイムを失活せしめた後、残存のＰＧＡＭ活性を測定することからなるものである。例えばＰＧＡＭ阻害剤として四チオン酸を用いた場合、Ｍ型アイソザイムはほぼ１００％失活し、ＭＢ型は約５０％失活し、Ｂ型はほとんど失活しない。したがって、血清に四チオン酸を添加してＭ型アイソザイムを失活させた後、残存のＰＧＡＭ活性を測定することにより、Ｂ型アイソザイムを分別定量することができるのである。【００１０】なお、ＰＧＡＭの精製アイソザイムを用いた阻害実験によれば、四チオン酸処理によってＭＢ型は５０％しか失活せず、５０％は活性が残存するが、現実において、正常血清及び脳組織のＰＧＡＭ活性のほとんどは、Ｂ型アイソザイムによるものであるので、ＭＢ型アイソザイムの残存活性は、生体サンプルにおけるＤＡＴとＶＤの鑑別を行う場合においては、これを無視することができることが確認されるとともに、Ｂ型ＰＧＡＭ値と全ＰＧＡＭ値とは、両者の鑑別を行うにおいて、実質的な差異がないこと、換言すれば、血液中のＢ型ＰＧＡＭ値を測定しても全ＰＧＡＭ値を測定しても両者の鑑別が可能であることも確認された。【００１１】ＰＧＡＭ阻害剤としては、酸化剤、ＳＨ試薬等ＰＧＡＭ又はそのアイソザイムの活性を選択的に阻害しうる物質がすべて使用できる。その非限定例としては、ポリチオン酸及び／又はその誘導体が挙げられる。ポリチオン酸は、三〜六チオン酸がいずれも使用可能であって、その誘導体としてはカリウム塩、ナトリウム塩等が使用可能であり、好適例のひとつとして、四チオン酸カリウムが例示される。【００１２】本発明に係る測定方法は、血清等の血液試料に四チオン酸カリウム等の阻害剤を作用させてＰＧＡＭ−Ｍを失活させ（ＰＧＡＭ−ＭＢの活性は上記したように本生体測定系においては無視できる）、残存のＰＧＡＭ−Ｂを測定試薬を用いて測定するものである。【００１３】その測定原理は、下記表１に記載したように、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイムの阻害剤である四チオン酸カリウムを用いてＭ型アイソザイムを失活せしめた後、次のようにして活性測定を行うことからなるものである。すなわち、２，３−ビスホスホグリセリン酸（Glycerate-2,3-P2）の存在下、ＰＧＡＭ−Ｂによって、３−ホスホグリセリン酸（Glycerate-3-P）を２−ホスホグリセリン酸（Glycerate-2-P）とし、これをエノラーゼによりＰＥＰとＨ2Ｏとする。次いでＰＥＰを、ＡＤＰの存在下ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）によりピルビン酸（Pyruvate）とＡＴＰとにし、得られたピルビン酸に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を作用させ、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ（rate assay）するものである。【００１４】【表１】【００１５】ＮＡＤＨの減少は市販の測定機器によって容易に測定することができ、ＰＧＡＭ−Ｂが正確に且つ迅速に測定できる（全ＰＧＡＭも同様である）。しかも後述する実施例からも明らかなように、痴呆疾患患者由来の血清サンプル中のＰＧＡＭ値は、ＤＡＴ患者よりもＶＤ患者の方が高く、したがってＰＧＡＭの測定は、ＤＡＴとＶＤとの鑑別にきわめて有効であることが判明し、ＰＧＡＭは両者の鑑別用マーカーとしてきわめて好適であることも実証された。このようなことは従来全く知られておらず、ＰＧＡＭは鑑別用新規マーカーと認められる。【００１６】また、本発明によれば、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、ＮＡＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、ＰＧＡＭ阻害剤（四チオン酸カリウム等：ＰＧＡＭ−Ｂ測定の場合のみ）を含有し、更に必要に応じて、基質、緩衝液を含有したＰＧＡＭ−Ｂ測定試薬を提供することができ、これはＤＡＴとＶＤの鑑別剤として利用することができる。本試薬は、後記実施例に例示したように試薬１及び試薬２としてキットとして市販することも可能である。【００１７】以上、ＰＧＡＭ−Ｂの測定について述べたが、全ＰＧＡＭ（単にＰＧＡＭ又はＴ−ＰＧＡＭということもある）も、Ｂ型アイソザイムと同じ行動を示し、Ｔ−ＰＧＡＭもＰＧＡＭ−Ｂと全く同様にＤＡＴとＶＤの鑑別に利用することができる。【００１８】Ｔ−ＰＧＡＭの測定方法も、阻害剤を使用しないだけで、他はＢ型アイソザイムの場合と全く同一であって（その測定原理も、表１に示した測定原理の内、阻害剤を使用する（１）を除き、そして（２）のＰＧＡＭ−ＢをＴ−ＰＧＡＭに代えた点を除き、全く同一である）、ＮＡＤＨの減少をレートアッセイ法で測定すればよく、Ｂ型アイソザイムの場合と同様に、Ｔ−ＰＧＡＭの測定もＤＡＴとＶＤの鑑別に利用することができる。この場合は、阻害剤を使用することなく測定することができ、両者の鑑別において有効性が高いものである。【００１９】Ｔ−ＰＧＡＭの測定試薬及び同キットについても、阻害剤を使用する点を除き、Ｂ型アイソザイムの場合と全く同一であり、上記した理由と同じ理由により、これ（ら）もＤＡＴとＶＤの鑑別用試薬としてきわめて有効に利用することができる。以下、本発明の実施例について述べる。【００２０】【実施例１】下記表２の作業手順、条件にしたがい、血清試料について、血中ＰＧＡＭ値を日立７１５０自動分析器を用いて測定した。対象は、アルツハイマー型痴呆（ＤＡＴ）患者６８例、血管性痴呆（ＶＤ）患者５４例とし、痴呆の程度や平均年齢には有意差はなかった。検体は、すべて早朝空腹時に採取された。【００２１】【表２】【００２２】測定試薬としては、下記組成を有する試薬１（Ｒ−１）及び試薬２（Ｒ−２）を用いた。【００２３】【００２４】【００２５】試薬１（Ｒ−１）２５０μｌと、血清サンプル５μｌを混合し、５分間放置した。次いで試薬２（Ｒ−２）を用いてＰＧＡＭの活性を測定した。試薬２（Ｒ−２）にはグリセリン酸−３−リン酸（基質）が含まれているので、試薬２を４１μｌ添加することによって反応を開始せしめた（基質スタート）。試薬２の添加から約１．５分後に測定を開始した。【００２６】測定には日立７１５０自動分析装置を用い、アッセイコードをＲＡＴＥ−Ａ：３２−３９、測定温度を３７℃に設定し、約１．５分ＮＡＤＨの減少による吸光度Ａ３４０ｎｍの減少を測定した。なお、副波長は４０５ｎｍで測定を行った。【００２７】酵素の１単位（１Ｕ：１unit）は、３７℃で１分当りに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量と定義した。実際の測定値は、レートアッセイ値に検量係数（Ｋ ＦＡＣＴＯＲ）を乗じて求めた。得られた結果を図１に示した。【００２８】その結果から明らかなように、血中ＰＧＡＭ値はＤＡＴで３７．７±２２．３Ｕ／ｌ、ＶＤは５２．１±３７．６Ｕ／ｌで、両群間に有意差がみられた（Ｐ＜０．０５、ｔ−ｔｅｓｔ）。本発明者らは、健常者５０例並びにルーチン検査が正常範囲内の外来患者２２７例（６〜８９才）のデータから、２２〜６０Ｕ／ｌを正常範囲としている。ＤＡＴでは８例（１２％）が高値、１０例（１４％）が低値であった。一方、ＶＤでは１３例（２４％）が高値を示したが、低値を示したのは１例（２％）のみであって、ＤＡＴに比してＶＤで高値を示した。【００２９】上記結果から、血中ＰＧＡＭ値は、両痴呆間に有意差があり、両痴呆疾患の鑑別に利用できることが明らかになり、ＰＧＡＭ値が両者の鑑別用マーカーとして利用できることが立証された。【００３０】【実施例２】四チオン酸カリウムのＰＧＡＭ−Ｂ及びＰＧＡＭ−Ｍに対する影響を自動分析法によって検討した。試料としては、Ｂ型及びＭ型の標準品（いずれもプール血清ベース）を用い、生理食塩水で希釈して１／１〜１／８のサンプルを用意した。これらのサンプルに各種濃度の四チオン酸カリウムを添加し、５分間反応させた後、Ｂ型及びＭ型ＰＧＡＭ量を自動分析法を利用して測定した。【００３１】実施例１の試薬を用い、自動分析法によってＰＧＡＭ−Ｂ、ＰＧＡＭ−Ｍ量をそれぞれ測定し、下記表３の結果を得た。その結果から明らかなように、四チオン酸カリウムによってＭ型アイソザイムのみが特異的に失活し、Ｂ型アイソザイムは全く影響されないことが判った。【００３２】【表３】【００３３】【実施例３】実施例１で用いた血清試料について、Ｍ型ＰＧＡＭアイソザイム阻害剤として四チオン酸カリウムを用いて、ＰＧＡＭ活性の測定を行った。測定試薬としては、実施例１で使用したＰＧＡＭ活性測定試薬（Ｒ−１）に２．２５ｍＭ（最終濃度１．９ｍＭ）となるように四チオン酸カリウム（分子量３０２．４）を添加溶解し（（Ｒ−１）試薬２２ｍｌに四チオン酸カリウムを１５ｍｇ溶解）、Ｍ型を失活させ、Ｂ型ＰＧＡＭ活性測定試薬を調製した。【００３４】試薬１（Ｒ−１）に四チオン酸カリウムを添加溶解した液２５０μｌと、血清サンプル５μｌを混合し、５分間放置した。その間に血清サンプル中のＭ型（及びＭＢ型）ＰＧＡＭが失活、阻害されるので、以下、試薬２（Ｒ−２）を用いてＢ型ＰＧＡＭの活性を測定した。その結果、Ｔ−ＰＧＡＭの場合と同様に、Ｂ−ＰＧＡＭ値もＤＡＴに比してＶＤの方が高く、Ｂ−ＰＧＡＭが両者の鑑別に利用できることが示された。【００３５】【発明の効果】本発明により、ＰＧＡＭ（Ｂ−ＰＧＡＭも同様）を測定することにより、ＤＡＴとＶＤとを迅速且つ正確に鑑別することが可能となってので、両者の正確な早期診断が可能となり、的確な痴呆症の治療を早期から実施することができる。【図面の簡単な説明】【図１】アルツハイマー型痴呆（ＤＡＴ）と血管性痴呆（ＶＤ）における血中ＰＧＡＭ濃度を示す。 血清中のホスホグリセリン酸ムターゼ（PGAM）又はそのB型アイソザイム測定試薬からなり、アルツハイマー型痴呆（DAT）と血管性痴呆（VD）とを鑑別するものであること、を特徴とする痴呆症鑑別試薬。 PGAM測定試薬が、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、NADH、乳酸デヒドロゲナーゼを含有するものであること、を特徴とする請求項１に記載の試薬。 B型アイソザイム測定試薬がPGAM阻害剤を含有すること、を特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の試薬。 PGAM阻害剤がポリチオン酸、又はそのカリウム塩、又はナトリウム塩であること、を特徴とする請求項３に記載の試薬。 PGAM阻害剤が四チオン酸のカリウム塩及び／又はナトリウム塩であること、を特徴とする請求項４に記載の試薬。 請求項１〜２のいずれか１項に記載の試薬を用いて、人体から採取した後の血液中のPGAMをレートアッセイ法によって測定すること、を特徴とする痴呆症の識別方法。 請求項１〜２のいずれか１項に記載の試薬及びPGAM阻害剤を用いて、人体から採取した後の血液を処理した後、PGAMのB型アイソザイムをレートアッセイ法によって測定すること、を特徴とする痴呆症の識別方法。 PGAM又はそのB型アイソザイムからなり、アルツハイマー型痴呆（DAT）と血管性痴呆（VD）とを鑑別する、痴呆症の鑑別用マーカー。