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| タイトル： | 特許公報(B2)_フラボノイド可溶化法、その糖転移法及び高濃度フラボノイド溶液 |
| 出願番号： | 1996281442 |
| 年次： | 2008 |
| IPC分類： | C08B 37/00,C12P 19/44,A61K 31/70 |
特許情報キャッシュ
西村 隆久 岡田 茂孝 米谷 俊 中江 貴司 滝井 寛 JP 4202439 特許公報(B2) 20081017 1996281442 19961001 フラボノイド可溶化法、その糖転移法及び高濃度フラボノイド溶液 江崎グリコ株式会社 000000228 西村 隆久 岡田 茂孝 米谷 俊 中江 貴司 滝井 寛 20081224 C08B 37/00 20060101AFI20081204BHJP C12P 19/44 20060101ALI20081204BHJP A61K 31/70 20060101ALN20081204BHJP JPC08B37/00 ZC12P19/44A61K31/70 C08B 37/00-37/18 A61K 31/00-31/80 CAplus/BIOSIS/MEDLINE/EMBASE(STN) JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamII) 特開平０７−１０７９７２（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−０８０１７７（ＪＰ，Ａ） 特開平０３−２１５４３４（ＪＰ，Ａ） 5 1998101705 19980421 9 20030929 安川 聡 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、抗酸化作用、抗う蝕作用、血中脂質低下作用その他様々な生理活性を持つフラボノイドの可溶化法及び糖転移法並びに高濃度フラボノイド溶液に関するものである。【０００２】【従来の技術】従来からビタミンＰとして知られているヘスペリジン及びルチン等、並びに、ナリンジン、ネオヘスペリジン等のフラボノイド類はｐＨ３〜１０の領域で難溶性であるため、上記の様々な生理活性の研究が進みながらも、溶液状で添加することを要する食品及び医薬品などの工業製品に利用されていなかった。そこで溶解性を改良するためにこのようなフラボノイド類に糖を転移させたフラボノイド糖転移物が開発されている。これらフラボノイド糖転移物は溶解性が改良されたばかりでなく、小腸でもとのフラボノイドにまで分解されて吸収されると言われている。事実ヘスペリジン糖転移物に小腸由来の酵素を作用させると容易にヘスペリジンとグルコースに分解されることが確認されている。また、得られたフラボノイド糖転移物にもフラボノイドと同等の様々な生理活性があることが研究されつつある。【０００３】フラボノイド糖転移物に関する特許（特開平７ー１０７９７２）で、本願発明者らは、フラボノイド糖転移物の生成量を最も高める方法として、ｐＨ８〜１０のβ−サイクロデキストリン溶液にヘスペリジンを溶解して、ヘスペリジンの溶解度を最大に高めた上で、中性のものと生産性の変わらない耐アルカリ性のサイクロデキストリン合成酵素を作用させる方法を発明した。しかしながら、この方法でも大量のβーサイクロデキストリンを必要とするばかりでなく産業的に実用化するほどの生産レベルに達していなかった。尚、へスぺリジンの溶解度はｐＨが上がると飛躍的に上がるが、現在発見されている耐アルカリ性のサイクロデキストリン合成酵素は、ｐＨ１０を越えると酵素活性が大きく減少する。【０００４】【本発明が解決しようとする課題】従って、酵素反応により、効率的に糖転移反応が行えるｐＨ１０以下の高濃度フラボノイド溶液を作る方法、及び、食品としてそのまま摂取できるｐＨ領域での高濃度フラボノイド溶液を作る方法、並びに、高濃度フラボノイド溶液が産業上切望されていた。【０００５】【課題を解決するための手段】本願発明者は鋭意研究の結果、強アルカリに溶解したフラボノイドを増粘多糖類溶液に添加しさらにｐＨを３〜１０に調整する、若しくは、フラボノイドをｐＨ８〜１０に調整した増粘多糖類溶液に溶解するフラボノイド可溶化法、及び、上記のｐＨ８〜１０に調整したフラボノイド溶液にサイクロデキストリン合成酵素を作用させるフラボノイド糖転移法、並びに、フラボノイド０．５重量％以上及び増粘多糖類を含みｐＨ３〜１０である高濃度フラボノイド溶液を発明した。【０００６】本発明にいうフラボノイドとは、ビタミンＰとして知られているヘスペリジン及びルチン等、並びに、ナリンジン、ネオヘスペリジン及びジオスミン等で、いずれも難溶性である。【０００７】フラボノイドを強アルカリ溶液で溶解する方法は格別のものではない。例えば強アルカリ溶液である水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム等を水で溶解し、ｐＨ１２〜１４に調整する。それにフラボノイドを１〜６重量％好ましくは２〜５重量％添加・攪拌し、溶解させる。【０００８】増粘多糖類溶液の調製方法も格別のものではない。本発明に使用する増粘多糖類にはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ペクチン、ポリガラクチュロン酸、カラギーナン、タラガム、キサンタンガム等がある。本発明において、特にメチルセルロースを用いるとよいようである。これら増粘多糖類の１種類又は２種類以上の組み合わせを、水に溶解させ調製する。当然ながら温水を用いて攪拌力を高くすれば溶解の効率は高まる。【０００９】強アルカリ溶液で溶解したフラボノイドを添加した増粘多糖類溶液のｐＨを３〜８又は８〜１０に調整する方法も格別のものではない。例えば塩酸、酢酸及びリン酸等の酸物質又はｐＨ緩衝作用を持つ物質をｐＨセンサーでチェックしながら逐次添加するとよい。【００１０】又、ｐＨ８〜１０に調整した増粘多糖類溶液の製造方法も格別のものではない。増粘多糖類溶液に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム等のアルカリ物質をｐＨセンサーでチェックしながら逐次添加するとよい。第３発明ではこの溶液にフラボノイドを１〜６重量％好ましくは２〜５重量％添加・攪拌し、溶解させる。【００１１】本発明で使用するサイクロデキストリン合成酵素（1,4-α-D-Glucan; 4- α-D-(1,4-glucano)-transferase(E.C. 2.4.1.19.)。以下、本酵素という）は、澱粉を基質としたときグルコースが６〜８個からなるサイクロデキストリンを合成する酵素であり、一般にドナーのグルコース非還元末端にグルコースの１、４転移反応を行うものである。本発明では本酵素は特にアルカリ耐性であるものが好ましい。アルカリ耐性の本酵素として、例えばＡｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ａ２−５ａ（工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号 ｐ−１３８６４）に由来のものがある。【００１２】本酵素を作用させる条件は格別のものではない。５〜７０℃、０．５〜５０時間作用させる。【００１３】本発明である高濃度フラボノイド溶液は、第１、２又は３発明で得られた各溶液そのものである。又、目的のｐＨに調整した上で常法によりこれらの溶液から塩類や増粘多糖類を除去しもよい。【００１４】【実施例】（実施例１）重量％が０．５％のメチルセルロース溶液に１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジン溶解溶液をヘスペリジンの重量％が４.０％となるように添加した。これら試料を塩酸でｐＨが２．２、３．３、５．０、８．３、９．５、１０．０及び１０．５に夫々調整した後、１６時間、４０℃でインキュベートした。【００１５】（比較例１）水に１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジン溶解溶液をヘスペリジンの重量％が４．０％となるように添加した。これら試料を塩酸でｐＨが２．２、３．０、３．９、６．０、７．０、９．２及び１０．０に夫々調整した後、１６時間、４０℃でインキュベートした。これら１４種類の試料を遠心分離（１００００×ｇ、１０分間）した後、上清に含まれるヘスペリジン量をＨＰＬＣにより分析した。これらの結果を表１及び図１に示した。【００１６】【表１】なお、ＨＰＬＣの分析条件は以下のとおりであった。column;ODS、eluent;AcCN/Pi buffer ＊=20/80、flow rate;0.5ml/min 、column temp;40℃、detector;UV ２８０、*; Pi buffer、KH２PO４ : 6.63g、Na２HPO ４: 0.45g in 1000ml of water 。【００１７】（実施例２）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、１．０重量％メチルセルロースと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、３．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。この溶液をあらかじめ４０℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、アルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。１６時間の作用の後もヘスペリジンの析出は全く生じなかった。作用後の溶液を比較例１と同様にＨＰＬＣで分析したところ、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００１８】（実施例３）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、０．１重量％メチルセルロースと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、３．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、ヘスペリジンの析出は全く生じず、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００１９】（実施例４）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、１．０重量％ペクチンと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、２．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、ヘスペリジンの析出は全く生じず、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００２０】（実施例５）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、０．１重量％ペクチンと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、２．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、ヘスペリジンの析出は全く生じず、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００２１】（実施例６）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、１．０重量％カラギーナンと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、２．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、ヘスペリジンの析出は全く生じず、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００２２】（実施例７）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、１．０重量％カラギーナンと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、１．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、ヘスペリジンの析出は全く生じず、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００２３】（実施例８）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジンを、０．１重量％カラギーナンと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、１．０重量％ヘスペリジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、ヘスペリジンの析出は全く生じず、全ヘスペリジンの８０％以上が糖転移されていた。【００２４】（実施例９）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したナリンジンを、１．２重量％のメチルセルロース液に添加し、３．０重量％のナリンジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。以下、実施例２と同様に実施した結果、２．８２％のナリンジンが溶解していた。【００２５】（比較例２）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解した３．０％重量％ナリンジン溶解溶液を調整した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。この溶液をあらかじめ４０℃に設定しておいた恒温槽にいれた。１６時間の後には、大量のヘスペリジンが析出し、溶解しているナリンジン量を比較例１と同様にＨＰＬＣにより分析したところ、０．２５％のナリンジンが溶解しているのみであった。実施例９と比較例２から得られた結果を比較すると、メチルセルロース溶液にナリンジンを添加することにより、ｐＨ９．５でのナリンジンの溶解度が１１倍となった。【００２６】（実施例１０）１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したナリンジンを、１．２重量％のメチルセルロースと５重量％の可溶性澱粉を含む溶液に添加し、３．０重量％のナリンジン溶解溶液を調製した。この溶液を塩酸でｐＨ９．５に調整した。この溶液をあらかじめ４０℃に設定しておいた恒温槽にいれ、次いで、アルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。１６時間の作用後もナリンジンの析出は全く生じなかった。作用後の溶液を比較例２と同様にＨＰＬＣで分析したところ、メチルセルロースを添加していない通常の反応液と同様の糖転移率で糖転移が行われていた。【００２７】（実施例１１）１．０重量％のｐＨ９．５のメチルセルロース液に１．０重量％となるようにヘスペリジンを添加し、この溶液をあらかじめ４０℃に設定しておいた恒温槽にいれた。１６時間の後に、溶解しているヘスペリジン量をＨＰＬＣにより分析したところメチルセルロースを添加していないコントロールに比べ、約２倍のヘスペリジンが溶解していた。【００２８】（実施例１２）１．０重量％のｐＨ９．５のメチルセルロース液に１．０重量％となるようにヘスペリジンを添加し、この溶液をあらかじめ４０℃に設定しておいた恒温槽にいれた。次いでアルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。作用後の溶液をＨＰＬＣで分析したところ、メチルセルロースを添加していない通常の反応液と同様の糖転移率で糖転移が行われていた。【００２９】（実施例１３）重量％が０．５％メチルセルロース液に１Ｎの水酸化ナトリウム溶液で溶解したヘスペリジン溶液をヘスペリジンの重量％が３.０％となるように調製した。この溶液を塩酸でｐＨ３からｐＨ９．８に調節した。これら溶液を４０度で６時間放置した後、溶解しているヘスペリジン量をＨＰＬＣにより分析したところ図１に示すような結果が得られた。コントロールに比べ、メチルセルロース添加試料では、中性付近からｐＨ１０付近まで有意に可溶化効果が認められた。ｐＨ９付近ではメチルセルロース添加試料コントロールに比べ約１０倍の濃度のヘスペリジンを溶解していた。【００３０】（実施例１４）実施例１で得られたｐＨが８．３、９．５及び１０．０の夫々の試料にアルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。【００３１】（比較例１４）比較例１で得られたｐＨが７．０、９．２及び１０．０の夫々の試料にアルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。実施例１４と比較例１４から、各ｐＨにおけるヘスペリジン糖転移物生成量を、及び、参考として特開平７ー１０７９７２に記載されたβーサイクロデキストリン溶液を使用したときのヘスペリジン糖転移物生成量を分析し表２に示した。尚、ここで示した糖転移量は転移した糖質を除き、ヘスペリジンに換算した量で示している。メチルセルロース溶液はβーサイクロデキストリンの約８倍可溶化させることができた。【００３２】【表２】【００３３】（実施例１５）実施例９で得られたナリンジン溶解溶液にアルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。【００３４】（比較例１５）比較例２で得られたナリンジン溶解溶液にアルカリ耐性の本酵素を２ユニット／ミリリッターとなるように添加して作用させた。実施例１５と比較例１５から、ナリンジン糖転移物生成量を分析し表３に示した。尚、ここで示した糖転移量は転移した糖質を除き、ナリンジンに換算した量で示している。コントロールに比べ１１倍の糖転移物が生成された。【００３５】【表３】【００３６】【発明の効果】本発明により、ビタミンＰで知られるヘスペリジン及びルチン等並びにナリンジン及びネオヘスペリジン等のフラボノイドの溶解性を高めることができた。特にアルカリ域で飛躍的に高めることができた。又、それを利用してフラボノイド糖転移物の生産性を高めることができた。又、ｐＨ３〜８で従来にない高濃度フラボノイド溶液をを生成することができた。これらの溶液は健康飲料、健康加工食品及び医薬品に利用できる。又、高濃度フラボノイド糖転移物溶液は常法により粉末化し工業製品とすることができる。【００３７】【図面の簡単な説明】【図１】 実施例１及び比較例１の結果を示す図である。 ヘスペリジン、ルチン、ナリンジン、ネオヘスペリジン及びジオスミンから選ばれる一種以上のフラボノイドを、ｐＨ１２〜１４のアルカリ溶液で溶解し、それをメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ペクチン、ポリガラクチュロン酸、カラギーナン、タラガム、キサンタンガムから選ばれる一種以上の増粘多糖類からなる溶液に添加し、さらにｐＨを３〜８に調整することを特徴とする溶解していないフラボノイドの可溶化法。 ヘスペリジン、ルチン、ナリンジン、ネオヘスペリジン及びジオスミンから選ばれる一種以上のフラボノイドを、ｐＨ１２〜１４のアルカリ溶液で溶解し、それをメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ペクチン、ポリガラクチュロン酸、カラギーナン、タラガム、キサンタンガムから選ばれる一種以上の増粘多糖類からなる溶液に添加し、さらにｐＨを８〜１０に調整することを特徴とする溶解していないフラボノイドの可溶化法。 ヘスペリジン、ルチン、ナリンジン、ネオヘスペリジン及びジオスミンから選ばれる一種以上のフラボノイドを、ｐＨ８〜１０に調整したメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ペクチン、ポリガラクチュロン酸、カラギーナン、タラガム、キサンタンガムから選ばれる一種以上の増粘多糖類からなる溶液に溶解することを特徴とする溶解していないフラボノイドの可溶化法。 請求項２又は３に記載の方法により得られたフラボノイド溶液に、サイクロデキストリン合成酵素を作用させることを特徴とするフラボノイド糖転移法。 ヘスペリジン、ルチン、ナリンジン、ネオヘスペリジン及びジオスミンから選ばれる一種以上のフラボノイドを０．５重量％以上及びメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ペクチン、ポリガラクチュロン酸、カラギーナン、タラガム、キサンタンガムから選ばれる一種以上の増粘多糖類を含み、ｐＨ３〜１０であることを特徴とする高濃度フラボノイド溶液。