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| タイトル： | 特許公報(B2)_キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法 |
| 出願番号： | 1996196938 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | C12N 9/02,C12R 1/38 |
特許情報キャッシュ
三上 洋一 松本 清一郎 JP 3735956 特許公報(B2) 20051104 1996196938 19960709 キサンチンデヒドロゲナーゼ及び該酵素の製造方法 有機合成薬品工業株式会社 000246398 野崎 銕也 100075498 三上 洋一 松本 清一郎 20060118 C12N 9/02 20060101AFI20051221BHJP C12R 1/38 20060101ALN20051221BHJP JPC12N9/02C12N9/02C12R1:38 特開平９−２１５４８（ＪＰ，Ａ） Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 2 (1991) p.203-211，１９９１年 J. Bacteriology, 163 [2] (1985) p.600-609，１９８５年 J. Bacteriology, 172 [10] (1990) p.5999-6009，１９９０年 Biochimica et Biophysica Acta, 1188 (1994) p.432-438，１９９４年 Biochimica et Biophysica Acta, 410 (1975) p.12-20，１９７５年 FASEB J., 8 [7] (1994) p.A1422，１９９４年 Agric. Biol. Chem., 43 [4] (1979) p.753-760，１９７９年 2 FERM P-15104 1998023887 19980127 10 20020523 高堀 栄二 【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は耐熱性のキサンチンデヒドロゲナーゼ及びその製造方法に関する。本発明におけるキサンチンデヒドロゲナーゼは、耐熱性酵素による核酸塩基交換反応を利用したヌクレオシド化合物の製造において有用な酵素である。【０００２】【従来の技術】従来、キサンチンデヒドロゲナーゼに関する報告は次のようなものがある。▲１▼Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、４１０巻、１２−２０頁（１９７５年）、▲２▼Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３巻、７５３−７６０頁（１９７９年）。しかしながら、▲１▼及び▲２▼で報告されているキサンチンデヒドロゲナーゼの至適温度はそれぞれ３０℃と４０℃であり、いずれも耐熱性が低く、耐熱性のキサンチンデヒドロゲナーゼは今まで見い出されていなかった。一般に、酵素を利用する反応では耐熱性酵素を用いることにより、反応温度を高く設定できるので、高濃度反応が可能となり、また、反応速度の向上が図られ、さらに雑菌汚染が少ない条件下で酵素を用いることができるという利点がある。【０００３】【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は耐熱性に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼを提供することにある。【０００４】【課題を解決するための手段】本発明者は上述の課題を解決すべく耐熱性に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼを鋭意探索した結果、至適温度及び作用適温の範囲において従来知られているものと性質を異にする耐熱性キサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物を見い出し本発明を完成するに至った。【０００５】 すなわち、本発明はシュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）が産生する次の理化学的性質を有するキサンチンデヒドロゲナーゼである。（１）作用【０００６】【化２】【０００７】（２）基質特異性ヒポキサンチン、キサンチンに対して作用する。（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ至適ｐＨは８．９付近であり、ｐＨ７〜９において６０℃で３０分加熱しても失活しない。（４）至適温度及び作用適温至適温度は６０℃付近、作用適温は４０〜７０℃。【０００８】（５）熱安定性ｐＨ７における酵素活性の半減期は、４０℃において１３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃において２５時間である。（６）阻害Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受ける。（７）活性化電子受容体を必要とする。（８）分子量ゲルろ過法による分子量は１４１，０００。【０００９】（９）サブユニットの分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニットの分子量は５６，０００及び８４，０００。（１０）ミカエリス定数ミカエリス定数（Ｋｍ）はキサンチンに対して０．３２７ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに対して０．０６０ｍＭ。（１１）等電点等電点電気泳動法による等電点（ｐＩ）は６．０。【００１０】 及び、本発明は上述のキサンチンデヒドロゲナーゼを産生するシュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製造方法である。【００１１】以下、本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼ及びその製造方法について説明する。本発明で用いられる該酵素の産生菌は、本発明における理化学的性質を有するキサンチンデヒドロゲナーゼを産生する微生物であれば特に制限されないが、好ましくは、本発明者によって土壌中から分離されたシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０（以下、本菌株という）である。【００１２】本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４である。本菌株の菌学的性質をバージェイズ・マニュアル・オブ・システマテック・バクテリオロジー第２巻に準じて検討した結果を以下に示す。１．形態桿菌：１．６〜３．２μm×０．６〜０．７μm２．培養的性質ニュートリエントブロス培地：５０℃、２日間培養平板上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。コロニーの形は円形。スラント上：黄色。光沢あり、透明、盛り上がらない。生育は中程度。【００１３】３．生化学的性質（１）グラム染色 陰性（２）嫌気的性質 生育せず（３）運動性 あり、単極毛（４）オキシダーゼ 陽性（５）カタラーゼ 陰性（６）ゼラチンの液化 液化能なし（７）ＯＦテスト 陰性（８）グルコースからの酸の産生 産生せず【００１４】（９）ラクトースからの酸の産生 産生せず（１０）キシロースからの酸の産生 産生せず（１１）ガラクトースからの酸の産生 産生せず（１２）硝酸塩の還元 陽性（１３）硝酸カリウムの脱窒能 陰性（１４）無機窒素源の利用ＮＯ3 を唯一の窒素源として 生育しないＮＨ4 を唯一の窒素源として 生育した（１５）独立栄養の基質ＣＯを唯一の炭素源として 生育しない【００１５】（１６）生育温度 ４０〜５５℃で生育至適 ４８〜５３℃（１７）尿素の加水分解 分解能なし（１８）クエン酸の利用 陰性（１９）インドールの産生 陰性（２０）ＧＣ含量 ６７．７％以上の菌学的性質に基づき、本菌株はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）に属することが判明した。【００１６】本菌株の培養は、シュードモナス属に属する微生物の通常行われる条件で行えばよい。大量に培養するには液体培地を用い、浸盪培養又は通気攪拌培養により好気的条件下で行うことが好ましい。培地としては炭素源及び窒素源としてトリプトン、ペプトン又は肉エキスを含む培地を用いることができる。本菌株が生育し本酵素が十分に産生される条件下であれば、培養温度、培養時間、培養のｐＨは特に制限されない。培養条件によって変動することもありうるが、培養温度は４５〜５３℃、培養時間は１０〜１００時間、培養のｐＨは７〜７．５で行うことが好ましい。【００１７】培養物からキサンチンデヒドロゲナーゼを採取する方法は、通常用いられる方法に従って行えばよい。例えば、遠心分離などによって集菌した菌体を超音波破砕、ガラスビーズなどで機械的に破砕した後、遠心分離などにより細胞片などの固形物を除き、粗酵素液を得る。次に、硫安、芒硝などの塩析法、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどによる金属凝集法、プロタミン、エチレンイミンポリマーなどによる凝集法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどによるクロマトグラフィー法を用いて精製することができる。【００１８】【発明の実施の形態】以下本発明の実施の形態を実施例により詳しく説明する。なお、キサンチンデヒドロゲナーゼにおける酵素活性単位は、１分間当たり１μｍｏｌの尿酸を産生する酵素量を１ｕｎｉｔと定義する。ＮＡＤはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、ＮＡＤＰはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を、ＮＢＴはニトロブルーテトラゾリウムを、ＩＮＴは３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈテトラゾリウムクロリドを表す。【００１９】製造例シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０の培養及び集菌ニュートリエントブロス（ディフコ社製）８ｇ、ヒポキサンチン１ｇ及び水１ＬからなるｐＨ７の培地を用いた。２Ｌの三角フラスコに培地０．５Ｌを入れ滅菌した後にシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）の菌体３×１０7 個を添加し、培養温度５０℃、２００ｒｐｍで回転させつつ、１５〜２０時間培養した。培養終了後、菌体を遠心分離（１０，０００ｇ、４℃、１０分）により集菌した。【００２０】【実施例】実施例１１．酵素の分離精製製造例で得られた湿菌３０ｇを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、超音波で菌体を破砕した。菌体破砕液５０ｍｌについて超遠心分離（３０，０００ｇ、１０分）を行い、上清４０ｍｌを得た。上清に硫酸プロタミンを０．２５重量％になるように添加し４℃で撹拌した後、超遠心分離（３０，０００ｇ、１０分）を行い上清４０ｍｌを得た。次に、上清に硫酸アンモニウムを２５重量％になるように添加し、４℃で１５分撹拌した後、２０分放置し遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）を行った。【００２１】上清にさらに硫酸アンモニウムを４５重量％になるように添加し４℃で１５分撹拌した後、２０分放置し遠心分離（１０，０００ｇ、２０分）を行い沈殿５ｇを得た。次いで、沈殿に１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）５ｍｌを添加し、懸濁させた後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２Ｌを用いて２０時間透析を行った。透析終了後、超遠心分離（３０，０００ｇ、１０分）を行い、上清１２ｍｌを得た。【００２２】この上清を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ファルマシア社製）９０ｍｌを充填したカラム（φ２５×３３０ｍｍ）に添加した。続いて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００ｍｌと１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００ｍｌとでリン酸濃度が上昇するグラジエントをつくり、溶出した。活性画分３０ｍｌを分取し、限外ろ過で３ｍｌに濃縮した。得られた溶液を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＳｕｐｅｒｒｏｓｅ１２（ファルマシア社製）カラムでゲルろ過を行い、キサンチンデヒドロゲナーゼ（以下、本酵素という）１３ｍｇを得た。【００２３】２．理化学的性質１で得られた本酵素の理化学的性質は以下のとおりであった。（１）作用及び基質特異性本酵素２μｇ、表１に示す０．５ｍＭの各種基質及び０．５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、分解した基質を定量した。結果を表１に示す。本酵素はヒポキサンチン、キサンチンに対してのみ作用した。【００２４】【表１】【００２５】（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含む、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６〜７．５）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．７〜８．７）又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．７）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量した。結果を図１に示す。ｐＨ８．９付近において高い酵素活性が認められた。また、本酵素を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で６０℃で３０分加熱した後、残存する酵素活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ７〜９において失活しなかった。【００２６】（３）至適温度及び作用適温本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を図２に示す３０〜８０℃の各種温度で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量した。結果を図２に示す。至適温度は６０℃付近であった。至適温度での酵素活性を１００とすると４０〜７０℃の広い範囲で８０％以上の相対活性が認められた。【００２７】（４）熱安定性本酵素を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で各々４０、５０、６０℃においてインキュベートし、経過時間における残存する酵素活性を測定した。酵素活性は、本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量して求めた。結果を図３に示す。酵素活性の各種温度における半減期は、ｐＨ７でインキュベートした場合では、４０℃において１３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃において２５時間であった。【００２８】（５）阻害本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び１ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液に、表２に示す０．１ｍＭの各種金属塩を添加し５０℃で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量することにより金属イオンによる影響を調べた。結果を表２に示す。Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受けた。【００２９】【表２】【００３０】（６）活性化本酵素２μｇ、１ｍＭキサンチン及び表３に示す１ｍＭの各種電子受容体を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量した。その結果、電子受容体の中でも、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、又は２，６−ジクロロインドフェノールを必要とした。【００３１】【表３】【００３２】（７）分子量Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ１２（ファルマシア社製）を用いるゲルろ過法で分子量を測定した。標準蛋白質には、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ（分子量４４０，０００）、Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（分子量１４０，０００）、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（分子量６７，０００）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量４３，０００）、Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（分子量２０，１００）を用いた。その結果、分子量は１４１，０００であった。【００３３】（８）サブユニットの分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）電気泳動法によりサブユニットの分子量を測定した。標準蛋白質には、Ｍｙｏｓｉｎ（分子量２１２，０００）、α−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（分子量１７０，０００）、β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（分子量１１６，０００）、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（分子量７６，０００）、Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（分子量５３，０００）を用いた。その結果、サブユニットの分子量は５６，０００と８４，０００であった。【００３４】（９）ミカエリス定数本酵素２μｇ、０．０３３〜０．５ｍＭキサンチン及び０．０３３〜０．５ｍＭＮＡＤを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）の１ｍｌ溶液を５０℃で１０分間反応させ、生成した尿酸を定量した。キサンチンに対するミカエリス定数（Ｋｍ）は０．３２７ｍＭ、ＮＡＤに対するミカエリス定数は０．０６０ｍＭであった。【００３５】（１０）等電点等電点電気泳動法により等電点（ｐＩ）を測定した。標準蛋白質には、Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（等電点３．５０）、Ｓｏｙｂｅａｎ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（等電点４．５５）、β−Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（等電点５．２０）、Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＢ（等電点５．８５）、Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｂｏｎｉｃ ＡｎｈｙｄｒａｓｅＢ（等電点６．５５）、Ｈｏｒｓｅ Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（等電点６．８５）、Ｌｅｎｔｉ Ｌｅｃｔｉｎ（等電点８．１５、８．４５、８．６５）、Ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ（等電点９．３０）を用いた。その結果、等電点（ｐＩ）は６．０であった。【００３６】【発明の効果】本発明の耐熱性に優れたキサンチンデヒドロゲナーゼを酵素を利用する反応に用いることにより、該反応の反応温度を高く設定することができ、高濃度反応が可能となり、反応速度が向上するとともに、雑菌汚染が少ない条件で酵素を利用する反応ができるという効果を奏する。【図面の簡単な説明】【図１】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの至適ｐＨを示す図である。【図２】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの至適温度及び作用適温を示す図である。【図３】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼの熱安定性を示す図である。 シュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）が産生する次の理化学的性質を有するキサンチンデヒドロゲナーゼ。（１）作用（２）基質特異性 ヒポキサンチン、キサンチンに対して作用する。（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 至適ｐＨは８．９付近であり、ｐＨ７〜９において６０℃で３０分加熱しても失活しない。（４）至適温度及び作用適温 至適温度は６０℃付近、作用適温は４０〜７０℃。（５）熱安定性 ｐＨ７における酵素活性の半減期は、４０℃において１３０時間、５０℃において１２０時間、６０℃において２５時間である。（６）阻害 Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｐｂ2+、Ｍｎ2+によって阻害を受け、Ａｇ+、Ｈｇ+によって著しい阻害を受ける。（７）活性化 電子受容体を必要とする。（８）分子量 ゲルろ過法による分子量は１４１，０００。（９）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニットの分子量は５６，０００及び８４，０００。（１０）ミカエリス定数 ミカエリス定数（Ｋｍ）はキサンチンに対して０．３２７ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに対して０．０６０ｍＭ。（１１）等電点 等電点電気泳動法による等電点（ｐＩ）は６．０。 請求項１記載のキサンチンデヒドロゲナーゼを産生するシュードモナス・エスピー Ｙ−５１０（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１０４）を培養し、培養物から該酵素を採取することを特徴とするキサンチンデヒドロゲナーゼの製造方法。