生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_新規なアミラーゼ、その製造法および用途 |
| 出願番号： | 1995227384 |
| 年次： | 2006 |
| IPC分類： | C12N 9/30,C12R 1/645 |
特許情報キャッシュ
間瀬 民生 森 茂治 横江 正明 JP 3747083 特許公報(B2) 20051202 1995227384 19950810 新規なアミラーゼ、その製造法および用途 天野エンザイム株式会社 000216162 間瀬 民生 森 茂治 横江 正明 20060222 C12N 9/30 20060101AFI20060202BHJP C12R 1/645 20060101ALN20060202BHJP JPC12N9/30C12N9/30C12R1:645 C12N 9/14-9/46 JSTPlus(JOIS) 特開平０６−０５４６８５（ＪＰ，Ａ） 特開平０５−２８４９６８（ＪＰ，Ａ） J. Bacteriol., 1992, Vol.174, No.11, pages 3439-444 Agric. Biol. Chem., 1982, Vol.46, No.6, pages 1539-47 6 FERM P-15097 1997047287 19970218 12 20020715 松田 芳子 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、新規なアミラーゼおよびその製造法に関する。更に詳細にはアクレモニウム（Acremonium）属に属し、アミラーゼを生産する能力を有する微生物から得られ、α−1,6−グルコシド結合を切断する活性をも有する新規なα−アミラーゼ及びその製造法に関する。本発明のアミラーゼは食品用酵素および医薬用酵素として利用される。【０００２】【従来の技術】一般にアミラーゼは澱粉、グリコーゲンなどの基質に作用して、そのグルコシド結合を加水分解する酵素の総称として使用され、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼに大別される。各々の酵素は動物、植物、微生物などに広く分布している。【０００３】一方、枝切り酵素として知られるプルラナーゼはα−1,6−グルコシド結合を加水分解する酵素であり、各種微生物より生産されることが知られている。最近では上記に述べたようなアミラーゼ活性とプルラナーゼ活性のどちらも合わせ持つ酵素が報告されている。即ち、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来の酵素［Agri. Biol. Chem., 51, 9（1987）］、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）由来の酵素［Biochim. Biophys. Acta, 991, 188（1989）］、クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（Clostridium thermohydrosulfuricum）由来の酵素（特公昭64-60376号公報）等である。【０００４】【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これらのアミラーゼ活性とプルラナーゼ活性を合わせ持つ酵素は、その基質特異性において満足できるものではなく、より広い基質に作用する新規なアミラーゼの開発が望まれていた。【０００５】【課題を解決するための手段】このような状況を鑑み、本発明者らは鋭意検討を加えた結果、土壌より新たに採取した微生物がより広い基質特異性を有する新規なアミラーゼを著量生産することを見い出し本発明を完成した。【０００６】新たに土壌より採取した微生物のポテトデキストロース寒天培地（栄研）における性質を以下に記載する。【０００７】生育状態生育度 ：コロニーの直径は23〜25mm（25℃、７日）コロニー表面：綿毛状、白色コロニー裏面：黄土色【０００８】【０００９】有性胞子が観察されないため不完全菌類として分類され、分生子殻、分生子層を形成しないので不完全糸状菌綱（Hyphomycetes）に属する。更に、菌糸が無色で細い、分生子柄が分岐しない、基部から先端に向かい徐々に細くなる、分生子が単細胞、無色、分生子塊になることなどからアクレモニウム（Acremonium）属に分類され、アクレモニウム・エスピー YT-78と命名した。【００１０】参考文献▲１▼ Domsch, K. H., Gams, W., and Anderson, T. -H. 1980. "Comopendium of soil fungi, Vol. 1" p.16-29, Academic Press, London.▲２▼ Tokumasu, S. 1991. Genus Acremonium. J. Antibact. Antifung. Agent. 19巻, p.47-53【００１１】尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に第15097号（FERM P-15097）として寄託されている。【００１２】本菌株を使用して新規なアミラーゼを生産蓄積させる為の培養方法としては、液体培養法、固体培養法の何れでもよいが、好ましくは液体培養法が行われる。具体的に培養法について述べると、液体培養培地の場合は、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地又は天然培地があげられる。【００１３】例えば、炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげられる。【００１４】窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。【００１５】そして無機塩類としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄等の鉄イオン含有化合物、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。【００１６】培養は、振盪培養若しくは、通気攪拌培養等の好気的条件下に於いて、培地をpH４〜８の範囲、好ましくはpH６〜７の範囲に調整し、温度20〜35℃の範囲、好ましくは、25〜30℃で実施し、通常１〜５日間培養するのが望ましいが、この条件以外であっても微生物が生育し、目的とする酵素を生成する条件であれば特に制限されない。【００１７】ついで、これらの粗酵素液を限外ろ過膜で脱塩、濃縮した後、硫安塩析又は有機溶媒沈降等により酵素を回収する。その後、各種クロマトグラフィー、ゲルろ過等を組み合わせて高純度の新規なアミラーゼ標品を得ることができる。このようにして得られた新規なアミラーゼの酵素化学的性質について以下に述べる。【００１８】▲１▼ 活性測定法：１％プルラン0.5mlに0.1Mマッキルバイン緩衝液（pH5.0）0.4ml、酵素液0.1mlを加え、50℃、３０分間反応する。反応後、ソモギー試薬0.4mlを加え、20分間加熱（沸騰水中）する。冷後、ネルソン試薬0.2mlを加え、室温で20分間放置後、精製水4.0mlを加え、500nmで吸光度を測定する。１分間当たり、グルコース１μmolに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とする。【００１９】▲２▼ 基質特異性：各種基質を使用して活性測定法に準じて測定した。溶性澱粉を基質としたときの各種基質に対する活性を表１にまとめて表示する。【００２０】【表１】【００２１】表より明らかなように、0.5％基質の場合には各種澱粉、グリコーゲン、アミロペクチン、アミロース、マルトヘプタオース、マルトヘキサオース、マルトペンタオースに良く作用し、プルランにも作用するが、マルトテトラオース、マルトトリオース、マルトース、イソマルトース、イソマルトトリオース、デキストラン、各種サイクロデキストリンには殆ど作用しない。また、５％基質の場合には0.5％基質ではほとんど作用しなかったマルトテトラオース、マルトトリオース、マルトースにも作用し、イソマルトトリオースにも僅かに作用する。本酵素について、他のアミラーゼと各種基質に対する反応性を比較する。その結果を表２に示す。対象としては、グルコアミラーゼ（Rhizopus niveus由来、Aspergillus niger由来）、α−アミラーゼ（Bacillus subtilis由来）、プルラナーゼ（Enterobacter aerogenes由来）を使用した。【００２２】【表２】【００２３】表からも明らかなように、本発明のアミラーゼはグルコアミラーゼやα−アミラーゼの基質となる溶性澱粉に作用し、更にプルラナーゼの基質となるプルランにも良く作用する広い基質特異性を有していることが特徴である。【００２４】▲３▼ 至適pH ：１％プルランを基質として、各種pHの緩衝液（0.1M マッキルバイン緩衝液）を用いて50℃、30分間反応した。その結果、至適pHは約5.0付近にある。（図１）【００２５】▲４▼ 至適温度 ：１％プルランを基質として、0.1M マッキルバイン緩衝液（pH5.0）を用いて各温度で30分間反応した。その結果、至適温度は約50℃付近にある。（図２）【００２６】▲５▼ pH安定性 ：１％プルランを基質として、酵素液を0.1M マッキルバイン緩衝液（pH３〜７）、0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH７〜８）を用いて40℃、30分間処理した後反応した。その結果、pH安定性はpH５〜９付近にある。（図３）【００２７】▲６▼ 熱安定性 ：１％プルランを基質として、酵素を0.1M マッキルバイン緩衝液（pH5.0）に溶解し、各温度で30分間処理した後反応した。その結果、熱安定性は40℃まで安定である。（図４）【００２８】【００２９】▲８▼ 等電点 ：約5.10【００３０】▲９▼ 阻害剤 ：各種阻害剤（1mM又は10mM）を含む１％プルランを基質として活性測定法に従って反応した。その結果を表２に示す。【００３１】【表３】【００３２】表より明らかなようにNa+,K+,Mn2+,Al3+,Fe2+,Mg2+,Zn2+,Ba2+,Cd2+,Cu2+,Ag+,Ni2+,Co2+,Ca2+,EDTA,Ｎ−エチルマレイミド,モノヨード酢酸で実質的に阻害されず、SDS,Hg2+で強く阻害され、Sn2+,Fe3+,pCMB,SDSでも阻害される。【００３３】更に、本発明の新規なアミラーゼの用途について記載する。本発明の酵素は、上述したようにα-1,4-結合を分解する作用とα-1,6-結合を分解する作用の何れの作用も合わせ持つため、各種の食品に応用する際に有用である。例えば、清酒醸造に於ける醗酵促進、製パンにおける酵素の利用、各種果汁の清澄化にペクチナーゼと併用する等、広く利用することができる。これらの場合の利用方法については、通常の方法が適用できる。【００３４】以下、実施例により本発明を詳述する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３５】【実施例】実施例１ アクレモニウム・エスピー YT-78の培養下記の組成の種培地80ml（pH6.0）を用いてアクレモニウム・エスピー YT-78（FERM P-15097）を接種し、25℃で３日間振盪培養した。【００３６】【００３７】更に、上記組成の培地に0.5％プルランを追加した培地（20Ｌ）を用いて、ジャーファーメンター（30Ｌ）を使用し、25℃、250rpm、0.5vvm、64時間の条件で培養した。培養液を濾過して、粗酵素液を得た。【００３８】実施例２ 酵素の精製実施例１で得られた粗酵素液（10Ｌ）を限外濾過膜濃縮後、80％飽和となるように固形硫安を添加、塩析した。次いで塩析沈殿物を脱塩後、10mMのリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、CM−Toyopearl 650Mカラムにより不純蛋白質を吸着分離した。【００３９】非吸着画分をDEAE−Toyopearl 650Mカラムに流し、吸着した活性画分を食塩濃度を直線的に上げて溶出した。溶出活性画分に硫安を２Ｍ添加溶解し、同様の硫安を含む緩衝液で平衡化したButyl−Toyopearl 650Mカラムに流し、吸着した活性画分を硫安濃度を直線的に低下させて流出した。最後に、溶出活性画分はSepacryl 200Sカラムによるゲル濾過で精製し、単一の精製酵素を得た。本精製酵素を用いて、前述したとおりの酵素化学的性質を明らかにした。【００４０】実施例３ 清酒醸造の醗酵に及ぼす効果500ml容ビーカーに25g相当の蒸米、140mlの酵素液（表４記載）及び1.3％KH2PO4、0.25%NaCl及び６％の乳酸を含む加工水１mlをとり、協会701号酵母懸濁液２mlを加えて15℃に放置した。２日後、75g相当の蒸米を仲留として加え、醗酵を継続した。遠心分離後、東洋濾紙No.5Cでろ過し、ろ液について各種分析した。その結果を表４に示す。【００４１】【表４】【００４２】グルコアミラーゼとして、Rhizopus niveus由来、Aspergillus niger由来及び本発明の酵素を使用して比較した。その結果、本発明の酵素を使用することによって、醪の醗酵速度が促進されることが明らかとなった。【００４３】実施例４ リンゴ果汁の清澄化リンゴ（銘柄：サンフジ）果肉200gに精製水100mlを添加した後、ホモジナイザーで粉砕、綿布ろ過し、リンゴ果汁を得た。【００４４】果汁５mlにペクチナーゼ（ペクチナーゼＧ「アマノ」：天野製薬製）0.5mlと各種酵素（表５に記載）を加え、40℃で２時間処理した。処理後、遠心分離（3000rpm,５分）し、上清を精製水で５倍に希釈し、660nmでの吸光度を測定した。清澄化度を下記式で算出しその結果を表５に示す。【００４５】果汁清澄化度（％）＝（ＯＤC−ＯＤR）／ＯＤC×１００【００４６】【表５】【００４７】その結果、ペクチナーゼと本発明のアミラーゼを併用することによって果汁の清澄化に著しい効果が得られた。【００４８】実施例５ 製パンへの応用小麦粉100g、食塩1.5g、ショートニング３g、イースト２g、ブロム酸カリ1.5mgと適当量の水を用いてストレート・ドウ法での最適水吸収量、最適攪拌時間を用いて28℃で２時間生地発酵した。ガス抜きや型入れは機械的に行い、焼成は218℃で24分行った。なお、しょ糖の添加量は適宜変化させて、本発明の酵素による効果を調べた。その結果、ドウ組成に本発明のアミラーゼを添加することによって、特にしょ糖の添加量が少ない場合において、本発明の酵素を使用することによって、ガス生成量及びローフ容積への効果が著しかった。【００４９】【発明の効果】本発明により、広い基質特異性を有する新規なアミラーゼが提供される。本発明の新規なアミラーゼは、各種食品業界において、有効に利用される。【図面の簡単な説明】【図１】本発明の新規なアミラーゼの至適pHを示す図である。【図２】本発明の新規なアミラーゼの至適温度を示す図である。【図３】本発明の新規なアミラーゼのpH安定性を示す図である。【符号の説明】図中の−●−はマッキルバイン緩衝液を使用した場合であり、−○−はトリス−塩酸緩衝液を使用した場合を示す。【図４】本発明の新規なアミラーゼの熱安定性を示す図である。 下記の酵素化学的性質を有するアクレモニウム属に由来する新規なアミラーゼ。 a. 作用 多糖類及びオリゴ糖類に作用し、グルコースを遊離する。 b. 基質特異性 澱粉、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、マルトヘプタオース、マルトヘキサオース、マルトペンタオースに作用し、プルラン、マルトース、パノースにも作用するが、イソマルトース、デキストラン、サイクロデキストリンには殆ど作用しない。 c. 至適pH 5.0 d. 至適温度 50℃ e. pH安定性 pH 5〜9（40℃、30分） f. 熱安定性 40℃,30分間（pH5.0） g. 分子量 74,000（SDS-PAGE） アクレモニウム属に属する微生物を栄養培地に培養し、以下の酵素化学的性質を有する新規なアミラーゼを生産蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする新規なアミラーゼの製造法。 a. 作用 多糖類及びオリゴ糖類に作用し、グルコースを遊離する。 b. 基質特異性 澱粉、グリコーゲン、アミロース、アミロペクチン、マルトヘプタオース、マルトヘキサオース、マルトペンタオースに作用し、プルラン、マルトース、パノースにも作用するが、イソマルトース、デキストラン、サイクロデキストリンには殆ど作用しない。 c. 至適pH 5.0 d. 至適温度 50℃ e. pH安定性 pH５〜９（40℃、30分） f. 熱安定性 40℃,30分間（pH5.0） g. 分子量 74,000（SDS-PAGE） 請求項１記載の新規なアミラーゼを含んでなる食品用酵素剤。 請求項１記載の新規なアミラーゼを用いて清酒の醪発酵を促進する方法。 請求項１記載の新規なアミラーゼ及びペクチナーゼを併用して果汁を清澄化する方法。 請求項１記載の新規なアミラーゼを用いて、ドウを調製し、焼成してなるパンの製造法。