生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_簡易培地 |
| 出願番号： | 1994284672 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12N1/20,C12M1/16,C12M1/34,C12Q1/04 |
特許情報キャッシュ
水落 慎吾 小高 秀正 JP 3630737 特許公報(B2) 20041224 1994284672 19941118 簡易培地 日水製薬株式会社 000226862 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 的場 ひろみ 100101317 水落 慎吾 小高 秀正 20050323 7 C12N1/20 C12M1/16 C12M1/34 C12Q1/04 JP C12N1/20 A C12M1/16 C12M1/34 B C12M1/34 D C12Q1/04 7 C12N 1/20 C12M 1/16 C12M 1/34 C12M 1/34 C12Q 1/04 JSTPlus(JOIS) BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed 特開平６−３１５３９７（ＪＰ，Ａ） 特開昭５５−１２７９８５（ＪＰ，Ａ） 特開平６−３１１８８０（ＪＰ，Ａ） 国際公開第９３／１２２１８（ＷＯ，Ａ１） 特表昭５７−５０２２００（ＪＰ，Ａ） 3 1996140664 19960604 9 20010622 飯室 里美 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、種々の微生物の検出、同定、輸送に有用な簡易培地に関する。【０００２】【従来の技術】種々の微生物を検出、同定するにあたって、従来から行われている微生物の培養方法として、平板塗抹法や混釈法、液体培地法などが一般的に用いられている。これらの方法は、培養を行う以前に培地や器具類の滅菌の準備が必要であり、被検試料を培地に接種した後は塗抹や混釈等の熟練を要する操作が必要である。更に、被検試料接種後の培地の輸送や培養後発育したコロニーを計測したあとの培地等の滅菌ではかさばる器具や培地により多大な労力を要する。【０００３】そのため手軽に培養できるフィルム状培地を用いた簡易検査法が報告されている。その例としては、（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開昭５７−５０２２００号公報）、（２）防水性基体の上面部に、空気透過性膜、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開平３−１５３７９号公報）、（３）濾紙等に菌体栄養成分を含浸させ、その表面をカバーシートで覆ってなる検出紙（特開平２−６５７９８号公報）、（４）防水性平板の表面に冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基、繊維質吸水性シートを順次積層した培地（特開平６−１８１７４１号公報）が報告されている。【０００４】【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記（１）及び（２）の培地においては、試料接種後、試料を一定面積に拡散させるためにスプレッダーにより圧力をかける操作を必要とするという問題があった。また、上記（３）の培地においては、コロニーの形成が濾紙内部で行われるため、コロニーの観察が困難であることから、精度の低下や、釣菌不能などの問題があった。また、上記（４）の培地においては、繊維質吸水性シートを用いているため、釣菌の際の扱い難さが問題となっていた。【０００５】従って、本発明の目的は試料接種等の操作性に優れ、かつコロニーの観察が容易で正確な検出が可能であり、しかも釣菌も容易に行うことができる簡易培地及びこれを用いた微生物の検出方法を提供することにある。【０００６】【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上記操作性、コロニーの検出性及び釣菌の容易さ等の面から種々の培地について検討した結果、防水性の平板の表面に、キサンタンガム又はカラギーナンと、ローカストビンガム及び菌体培養用栄養分を特定の割合で含有する培地組成物を含む薄膜を形成することにより、試料液を培地上に滴下するのみで容易に拡散し、かつ形成された薄膜上で明確なコロニーが形成され、検出性が良好で、しかも容易に釣菌できる簡易培地が得られることを見出し、本発明を完成した。【０００７】すなわち、本発明は、防水性の平板の表面の少なくとも一部に、（ａ）キサンタンガム又はカラギーナン、（ｂ）ローカストビンガム、及び（ｃ）菌体培養用栄養分を含有し、かつ（ａ）及び（ｂ）の重量比が６：４〜０．５：９．５である培地組成物を含む薄膜を形成したことを特徴とする簡易培地を提供するものである。【０００８】また、本発明は、上記の簡易培地の薄膜形成面に検体液を接種して培養し、薄膜形成面に形成されたコロニーを検出することを特徴とする検体中の微生物の検出方法を提供するものである。【０００９】本発明で用いられる防水性の平板の材質としては、防水性であれば特に制限されず、例えばポリエチレン系、ポリプロピレン系、ポリスチレン系等のプラスチック、ガラスなどが挙げられ、特にポリスチレン系プラスチックが好ましい。また、平板の表面は、薄膜を形成し得る状態であれば特に制限されず、例えば薄膜が形成し易いように梨子地に仕上げたものであってもよい。【００１０】また、これらの平板の形状は、正方形、長方形、円形等特に限定されない。またその大きさも特に制限されないが、微生物の簡易検出用の場合には長径で１〜１５ｃｍが好ましい。【００１１】本発明の簡易培地は、このような平板の表面の少なくとも一部に、（ａ）キサンタンガム又はカラギーナン、（ｂ）ローカストビンガム、及び（ｃ）菌体培養用栄養分を含有する培地組成物を含む薄膜が形成されているものである。培地組成物において、（ａ）キサンタンガム又はカラギーナンと、（ｂ）ローカストビンガムは、（ａ）及び（ｂ）の重量比が６：４〜０．５：９．５、好ましくは４：６〜１：９であることが必要である。（ａ）成分の割合がこの範囲より大きいと、試料を接種したときの拡散性が悪くなり、また（ｂ）成分の割合がこの範囲より大きいと、培養時間が長くなると薄膜のゲルが軟化してしまう。この（ａ）成分及び（ｂ）成分は、培地組成物中に、合計で０．１〜３０重量％、特に５〜２０重量％配合するのが好ましい。【００１２】また、（ｃ）菌体培養用栄養分は、検出しようとする微生物の生育に適し、水可溶性のものが選択される。例えば、多種の微生物を増殖させる場合には、一般的な栄養培地成分が用いられ、特定の微生物を選択的に増殖させる場合には選択培地成分が用いられる。この（ｃ）成分は、通常培地組成物中に０．５〜２０重量％、特に１〜５重量％配合するのが好ましい。【００１３】更に、この培地組成物には、コロニーの観察を容易にするため、種々の発色剤を配合するのが好ましい。かかる発色剤には、コロニーを着色する色素、例えばトリフェニルテトラゾリウムクロライド、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド等の色素；５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド等の酵素基質；ブロムチモールブルーやニュートラルレッドのようなｐＨ指示薬等が含まれる。【００１４】薄膜は、例えば前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）成分を含むアルコール懸濁液を、平板の表面に塗布した後、乾燥することにより形成される。アルコール懸濁液中の培地組成物の濃度は、培地組成物が容易に均一に平板表面に塗布できる程度の粘度になる濃度であることが好ましく、１〜７０重量％、特に６〜３０重量％が好ましい。ここで、アルコールとしては炭素数１〜５のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。【００１５】このアルコール懸濁液の平板表面への塗布は、例えばバーコーター、ドクターブレード、ベーカーアプリケーターなどによる塗布や吹き付け（噴霧）による塗布が挙げられるが、ベーカーアプリケーターによるのが好ましい。次いで、乾燥は自然乾燥、減圧乾燥、熱風乾燥が好ましい。更に、ガス、γ線、電子線等により滅菌するのが好ましい。【００１６】得られた簡易培地における平板上の薄膜層は、０．０１〜２ｍｍ、特に０．１〜１ｍｍであるのが好ましい。【００１７】本発明簡易培地は、平板表面全体に１種の培地組成物を含む薄膜が均一に形成されていてもよく（例えば図１）、また菌体培養用栄養分と発色剤を変化させた複数種の培地組成物を含む薄膜を形成したものでもよい（例えば図２、図３）。【００１８】得られた本発明の簡易培地は、試験に供されるまでの間雑菌による汚染を防止する目的で、周囲を撥水性フィルムの袋、プラスチックシャーレ、ガラスシャーレ等で覆っておくのが好ましい。【００１９】本発明の簡易培地を使用して微生物を培養・検出するには、例えば薄膜形成面に検体液を接種して培養し、薄膜形成面に形成されたコロニーを検出することにより行うことができる。薄膜形成面に接種された検体液中の微生物は、膨潤するか又は粒子間の接着が遅いタイプの物質粒子の間隙を縫って拡散する。更に拡散より遅れて十分な膨潤又はゲル化がおこり、捕捉され自由移動が抑制され培養後コロニーを形成する。従って、薄膜形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。試料を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。なお、菌体液の接種は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用されるが、水分の多い個体へスタンプする方法や試料液へ浸す方法でもよい。また、検体液接種後の培養は、静置しておいてもよく、輸送期間中に培養を兼ねてもよい。【００２０】【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００２１】実施例１キサンタンガム又はカラギーナンとローカストビンガムの重量比をかえた簡易培地を製造し、これらに検体液を接種し、培養したときの拡散性、コロニー形成及びゲルの軟化について評価した。結果を表１及び表２に示す。【００２２】培地の製造方法：培地組成成分として、ペプトン１．７ｇ、ダイズペプトン０．３ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、ブドウ糖０．２５ｇ、リン酸一水素カリウム０．２５ｇ及びトリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００２ｇをエタノール１００ｍｌに懸濁し、これにキサンタンガム又はカラギーナンとローカストビンガムの重量比を１０：０〜０：１０（各々の合計１０ｇ）に組み合わせた培地を調製した。次に、その各々の培地組成液の１ｍｌずつを密閉型のプラスチックシャーレ（４７φｍｍ）に分注し、均一になるように広げて乾燥した後、エチレンオキサイドガスで滅菌し、簡易培地を作製した。【００２３】評価方法：Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓをトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）で３５℃にて２４時間培養した後、１０倍段階希釈を行い、それぞれの試料１ｍｌずつを簡易培地の薄膜形成面に接種した。簡易培地が試料の水分を吸収した後、倒置してふ卵器中で３５℃にて２４時間培養した。この一連の操作において下記する評価を行った。【００２４】（１）拡散性；試料１ｍｌを簡易培地の中心部に接種し、周辺部にまで試料の拡散がみられるかについて観察し、以下の基準で評価した。◎：拡散速度が速く、スムーズに培地のへりまで拡散した。○：培地の中心からへりまで拡散した。△○：試料の接種時には培地のへりまで拡散しないが、培養後にはコロニーがへりまで形成した。△：ゆっくりだが、培地のへりの近くまでしか拡散しない。×：培地のへりまで拡散しない。【００２５】（２）コロニー形成、ゲルの軟化；培養後、簡易培地に形成したコロニー、及び簡易培地のゲルが軟化して崩れていないかを観察し、以下の基準で評価した。○：ゲルは軟化せず、コロニーが形成している。△：ゲルはゆるくはなるが落ちることはなく、コロニーが落ちかける。×：ゲルが軟化し、コロニーの形成が不良。【００２６】【表１】【００２７】【表２】【００２８】表１及び表２の結果より、拡散性、コロニー形成、ゲルの軟化での評価においてキサンタンガム又はカラギーナンとローカストビンガムの重量比が６：４〜０．５〜９．５、特に４：６〜１：９で良好であることを認めた。【００２９】実施例２培地組成物成分としてペプトン１．７ｇ、ダイズペプトン０．３ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、ブドウ糖０．２５ｇ、リン酸−水素カリウム０．２５ｇ、ローカストビンガム８ｇ、キサンタンガム２ｇ及びトリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００２ｇを用い、これらをエタノール１００ｍｌに懸濁し、良く攪拌した。次に、このエタノール懸濁液を１ｍｌずつ密閉型のプラスチックシャーレ（４７φｍｍ）に分注し、均一になるように広げて乾燥した後、エチレンオキサイドガスで滅菌した。【００３０】表１に示す各種菌株を、トリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）で３５℃にて２４時間培養した後、１０倍段階希釈を行い、それぞれ１ｍｌずつを簡易培地の薄膜形成面に接種するか、又はトリプトソーヤ寒天培地（ＴＳＡ、日水製薬社製）に接種し、３５℃にて２４時間培養した後、菌数を測定した。その結果を表３に示す。【００３１】【表３】【００３２】表３の結果より、各種菌株について、本発明の簡易培地及びＴＳＡ平板を用いた場合のいずれも、ほぼ同数の菌数が認められた。また、簡易培地に形成したコロニーを白金線を用いて刺すことにより釣菌したところ、容易に釣菌することができ、更にこの菌をＴＳＡ平板に接種して３５℃、２４時間培養したところ、コロニーの形成が認められた。【００３３】実施例３市販食品として豚挽き肉及び豆腐を購入し、各食品１０ｇを９０ｍｌの滅菌生理食塩水を加えて均一になるようにストマッキングした試料を１０倍段階希釈した。その１ｍｌを実施例２の簡易培地の薄膜形成面に接種した。更に同様の試料の１ｍｌを滅菌シャーレにとり、あらかじめ滅菌し、４８℃程度に冷却してある標準寒天培地（日水製薬社製）を注ぎ、混釈した。次に、これらを３５℃で２４時間培養し、出現したコロニーを算出した。その結果、豚挽き肉では、簡易培地で３．３×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ、混釈平板培養で３．０×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ；豆腐では、簡易培地で９．１×１０４ ＣＦＵ／ｍｌ、混釈平板培養で９．３×１０４ ＣＦＵ／ｍｌであり、簡易培地及び標準寒天培地ともほぼ同様の菌数を示した。【００３４】【発明の効果】本発明の簡易培地を用いれば、検体液の接種が容易であり、検体液が均一に拡散し、更にコロニーの観察及び釣菌が正確かつ容易にできるため、種々の微生物の検査を簡易に行うことができる。【図面の簡単な説明】【図１】平板の表面全体に同一組成の培地組成物を含む薄膜が形成された本発明簡易培地を示す説明図である。【図２】平板の表面にそれぞれ異なる組成を有する培地組成物を含む薄膜が形成された本発明簡易培地を示す説明図である。【図３】長方形状の平板の表面にそれぞれ異なる組成を有する培地組成物を含む薄膜が形成された本発明簡易培地を示す説明図である。 防水性の平板の表面の少なくとも一部に、（ａ）キサンタンガム又はカラギーナン、（ｂ）ローカストビンガム、及び（ｃ）菌体培養用栄養分を含有し、かつ（ａ）及び（ｂ）の重量比が６：４〜０．５：９．５である培地組成物を含む薄膜を形成したことを特徴とする簡易培地。 培地組成物が、更に発色剤を含有するものである請求項１記載の簡易培地。 請求項１記載の簡易培地の薄膜形成面に検体液を接種して培養し、薄膜形成面に形成されたコロニーを検出することを特徴とする検体中の微生物の検出方法。