生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_慢性骨髄性白血病急性転化の検出方法 |
| 出願番号： | 1994275527 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C12Q1/48 |
特許情報キャッシュ
吉村 雅史 西河 淳 松沢 佑次 谷口 直之 JP 3601858 特許公報(B2) 20041001 1994275527 19941017 慢性骨髄性白血病急性転化の検出方法 タカラバイオ株式会社 302019245 井上 昭 100087022 中本 宏 100078503 吉村 雅史 西河 淳 松沢 佑次 谷口 直之 20041215 7 C12Q1/48 JP C12Q1/48 Z 7 C12Q 1/00-70 G01N 33/00-98 PubMed、MEDLINE(STN) BIOSIS/WPI(DIALOG) 1 1996112098 19960507 6 20010419 特許法第３０条第１項適用 １９９４年４月、社団法人日本血液学会発行の「日本血液学会抄録集第５９巻補冊１号」に発表 特許法第３０条第１項適用 １９９４年９月 日本癌学会発酵の「第５３回日本癌学会総会記事 第５７１頁」に発表 斎藤 真由美 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は白血病、特に慢性骨髄性白血病の急性転化の検出方法に関する。【０００２】【従来の技術】白血病とは、造血組織の腫瘍性疾患で、悪性化した造血組織由来の細胞（白血病細胞）が単クローン性に自律性増殖する。血流中に白血病細胞が出現し、肝、脾、リンパ節、腎、肺、脳等の主要臓器に白血病細胞の浸潤を来し、最終的には、出血、感染などの合併症も併発し、死に至る。白血病は、未分化な細胞が増殖する急性白血病と、分化能をもつ、あるいは分化した細胞が中心に増殖する慢性白血病とに分類される。またそれぞれは、細胞形態学的、免疫学的に骨髄性白血病、リンパ性白血病、単球性白血病等に細分類される。従来白血病の診断は末梢血や骨髄中の白血病細胞の形態観察、細胞化学染色や遊走能、貪食能等の機能検査の成績などを総合して行われる。近年ではモノクローナル抗体を用いた免疫学的形質を検索することによって病型分類のみならず、細胞の起源や分化段階まで推定できるようになっている。また、各病型に特徴的な染色体異常が観察されており、白血病の総合的診断に染色体分析は重要な位置を占めている。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は臨床経過より、慢性期、移行期、急性転化の三つに分類される。多くの場合発症から３〜４年続く慢性期の後、移行期を経るかあるいはそのまま急性転化と呼ばれる急性白血病様の病態に至る。ＣＭＬの診断に関しては、その９５％以上の症例でフィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ） 染色体（Ｐｈ１ 染色体）と呼ばれる第９番染色体と第２２番染色体の相互転座〔ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）〕の存在が認められており、Ｐｈ１ 染色体陽性所見はＣＭＬの診断に有用である。更に、近年ではこの相互転座の結果生じる第９番染色体のａｂｌ遺伝子と第２２番染色体のｂｃｒ（ｂｒｅａｋ ｐｏｉｎｔ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎ） 遺伝子のハイブリッド遺伝子（ｂｃｒ−ａｂｌハイブリッド遺伝子）をサザンブロット解析やＰＣＲ法等の分子生物学的手法を用いて検出する、いわゆる遺伝子診断も行われている。近年、骨髄移植がＣＭＬに対する有効な治療法として注目されているが、その実施時期は慢性期のできるだけ早期であるほど治療効果が高く、急性転化すると骨髄移植の成功率は極めて低い。したがって、ＣＭＬ急性転化の有無を判定する必要がある。また、初診時既にＣＭＬ急性転化した患者の場合には急性白血病との鑑別が問題となる。急性白血病患者には初回からの化学療法が効果的であり、寛解率は８０％を越えるが、ＣＭＬ急性転化の患者に対しては化学療法はあまり効果的とはいえず、ＣＭＬにおいては慢性期の間にドナーが得られれば、直ちに骨髄移植を実施しなければならない。【０００３】【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＣＭＬの進行度、すなわち慢性期、移行期、急性転化期の判定は確固たる基準に沿って行われていないのが現状であり、時には治療方針に混乱を来す場合もある。従来急性転化したＣＭＬの判定は発熱、急激な脾腫、リンパ球内の幼若化細胞の比率増加等の臨床所見に基づいて行われている。更に、ＣＭＬに特徴的なＰｈ１ 染色体の検出は長時間を要するため、迅速かつ簡便な判定方法が望まれていた。また、前述したようにＣＭＬ急性転化と急性白血病の鑑別を必要とする場合があるが、Ｐｈ１ 染色体はＣＭＬのみならず急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の２５〜３０％、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の２〜３％にも認められるため、Ｐｈ１ 染色体陽性所見からＣＭＬ急性転化と急性白血病の鑑別を行うことは困難である。それ故、ＣＭＬ急性転化を急性白血病と明確に識別し、診断する簡便かつ迅速な検査法の開発が望まれていた。本発明は上記の問題点を解決するためのものであり、その目的はＣＭＬ急性転化の有無をでき得る限り早期に、簡便迅速かつ定量的に判定する方法を提供することにある。【０００４】本発明は、白血球のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−IIIの活性値を対象値と比較測定するＣＭＬの急性転化の検出方法であって、下記工程；（１）ヒトの白血球から細胞破砕液を調製する工程と（２）該細胞破砕液を酵素溶液としてＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−IIIの活性を測定する工程、とからなり、前記活性がＣＭＬ慢性期の白血球細胞のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−III活性と比較して高値である場合にＣＭＬの急性転化と判定することを特徴とするＣＭＬの急性転化の検出方法に関する。【０００５】Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩＩ （以下、ＧｎＴ−ＩＩＩ と略記する）は、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖のトリマンノシルコア部分に存在するβ−マンノースにＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をβ−１，４−結合で転移し、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを合成する。本発明者らは種々の白血病細胞におけるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を測定したところ、ＣＭＬ急性転化症例のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性が、ＣＭＬ慢性期を含む他の白血病細胞や正常人の白血球細胞のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性と比較して有意に高値を示すことを発見し、本発明を完成するに至った。【０００６】すなわち、本発明はＧｎＴ−ＩＩＩ の活性上昇を検出することを特徴とするＣＭＬの急性転化の検出方法を提供するものである。【０００７】本発明におけるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性上昇の検出は、例えば（１）ヒトの白血球から細胞破砕液を調製する工程と、（２）該細胞破砕液を酵素溶液としてＧｎＴ−ＩＩＩ の活性を測定する工程、とからなることが好ましい。【０００８】ヒトの白血球（例えば末梢血の単核球）から細胞破砕液を調製する方法は特に限定されるものではないが、例えば細胞を超音波処理することによって細胞破砕液を得ることができる。また、細胞破砕液中のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を測定する方法も特に限定されるものではなく、例えば糖供与体としてウリジンジホスホＮ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を用い、受容体として適当な糖鎖あるいは糖ペプチドあるいは糖タンパク質を用いて、適当な緩衝液中でこれらと白血球破砕液を反応させた後転移生成物を定量することによって細胞破砕液中のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を測定することができる。好ましくは、例えば本発明者らによって開発されたＧｎＴ−ＩＩＩ 活性測定方法〔アナリチカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１７０巻、第３４９〜３５４頁（１９８８）、あるいはメソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１７９巻、第３９７〜４０８頁（１９８９）〕によって簡便かつ迅速に白血球破砕液のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を測定することができる。【０００９】この方法を用いて白血病細胞のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を測定したところ、各症例におけるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ タンパク質）は、ＣＭＬ急性転化では１６例中１３例でＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は１．０以上、うち３例では６．０以上と異常高値を示した。ＣＭＬ慢性期、ＡＭＬ、ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）ではＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は低く、ＡＭＬ１例、ＡＬＬ１例、ＣＬＬ１例を除き全例０．５以下であった。正常コントロールの単核球のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は０．２５以下であった。【００１０】以上に述べたように、ＣＭＬ慢性期、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、正常コントロールの白血球のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性値をそれぞれ対照値とした場合、ＣＭＬ急性転化の白血球のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性値は有意の高値を示すことから、これらの対照値と比較することによりＣＭＬ急性転化を検出することができる。また、ＣＭＬ慢性期患者より連続的に検体を調製してそのＧｎＴ−ＩＩＩ 活性値を測定し、ＣＭＬ慢性期のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性値を対照値として各検体のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性値を比較することによって、ＣＭＬ急性転化をモニタリングすることができる。【００１１】【実施例】以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらになんら限定されるものではない。【００１２】実施例１表１に示す白血病患者、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者、正常コントロールの末梢血（ＰＢ）より単核球を調製し、検体とした。【００１３】【表１】表 １──────────────────────────ＣＭＬ急性転化 １６例ＣＭＬ慢性期 ８例ＡＭＬ １０例ＡＬＬ ８例ＣＬＬ １１例ＭＭ １４例正常コントロール（ＰＢ） ７例──────────────────────────【００１４】（ＧｎＴ−ＩＩＩ 活性測定法）細胞を超音波破砕して調製した細胞破砕液を酵素溶液とし、アナリチカル バイオケミストリー、第１７０巻、第３４９〜３５４頁（１９８８）、あるいはメソッズ イン エンザイモロジー、第１７９巻、第３９７〜４０８頁（１９８９）に記載の方法に従って、２−アミノピリジンで蛍光標識した下記式（化１）で示す糖鎖基質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと反応させた後、反応生成物をＨＰＬＣで分析定量した。なお下記式（化１）で示す糖鎖基質は宝酒造社製品として入手可能である。以下、方法を詳細に説明する。【００１５】【化１】【００１６】末梢血をフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ、ファルマシア社製）に重層して１４００ｒｐｍ、室温で２０〜３０分遠心してバンドになる単核球画分を分取する。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ（−）に懸濁して４℃で超音波処理し、細胞破砕液を調製し、検体とした。アッセイ用混合液〔２５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．２５、４０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２ 、４００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、１．０％（ｗ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ） Ｘ−１００〕２５μｌと３．８５ｍＭ 糖鎖基質溶液１０μｌの混合液に検体１５μｌを加えて３７℃で２時間反応を行う。反応液を逆層カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ 、４．６×１５０ｍｍ、東ソー株式会社製）を用いたＨＰＬＣで分析を行った。溶出は０．３％１−ブタノールを含む０．０２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ４．０、流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで行った。検出は蛍光検出器を用いて行い、励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍである。【００１７】（結果）各症例におけるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ タンパク質）を図１に示した。すなわち、図１は各症例におけるＧｎＴ−ＩＩＩ 活性（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ タンパク質）を示す図であり、縦軸はＧｎＴ−ＩＩＩ 活性（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ タンパク質）、横軸は各症例を示す。ＣＭＬ急性転化では１６例中１３例でＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は１．０以上、うち３例では６．０以上と異常高値を示した。ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、ＰＢではＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は低く、ＡＭＬ１例、ＡＬＬ１例、ＣＬＬ１例を除き全例０．５以下であった。また、ＣＭＬ慢性期８例もＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は低く、すべて０．５以下であった。以上に述べたように、ＣＭＬ急性転化でＧｎＴ−ＩＩＩ 活性の有意の上昇が認められた。なお、白血病以外の血液の腫瘍であるＭＭのＧｎＴ−ＩＩＩ 活性（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ タンパク質）は０．１９〜３．４７であった。【００１８】【発明の効果】ＣＭＬ急性転化症例のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性は、ＣＭＬ慢性期を含む他の白血病細胞や正常人の白血球細胞のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性と比較して有意に高値を示す。したがって、白血病細胞のＧｎＴ−ＩＩＩ 活性を測定することによりＣＭＬ急性転化の有無を簡便かつ迅速に判定することが可能となった。【図面の簡単な説明】【図１】各症例におけるＧｎＴ−ＩＩＩ （ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ タンパク質）を示す図である。 白血球のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−IIIの活性値を対象値と比較測定する慢性骨髄性白血病の急性転化の検出方法であって、下記工程；（１）ヒトの白血球から細胞破砕液を調製する工程と（２）該細胞破砕液を酵素溶液としてＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−IIIの活性を測定する工程、とからなり、前記活性が慢性骨髄性白血病慢性期の白血球細胞のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−III活性と比較して高値である場合に慢性骨髄性白血病の急性転化と判定することを特徴とする慢性骨髄性白血病の急性転化の検出方法。