生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_溶液中のペルオキシダーゼの安定化方法 |
| 出願番号： | 1994089702 |
| 年次： | 2005 |
| IPC分類： | 7,C12N9/96,C12Q1/28 |
特許情報キャッシュ
▲高▼橋 正浩 矢野 朗 JP 3685815 特許公報(B2) 20050610 1994089702 19940427 溶液中のペルオキシダーゼの安定化方法 明治乳業株式会社 000006138 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 的場 ひろみ 100101317 ▲高▼橋 正浩 矢野 朗 20050824 7 C12N9/96 C12Q1/28 JP C12N9/96 C12Q1/28 7 C12N 9/00-99 C12Q 1/28 EUROPAT(QUESTEL) JSTPlus(JOIS) MEDLINE(STN) BIOSIS/WPI(DIALOG) 特開平０５−１３０８６６（ＪＰ，Ａ） 特開平０５−０９９９２７（ＪＰ，Ａ） 2 1995289258 19951107 5 20010425 左海 匡子 【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物を含有する溶液の安定化方法及び安定化された分析試薬溶液に関する。【０００２】【従来の技術】ペルオキシダーゼ（以下「ＰＯＤ」という）は、発色測定に於ける活性が高いことから生化学的測定法、特に免疫学的測定法のラベル酵素として繁用されている。しかしながら、ＰＯＤは遊離の状態でも、他の成分に修飾されている場合でも、実際に測定時に使用される低濃度領域では、安定性が悪く、測定に必要な活性を溶液状態で長い期間維持することは非常に困難であった。従って、一般的にＰＯＤの保存は、凍結乾燥品とするか溶液状態では高濃度溶液として給されている。これらの形態のＰＯＤは、用事に水による復元や希釈などの煩雑な操作が必要であるばかりでなく、時に操作時のミスを生じさせ、測定の信頼性を減じる要因ともなっていた。【０００３】それ故、使用時の濃度に予め調整された、溶液状態の安定なＰＯＤ試薬の供給が強く望まれている。そのためのアプローチとして、ＰＯＤ標識物に様々な安定化剤を添加して安定性を向上させた例が先行技術として提示されている。例えば、特公昭５８−５６６８号公報には８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸が、特開昭５８−２３７８６号公報には４−アミノアンチピリンが、特開昭５９−２５６８３号公報及び特開昭５９−２１０８８５号公報にはポリアルキレングリコールが、特開昭６０−１９２２６０号公報、特開昭６１−７８３８５号公報及び特開昭６１−２１２２８６号公報にはフェノール又はこの誘導体が、特表昭６２−５０２１０号公報には３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）がＰＯＤ標識物の活性を安定化する物質として報告されている。【０００４】しかしながら、ＰＯＤ等の安定化剤は、ＰＯＤを安定化させることはもとより、溶液中に存在する他の成分に対してなんらの影響も及ぼさず、かつ安全性に優れることが要求され、従来の安定化物質は、これらの点で必ずしも満足行くものではなかった。【０００５】【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、ＰＯＤ又はＰＯＤ標識物が、実際の使用時に用いられる低濃度の溶液でも、長期間安定に保存でき、かつこれを用いた測定になんら影響を及ぼさない安定化方法を提供することにある。【０００６】【課題を解決するための手段】 斯かる実状に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行った結果、ＰＯＤ又はこの標識物を含む溶液に尿酸又は溶液中で尿酸イオンとなり得るその塩を添加することにより、この溶液の十分な安定化を図ることができ、かつこの添加物が測定系になんら影響を及ぼさないことを見出し本発明を完成した。【０００７】 すなわち、本発明は、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物を含有する溶液に尿酸又は溶液中で尿酸イオンとなり得るその塩を添加することを特徴とする溶液中のペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物の安定化方法、並びに（Ａ）ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物と、（Ｂ）尿酸又は溶液中で尿酸イオンとなり得るその塩を含有する分析試薬溶液を提供するものである。【０００８】本発明が適用し得るＰＯＤは特に限定されず、全てのＰＯＤ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ｒｉｃｅｈｕｌｌペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ等が挙げられるが、入手のしやすさ、品質の安定性の観点からＨＲＰが好ましい。【０００９】また、ＰＯＤ標識物中のＰＯＤ結合成分として用いられる物質としては抗体又は抗体フラグメント、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビオチン、アビジン、他のリガンド・レセプターなどが挙げられるが、ＰＯＤで標識した有効成分を用いた測定で通常用いられる物質ならいかなるものでも用いることができる。本発明の分析試薬溶液中のＰＯＤ又はＰＯＤ標識物の濃度は、通常免疫測定などに用いられる濃度であれば特に限定されないが０．０１〜５μg ／mlとすることが好ましい。【００１０】 本発明に用いられる尿酸そのものの他、ナトリウム塩又はカリウム塩等の溶液中で尿酸イオンとなるもの（以下、あわせて尿酸化合物と記載することがある）であれば用いることができる。【００１２】 尿酸化合物のＰＯＤ若しくはＰＯＤ標識物の溶液への添加量は尿素としての濃度が該溶液に対して０．１〜５００μg ／ml、特に２〜２００μg ／mlとなる量が好ましい。本発明の分析試薬溶液の溶媒は基本的に水であるが、種々の緩衝液が好ましい。【００１３】また、上記成分に加え、溶液の防腐を達成するための保存剤が必要な場合は、ＰＯＤの活性に影響を与えないものを添加すれば良く、例えば、これにはチモール、ＭＩＣＲＯＣＩＤＥ Ｉ（ＡＭＲＥＳＣＯ社）等を挙げることができる。【００１４】 尿酸化合物の溶液への溶解方法は任意の方法を用いることができるが通常粉末状態で溶液に加えて溶解すればよく、有機溶媒や界面活性剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を用いることなく容易に溶解することができる。このことは、溶解補助剤による溶液成分への影響を考慮しなくてよいため、本発明の有利な点の一つである。【００１５】【発明の効果】 本発明のＰＯＤ又はＰＯＤ標識物含有溶液は安定であり、しかも尿酸化合物は該溶液に各種血清若しくは血清成分が含まれていてもそれらの成分に対して影響を与えない。従って溶液中に含まれる血清若しくは血清成分の動物種や成分種は問わず用いることができる。例えば、ウシ血清、ウシ胎児血清、ヤギ血清、ウサギ血清、それらのアルブミン分画、グロブリン分画などが存在しても影響を受けない。【００１６】【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが本発明はこれらに限定されるものではない。【００１７】実施例１尿酸添加による標識抗体の安定化試験：ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（γ−ｃｈａｉｎｓ Ｐ４０６）（Ｄａｋｏ社製）を標識抗体希釈液〔５０mMトリス塩酸緩衝液，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．５％ウサギ血清（ＮＲＳ），０．０１％ ＭＩＣＲＯＣＩＤＥ Ｉ pH８．０を無菌濾過後使用〕にて３０００倍に希釈し、希釈標識抗体液とした。得られた希釈標識抗体液に尿酸（ＳＩＧＭＡ）を２５０、１００、５０、２５、１０、５、３μg ／mlの各濃度で添加した。対照として尿酸無添加の希釈標識抗体液を作成した。それぞれの希釈標識抗体液３mlを１０ml容の褐色スクリューガラスチューブ（マルエムＮｏ．３；２１×４５）に充填し、３７℃恒温庫に保存し、７日間及び１４日間保存後に希釈標識抗体液の活性を測定した。陽性対照としては、測定当日に上記と同様にして尿酸無添加の希釈標識抗体液を調製（以下用事調製と略す）して活性を測定し、その値を１００％活性とした。結果を図１に示す。【００１８】ＰＯＤ標識抗体の活性は、ＨＢｓ抗原を固定化した９６穴マイクロプレート（ヌンク社）を用いた酵素免疫試験にて調べた。抗ＨＢｓヒト免疫グロブリン（日本製薬）を検体希釈液（標識抗体希釈液と同じ）で１０００倍に希釈した後、ＨＢｓ抗原固定化マイクロプレートに５０μl 分注し、３７℃にて１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０洗浄液（pH７．３）にて５回洗浄した。次いで、先の希釈標識抗体液を５０μl 分注し、３７℃、３０分間反応させ５回洗浄の後、テトラメチルベンジジン発色基質１００μl を分注して室温で３０分間反応させ、１Ｎ硫酸１００μl を分注し、反応を停止させた。４５０nmの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、それぞれの標識抗体の活性を比較した。またこのとき抗体活性の低下がないことを別途確認した。【００１９】このとき、各濃度の尿酸を添加した希釈標識抗体液が、尿酸の存在により標識抗体の発色に影響を受けていないかどうかを調べるために、各尿酸濃度の希釈標識抗体液を用事調製し、先の実施例と同様の試験を行って活性の変動の有無について調べた。尿酸無添加の希釈標識抗体液の活性を１００％としたときのデータを図２に示す。【図面の簡単な説明】【図１】尿酸を添加した場合の安定化効果を示す図である。【図２】尿酸が標識抗体の発色に及ぼす影響を示す図である。 ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物を含有する溶液に尿酸又は溶液中で尿酸イオンとなり得るその塩を添加することを特徴とする溶液中のペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物の安定化方法。 （Ａ）ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識物と、（Ｂ）尿酸又は溶液中で尿酸イオンとなり得るその塩を含有する分析試薬溶液。