生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現 |
| 出願番号： | 1992055518 |
| 年次： | 2004 |
| IPC分類： | 7,C12N15/09,C12P21/02 |
特許情報キャッシュ
ウィリアム・ダドリー・プリヴァット コティカニアド・スリークリシュナ JP 3579430 特許公報(B2) 20040723 1992055518 19920313 ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現 リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド 594063315 社本 一夫 100089705 今井 庄亮 100071124 増井 忠弐 100076691 栗田 忠彦 100075236 小林 泰 100075270 富田 博行 100096013 ウィリアム・ダドリー・プリヴァット コティカニアド・スリークリシュナ US 691079 19910426 20041020 7 C12N15/09 C12P21/02 C12P21/02 C12R1:84 JP C12N15/00 A C12P21/02 C C12P21/02 C12R1:84 7 C12N 15/14 C12N 15/79 - 15/81 C12P 21/02 C12N 1/19 BIOSIS(DIALOG) JSTplus WPI(DIALOG) 特開平０４−２９３４９５（ＪＰ，Ａ） 13 1993115294 19930514 36 19980827 上條 肇 【０００１】発明の分野本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関するものである。１観点においては本発明はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における分泌ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）発現の改良法に関するものである。【０００２】背景ヒト血清アルブミンは成人の最も豊富な血漿蛋白質である。アルブミンの濃度は４０ｍｇ／ｍｌ、すなわち７０Ｋｇの成人男子につき人体を循環するアルブミンは１６０ｇである。この蛋白質は浸透圧を維持し、銅、ニッケル、カルシウム（弱く、結合部位２−３個）、ビリルビンおよびプロトポルフィリン、長鎖脂肪酸、プロスタグランジン、ステロイドホルモン（これらのホルモンと弱く結合して、膜を通るそれらの伝達を促進する）、チロキシン、トリヨードチロニン、クリスチンおよびグルタチオンの結合および輸送において機能する。ピーターおよびリード（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｒｅｅｄ，Ｒ．Ｇ．），Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，（ピーターおよびショルム（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｓｊｏｈｏｌｍ，Ｊ．）編）１９７７，ｐ．１１−２０によれば、米国内だけで年間１０，０００ｋｇ以上の精製アルブミンが循環不全またはアルブミン欠乏を伴う患者に投与されている。【０００３】現在唯一の商業的ＨＳＡ源は分画血液からのものである。血液由来の汚染物質および病原体の危険性がありうることを考慮すると、ＨＳＡ調製のための別法を開発することは商業的ＨＳＡ製造に著しく寄与すると思われる。組換えＤＮＡ法の出現により現在ではＨＳＡを別法により製造することができる。【０００４】ＨＳＡはエッチェベリー（Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ）ら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８６年８月，ｐ．７２６およびアージャム・シン（Ａｒｊｕｍ Ｓｉｎｇｈ）の欧州特許出願公開第１２３，５４４号明細書に示されるように、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においても発現される。エッチェベリーは濃度約６ｍｇ／ｌの細胞内ＨＳＡ発現、および細胞会合状態にあるＨＳＡの分泌につき示している。アージャム・シンもビール酵母菌においてα−因子およびシグナル配列と合わせたＨＳＡ発現につき示している。シンは細胞内産生水準約２５ｍｇ／ｌおよび分泌産生水準３ｍｇ／ｌを達成し得たと思われる。欧州特許出願公開第３４４，４５９号明細書に示されるように、ピチア・パストリスもＨＳＡの発現に用いられている。ピチア・パストリスにおいて産生されたＨＳＡの濃度は、ＨＳＡ約８９ｎｇ／蛋白質ｍｇであると思われる。組換え発現系においてＨＳＡを製造するための方法はこれらの実験により確立されたが、可能な最大ＨＳＡ製造を達成するためにはこれらの方法を最適なものにすることが望ましいと思われる。【０００５】従ってピチア・パストリスなどの微生物におけるＨＳＡの組換え発現によるＨＳＡの収率を高める方法を提供することは、当技術分野に著しく寄与すると思われる。【０００６】従って本発明の目的は、組換え発現系において産生されるＨＳＡの収率を高める方法を提供することである。【０００７】発明の要約従って本発明者らは、ピチア・パストリス細胞においてＨＳＡの分泌発現を改良するための下記よりなる方法を見出した：（ａ）ＨＳＡを発現しうる形質転換したピチア・パストリス細胞を、発酵ブロス中において、該ピチア・パストリス細胞の生存を維持するのに適した条件下で、該ピチア・パストリス細胞によるＨＳＡの発現に適した条件下に培養し、そして（ｂ）ＨＳＡの発現と同時期に、該発酵ブロスのｐＨを約５．７−約６．４のｐＨに保持する。【０００８】詳細な説明一般にピチア・パストリスはｐＨ約４．８−約５．２において最適状態で増殖する。このｐＨ範囲で適切な栄養培地を供給されたピチア・パストリスは旺盛な増殖を示す。このｐＨ範囲は数種類の異種蛋白質、たとえば肝炎Ｂ表面抗原をも高度に発現すると思われる。このｐＨ範囲はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についても高度に発現すると思われた。たとえば５′側調節領域（すなわちプロモーター）および３′側ターミネーション配列にオペラブル結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ＨＳＡ構造遺伝子を含むベクターにより形質転換された増殖中のピチア・パストリス細胞については、得られたＨＳＡ発現水準は発酵ブロス中のＨＳＡ約．７１−．８１ｇ／ｌであった。しかし本発明者らは、発酵ブロスのｐＨを約５．２から約５．７−約６．４、好ましいｐＨ範囲約５．７−約６．０、極めて好ましいｐＨ範囲約５．７５−約５．８５に移行させるという前例のない工程を採用することにより、この収率をさらに少なくとも５０％増大させることができた。このｐＨ範囲の上限（すなわちｐＨ６．０−６．４）において得られる増加した分泌水準が振盪試験管内での最適化試験において確認され、これは酵母エキスおよびペプトンの存在が通気と共に振盪試験管中で最適ＨＳＡ分泌をもたらすことを示す。しかしｐＨを連続的に監視しうる大規模発酵においては酵母エキス、ペプトンおよび過度の通気は不必要であると考えられる。この比較的高いｐＨ水準は、プロモーター、ならびにシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードする構造遺伝子を含む発現カセットにより形質転換されたいずれのピチア・パストリス株の収率をも増大させると思われる。さらにこの結果は、シグナル配列および成熟異種蛋白質をコードする種々の異種構造遺伝子に適用しうると思われる。この方法で比較的高い水準において発現しうる適切な異種蛋白質には、組織プラスミノーゲン活性化物質、アルブミン（たとえばヒト血清アルブミン）、リソチーム（たとえばウシリソチーム）、インターフェロン（たとえばガンマ−インターフェロンおよびベータ−インターフェロン）およびインベルターゼよりなる群から選ばれる異種蛋白質が含まれるが、これらに限定されない。本発明に用いられる異種構造遺伝子はそれぞれ、成熟蛋白質を分泌するためには成熟異種蛋白質をコードする配列の５′末端にオペラブル結合したシグナル配列を含まなければならない。たとえば組織プラスミノーゲン活性化物質、ヒト血清アルブミン、ウシリソチーム、ベータ−インターフェロンおよびガンマ−インターフェロンおよびインベルターゼ蛋白質はすべて、天然のシグナル配列を用いて分泌しうる。さらにこれらの蛋白質は、ピチア・パストリスからの分泌シグナル配列、たとえば米国特許出願第０７／６２７，５３９号明細書（１９９０年１２月１４日出願、リチャード・バックホルツによる、フィリップス・ペトロリウム・カンパニーに譲渡）（ここに参考として引用する）に示されるアシドホスファターゼシグナル配列、またはビール酵母からのアルファ−交配因子シグナル配列を用いて分泌させることもできる。【０００９】本発明によれば、発酵ブロスのリットル当たり真正ＨＳＡ約１−３ｇのＨＳＡ分泌水準が得られた。従って本発明は高水準のＨＳＡ分泌手段を提供する。１−３ｇ／ｌの水準では高純度のＨＳＡを高収率で採取することができるので、このＨＳＡ産生水準が達成されたことは先行技術による産生水準より著しい前進である。【００１０】ＨＳＡ構造遺伝子を発現するためには遺伝子は５′側調節領域および３′側ターミネーション配列にオペラブル結合していなければならず、これが宿主（通常は微生物）内へベクター（たとえばプラスミドまたは線状の部位特異性インテグラティブベクター）により挿入される発現カセットを形成する。ここで用いるオペラブル結合とは、５′側調節領域、構造遺伝子、および３′側ターミネーション配列がそれらの正常な機能を果たしうる状態で結合および構成された並置状態を意味する。ここで用いる５′側調節領域またはプロモーターとは、種々の刺激に反応して、高い割合のｍＲＮＡ転写をもたらすＤＮＡ配列を意味する。３′側ターミネーション配列は構造遺伝子の終止コドンに対して３′側の配列であり、これはこの配列がオペラブル結合している遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化する機能をもつ（たとえばポリアデニル化の引き金となる配列）。本発明を実施するためには、構造遺伝子のＡＴＧが可能な限り少ない介在デオキシリボヌクレオチドにより、好ましくは約１１以下のデオキシリボヌクレオチド、極めて好ましくは約８以下のデオキシリボヌクレオチドにより、５′側調節領域の３′末端に結合することが好ましい。介在デオキシリボヌクレオチドのアデニンおよびチミン含量が約５５−約６４％であることも好ましい。さらに、ある特定の位置についてはヌクレオチド優位性があると思われる。構造遺伝子のＡＴＧコドンから左へ数えて左側の最初の位置を−１位とすると、アデニンまたはシトシンが極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドであり、−２位において極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドはアデニンまたはチミンであり、−３位において極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドはアデニンまたはチミンであり、−４位において極めて好ましいヌクレオチドはアデニン、チミンまたはシトシンである。現在では図３および４の制限地図をもつＡＯＸ１もしくはＤＡＳ１ ５′側調節領域、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ；１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ；２がそれらの配列の３′末端においてＨＳＡ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドンに結合していることが好ましい。ＡＯＸ１ ５′側調節領域の適切な結合の１例を下記に示す：【表１】数種類の５′側調節領域が解明され、これらをピチア・パストリスにおいてＨＳＡの発現に関連して用いることができる。５′側調節領域の例は、ピチア・パストリス由来の第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）、アシドホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ１）、およびｐ４０調節領域などである。ＡＯＸ１ ５′側調節領域、ＤＡＳ１ ５′側調節領域、およびｐ４０ ５′側調節領域は米国特許第４，８５５，２３１号明細書に記載されており、ここに参考として引用する。ＧＡＰ ５′側調節領域は欧州特許出願公開第３７４，９１３号明細書（１９９０年６月２７日公開）に示されており、ここに参考として引用する。ＰＨＯ１ ５′側調節領域は米国特許出願第０７／６７２，５３９号明細書（１９９０年１２月１４日出願、フィリップス・ペトロリウム・カンパニーに譲渡）に示されている。本発明の実施に際して用いられる現在好ましい５′側調節領域は、それらがメタノール含有培地に反応しうることを特色とするもの、たとえばＡＯＸ１およびＤＡＳ１よりなる群から選ばれる調節領域である。本発明の実施に際して用いられる極めて好ましい５′側調節領域はＡＯＸ１ ５′側調節領域である。【００１１】前記の発現カセット中に３′側ターミネーション配列を使用すべきである。３′側ターミネーション配列は遺伝子にオペラブル結合している場合、構造遺伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡを終結させ、ポリアデニル化し、および／または安定化する機能をもつが、特定の３′側ターミネーション配列が本発明の実施に際して重要であるとは思われない。本発明の実施に際して用いられる３′側ターミネーション配列の具体的供給源の数例にはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピチア・パストリスの３′側ターミネーション配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましいものはピチア・パストリス由来のもの、たとえばＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＨＯ１遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子の３′側ターミネーション配列よりなる群から選ばれるものである。特に好ましいものはＡＯＸ１遺伝子の３′側ターミネーション配列である。【００１２】ピチア・パストリスは種々のＨＳＡ構造遺伝子により形質転換することができる（ここで述べる本発明による形質転換体において、ＨＳＡ構造遺伝子はシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質の双方をコードする）。ＨＳＡ構造遺伝子はローン（Ｌａｗｎ）ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：６１０５（１９８１）およびドゥガイチク（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：７１（１９８２）により配列決定された。これらの遺伝子はローンらおよびドゥガイチクらの方法による遺伝子の再単離によっても得られ、またはインビトロで一般の遺伝子製造業者、たとえばブリティッシュ・バイオテクノロジー社により合成される。ＨＳＡ遺伝子を得るための可能な１方法は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングするか、またはヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを抗−ＨＳＡ抗血清によりスクリーニングして、ＨＳＡを発現するｃＤＮＡを同定することである。適切なＨＳＡ構造遺伝子の一例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に提示される。ＨＳＡに対する構造遺伝子が採取されると、その遺伝子をさらに調整する必要がある。ＨＳＡ構造遺伝子を単離したのち、その遺伝子を適切なピチア・パストリスベクター、たとえばプラスミドまたは線状の部位特異性インテグラティブベクターに挿入する。【００１３】プラスミド型ベクターは長年、組換えＤＮＡ法に用いられる基本的要素の１つであった。プラスミドは微生物に見られる環状の染色体外２本鎖ＤＮＡである。プラスミドは細胞当たり単一または多重コピーで生じることが認められている。プラスミドＤＮＡに含まれるものはプラスミド再生に必要な情報、すなわち自動複製配列、たとえばジェームス・Ｍ．クレグにより米国特許４，８３７，１４８第号明細書（１９８９年６月６日発行）に示されたものであり、これをここに参考として引用する。さらに、形質転換した細胞においてプラスミドの遺伝表現型を選択するための１または２以上の手段もプラスミドにおいてコードされる情報に含まれる。【００１４】本発明の実施に際して用いられる適切なインテグラティブベクターは、ジェームス・Ｍ．クレグにより米国特許４，８８２，２７９第号明細書（１９８９年１１月２１日発行）に示された線状の部位特異性インテグラティブベクターであり、これをここに参考として引用する。これらのベクターは少なくとも１）第１挿入性ＤＮＡフラグメント；２）選択性マーカー遺伝子；および３）第２挿入性ＤＮＡフラグメントの順次整列した配列からなる。異種構造遺伝子を含む発現カセットが、このベクターの第１挿入性ＤＮＡフラグメントと第２挿入性ＤＮＡフラグメントの間に、マーカー遺伝子の前または後において挿入される。あるいは構造遺伝子がオペラブル結合しうる挿入性フラグメントの１つに調節領域すなわちプロモーターが含まれる場合、発現カセットをインサイチューで形成することができる。【００１５】第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはそれぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの長さであり、形質転換される種のゲノムＤＮＡの部分と相同なヌクレオチド配列をもつ。インテグラティブベクターの種々の成分は、発現カセットおよび選択性マーカー遺伝子が第１挿入性ＤＮＡフラグメントの３′末端と第２挿入性ＤＮＡフラグメントの５′末端の間に配置された状態で、順次整列して線状のＤＮＡフラグメントを形成する。第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントは順次整列した線状フラグメント中において、それらが母体ゲノム中で配向しているものに従って互いに配向する。【００１６】第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントとして有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こるべき天然ゲノム部位の別個の部分と相同のヌクレオチド配列である。たとえばゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ遺伝子の座で起こるべきである場合、用いられる第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはアルコールオキシダーゼ遺伝子の座の別個の部分と相同である。第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントとして使用しうるヌクレオチド配列の例は、ピチア・パストリスアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）遺伝子、ｐ４０遺伝子、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子、アシドホスファターゼ（ＰＨＯ１）遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子よりなる群から選ばれるデオキシリボヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子は米国特許第４，８５５，２３１および４，８８５，２４２号明細書に記載されており、両者をここに参考として引用する。ＤＡＳ１という表示は米国特許第４，８５５，２３１および４，８８５，２４２号明細書において最初に用いられたＤＡＳという表示と等しい。ＧＡＰ遺伝子は欧州特許出願公開第３７４，９１３号明細書（１９９０年６月２７日公開）に示されており、ここに参考として引用する。ＰＨＯ１遺伝子は米国特許出願第０７／６７２，５３９号明細書（１９９０年１２月１４日出願、フィリップス・ペトロリウム・カンパニーに譲渡）に示されており、ここに参考として引用する。【００１７】第１挿入性ＤＮＡフラグメントは発現カセットに用いられる調節領域からなるオペラブル調節領域を含むことができる。第１挿入性ＤＮＡフラグメントを発現カセットの調節領域として用いることは、本発明の好ましい形態である。図１は第１挿入性ＤＮＡフラグメントをカセットの調節領域として用いたベクターの図を提示する。図１に示すように、所望により挿入部位１または２以上、および３′側ターミネーション配列を第１挿入性ＤＮＡフラグメントの３′側に直接に配置することができる。この線状の部位特異性インテグラティブベクターの配置は、適合性３′側ターミネーション配列を別個に付加する必要なしに構造遺伝子を挿入するために用意された部位を提供するという付加的な利点をもつ。【００１８】第１挿入性ＤＮＡフラグメントが調節領域を含まない場合、オペラブル発現カセットを提供するためには適切な調節領域を構造遺伝子に結合した状態で挿入する必要がある。また挿入部位に発現カセットを完成する３′側ターミネーション配列が供給されていない場合、３′側ターミネーション配列を構造遺伝子の３′末端にオペラブル結合させることができる。【００１９】宿主株を形質転換するために用いられるＤＮＡ中に少なくとも１個の選択性マーカー遺伝子が含まれることも極めて望ましい。これにより、形質転換用ＤＮＡを取り込んだ微生物の選択および単離が容易になる。マーカー遺伝子は形質転換生物に宿主がもたなかった表現型上の特徴を与える。たとえば形質転換されていない宿主株が特定のアミノ酸生合成経路を欠如している場合、その特定のアミノ酸を産生する能力を回復させ、または抗生物質などに対する耐性を与える。選択性マーカー遺伝子の例は、ピチア・パストリスおよびビール酵母からのＨＩＳ４遺伝子（米国特許第４，８８５，２４２号明細書に記載）およびＡＲＧ４遺伝子（米国特許第４，８１８，７００号明細書に記載されており、ここに参考として引用する）、ビール酵母からのインベルターゼ遺伝子（ＳＵＣ２）（米国特許第４，８５７，４６７号明細書に記載されており、ここに参考として引用する）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトランスポジション可能な要素Ｔｎ６０１もしくはＴｎ９０３からのＧ４１８Ｒ／カナマイシン耐性遺伝子よりなる群から選ばれる。【００２０】本発明の実施に際して用いられるベクターに付加的なＤＮＡ配列、たとえば細菌性プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡなどをも取り込ませうることは当業者に自明である。これらの配列は細菌性宿主においてこれらのベクターを増幅および維持しうるものである。【００２１】適切なベクター中へのＨＳＡ構造遺伝子の挿入は、選ばれたベクターを適切な１または２以上の部位で開裂し、そしてＨＳＡ構造遺伝子を含む少なくとも１個のオペラブル発現カセットをベクター中に存在させる適切な方法により行うことができる。ＨＳＡ構造遺伝子のリゲーションはいずれか適切なリゲーション法により、たとえばＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。【００２２】ＨＳＡ構造遺伝子およびベクターのリゲーション混合物の初期選択、増殖、および所望により増幅は、好ましくは混合物を細菌性宿主、たとえば大腸菌中へ形質転換することにより行われる（リゲーション混合物を宿主酵母中へ直接に形質転換することもできるが、形質転換率が極めて低い）。大腸菌に関する適切な形質転換法は当技術分野で周知である。さらに、選択マーカー、および細菌性宿主におけるベクターの維持に必要な細菌性複製開始点も当技術分野で周知である。発現系内にＨＳＡ構造遺伝子を含む目的のプラスミドの単離および／または精製は、宿主ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを分離するためのいずれか適切な手段により行うことができる。同様に、リゲーションにより形成されたベクターを、好ましくは増殖後に試験して、ＨＳＡ遺伝子の存在、ならびに調節領域および ３′側ターミネーション配列へのそれのオペラブル結合を立証することができる。これはエンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動またはサザーンハイブリダイゼーションを含めた種々の方法により行うことができるが、これらに限定されない。【００２３】宿主酵母中へのプラスミドまたは線状ベクターの形質転換は下記により教示されるものを含めた適切な形質転換法により行うことができるが、これらに限定されない：クレグおよびバリンガー，米国特許第４，９２９，５５５号明細書；ヒネン（Ｈｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５（１９７８）１９２９；イトー（Ｉｔｏ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３；クレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（１９８５），ｐ．３３７６；Ｄ．Ｗ．ストローマンら，米国特許第４，８７９，２３１号明細書（１９８９年１１月７日発行）；またはスリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｇｅｎｅ，５９（１９８７），ｐ．１１５。本発明を実施するために好ましいものはクレグら（１９８５）の方法である。本発明を実施するためには、過剰の線状ベクターを用い、サザーンハイブリダイゼーションにより多数の挿入配列を選択することが望ましい。【００２４】形質転換に用いる宿主酵母はいずれか適切なメチロトロフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母であってもよい。適切なメチロトロフィック酵母にはハンセヌラ属およびピチア属よりなる群から選ばれる、メタノール上で増殖しうる酵母が含まれるが、これらに限定されない。この群の酵母の例である特定の種のリストはアンソニー（Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ），Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見られる。現在好ましいものは下記のピチア属メチロトロフィック酵母である：たとえば栄養要求性ピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）；ピチア・パストリスＧＳ１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４）、米国特許第４，８１８，７００号明細書に記載；ピチア・パストリスＰＰＦ１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７）、米国特許第４，８１２，４０５号明細書に記載。栄養要求性ピチア・パストリス株はそれらの選択の容易さにおいても本発明の実施に有利である。野生型ピチア・パストリス株（たとえばＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０およびＮＲＲＬ Ｙ−１１４３１）も、適切な形質転換マーカー遺伝子を選ぶならば、たとえばＳＵＣ２を用いてピチア・パストリスを蔗糖上で増殖しうる株に形質転換するか、または抗生物質耐性マーカー、たとえばＧ４１８を用いる場合、同様に有効に採用しうる。上記の株はすべて米国農務省、ノーザーン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーから入手される。【００２５】形質転換したピチア・パストリス細胞はそれ以前は栄養要求性であった細胞を形質転換後に、要求される（細胞の栄養要求性のため）生化学的物質の不在下で培養し、新たな表現型（″メタノールスロー″）を選択および検出する方法、または形質転換体に含まれる耐性遺伝子の不在下では酵母にとって有毒である抗生物質の存在下で培養する方法を含めた適宜な方法により選択することができるが、これらに限定されない。【００２６】単離した形質転換ピチア・パストリス細胞は適宜な発酵法、たとえば振盪フラスコ発酵法、高密度発酵法、またはクレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，メチロトロフィック酵母、ピチア・パストリスにおける肝炎Ｂ表面抗原の高水準発現および効果的アセンブリー ５ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９（１９８７）に示される方法により培養される。単離体はＨＳＡ産生をアッセイして、最大ＨＳＡ産生水準をもつ単離体を同定することによりスクリーニングすることができる。【００２７】形質転換したピチア・パストリスの培養は水性連続式またはバッチ供給式で、種々の炭素エネルギー源および／または栄養源を用いて行うことができる。本発明の実施にはバッチ供給式発酵法が好ましい。ピチア・パストリスを増殖させるのに適した炭素エネルギー源にはメタノール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、フルクトースおよびそれらのうち１または２以上の組み合わせよりなる群から選ばれる炭素エネルギー源が含まれるが、これらに限定されない。ピチア・パストリスを増殖させるための好ましい炭素エネルギー源はメタノール、グリセリンおよびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる炭素エネルギー源である。ピチア・パストリスに適した栄養源または培地には、少なくとも１種類の窒素源、少なくとも１種類のホスフェート源、少なくとも１種類の無機質源、たとえば鉄、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、カルシウム、および他の微量元素、ならびにビタミン（たとえばビオチン、パントテン酸、および必要に応じてチアミン）が含まれる。【００２８】少なくとも１種類の炭素エネルギー源および栄養素の適切な供給源は種々の供給源から得られるか、または単一供給源からなるものでもよい。しかし好ましいものは特性が定まった少なくとも１種類の炭素エネルギー源および／または栄養源である。効果が証明された炭素エネルギー源および／または栄養素の組成物の一例は下記のものである：【表２】１酵母エキスはアンベレックス（Ａｍｂｅｒｅｘ）（商標）１００３であり、これはユニバーサル・フーズ・コーポレーション（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から入手され、その商標である。２無機質および微量金属はＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６５．０ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ６．０ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４ ３．０ｇ／ｌ、およびＨ２ＳＯ４ ５．Ｏｍｌ／ｌである。【００２９】本発明に用いられる酵母エキスには、アンベレックス（商標）１００３およびバクト（Ｂａｃｔｏ）（商標）酵母エキス（ディフコ・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド）よりなる群から選ばれる酵母エキスが含まれるが、これらに限定されない。あるいは窒素源として酵母エキスの代わりにコーン・スチープ・リカーを用いることができる。【００３０】本発明に用いられる微量金属は、酵母の増殖に一般に用いられる微量金属であり、ピチア・パストリスの増殖速度またはＨＳＡ産生を制限しない十分な量で供給され、これにはコバルト、モリブデン、鉄、銅、亜鉛およびマンガンよりなる群から選ばれる微量金属が含まれるが、これらに限定されない。【００３１】発酵温度は一般に約２０−約３５℃、好ましくは約３０℃である。【００３２】発酵をバッチ供給式で行う発酵容器内の溶存酸素含量は、飽和の約２０−約８０％、好ましくは飽和の約３０−約６０％である。【００３３】ＨＳＡ構造遺伝子を含むベクターで形質転換したピチア・パストリス株を高密度になるまで培養したのち、形質転換した株を約５．７−約６．０のｐＨで誘導してＨＳＡを発現させる。たとえばメタノール誘導性調節領域を含む線状発現カセットで形質転換された株につきこの方法を採用する場合、培養物をまず最少塩類、ビオチンおよび５重量％グリセリン上で目的密度になるまで増殖させる。約３０℃の温度および飽和の約２０％の溶存酸素濃度において、ｐＨを約５．８に調整すべきである（アンモニアにより）。グリセリンが消費されたのち、メタノールを徐々に供給し始めることによりプロモーターが誘導される。この供給は、少なくとも培養物の生存を維持するのに十分に量であり、ただし培養物と接触するメタノールの最大濃度約５．０重量％を越えてはならない。メタノールの供給に際して無細胞ブロス中に存在するＨＳＡをサンプリングすることによりＨＳＡ分泌を監視することができる。産生されたＨＳＡの量を定量するのに適した試験法は当業者に既知のもの、たとえば流動ポリアクリルアミドゲルである。メタノールの供給はＨＳＡ濃度が受容しうる水準に達するまで継続すべきである。一般にＨＳＡの産生はメタノール供給の約１２０時間後にピークとなるであろう。【００３４】ピチア・パストリス細胞をｐＨ制御式発酵槽の代わりに振盪試験管または振盪フラスコで増殖させる場合、分泌蛋白質、たとえばＨＳＡの最大収率を保証するために追加工程を採用すべきである。詳細には、用いる培地を発酵槽で用いたものから複合培地に変更し、通気量を増加させることが推奨される。振盪フラスコおよび振盪試験管に用いる複合培地は、追加アミノ酸を含有すべきである。アミノ酸はグルタミン酸、メチオニン、リジン、ロイシン、イソロイシンおよび他のアミノ酸を含有する特定の培地に含まれていてもよく、または複合培地への補充物、たとえば酵母エキスもしくはカザミノ酸によるものであってもよい。添加アミノ酸の相対濃度は一般に約２．５−約１０ｍｇ／ｌであり、好ましい範囲はグルタミン酸、メチオニン、リジン、ロイシンおよびイソロイシンについては約４−約６ｍｇ／ｌ、他のアミノ酸については約０．５−約３ｍｇ／ｌである（ただし添加アミノ酸からヒスチジンは完全に排除しうる）。添加アミノ酸の代わりに酵母エキスを用いる場合、酵母エキスが約１−約１５ｇ／ｌの濃度で供給されるように使用することが好ましく、酵母エキスが約１０ｇ／ｌの濃度で供給されることが極めて好ましい。振盪試験管および振盪フラスコにおける分泌を改善するために、培地にペプトンを添加するのが望ましいことも認められた。最適分泌のためにはこのペプトンは酵母エキスと共に約１−約５０ｇ／ｌの濃度で、極めて好ましくは約２０ｇ／ｌの濃度で用いられる。指針として、一般にペプトン濃度は酵母エキス濃度の２倍であることが推奨される。【００３５】形質転換したピチア・パストリスの振盪フラスコおよび振盪試験管培養における通気は最適分泌を得るのに重要なパラメーターであると思われる。適切な分泌を保証するために、振盪試験管またはフラスコが通気性キュップで蓋をした大きな開口を備えていることが推奨される。適切な通気性キュップは粗い濾材、たとえばチーズークロスで作成しうる。本発明に適した振盪フラスコの一例はチューンエア（Ｔｕｎａｉｒ）振盪フラスコである。一般に過度の発泡を避けるために低バフル振盪フラスコも推奨される。通気のための振盪機速度は約２５０−約３００ｒｐｍであることが推奨される。【００３６】振盪フラスコまたは振盪試験管において適切な細胞密度に達したのち、細胞を採取し、次いで蛋白質の分泌を誘導するために、増殖に用いた炭素源の代わりにメタノールを含有する培地に再懸濁する。次いで目的水準の産生が達成された時点を判定するために、振盪フラスコまたは振盪試験管を常法により監視する。【００３７】本発明を以下の実施例においてより詳細に説明するが、これらは限定ではない。【００３８】【実施例】実施例に関する一般情報：菌株ピチア・パストリスＧＳ１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１大腸菌ＤＧ７５′（ｈｓｄ１、ｌｅｕ６、ｌａｃＹ、ｔｈｒ−１、ｓｕｐＥ４４、ｔｏｎＡ２１、ｌａｍｂｄａ−）緩衝液、溶液および培地以下の実施例で用いた緩衝液、溶液および培地は下記の組成をもつ：ｄＨ２Ｏ ミリ−Ｑ（ミリポア）試薬用水システムで処理した脱イ オン水１Ｍトリス緩衝液 ８００ｍＬのＨ２Ｏ中にトリスベース１２１．１ｇ；濃（３５％）ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨを目的の値に 調整；最終ｐＨ調整前に溶液を室温に冷却し、最終容量 １Ｌに希釈。【００３９】方法組換えＤＮＡ実験室作業に適した方法は多様な文献中に見られ、それらには以下のものが含まれるがこれらに限定されない：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレス社），特にＶｏｌ．１５２、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，バーガーおよびキンメル（Ｂｅｇｅｒ，Ｋｉｍｍｅｌ），（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレス社，１９８７），ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社，１９８９）；これらすべてをここに参考として引用する。【００４０】例１５′側イグザクトＨＳＡ発現ベクターｐＨＳＡ３１３の構成天然ＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）の３′末端とＨＳＡ構造遺伝子の開始コドンとの間のイグザクト結合（ｅｘａｃｔ ｌｉｎｋａｇｅ）を含むベクターを備えたｐＨＳＡ３１３ベクターを構成した。【００４１】Ａ．ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書（ここに参考として引用する）に示されるｐＨＳＡ１１３（図７参照）約２００ｎｇを、ＲＥａｃｔ１緩衝液２０μｌ中のＣ１ａＩ １単位により３７℃で１時間消化した。消化混合物を水で１００μｌとなし、等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ Ｖ／Ｖ）で１回抽出し、次いで水層を等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍに調整し、３容量の冷エタノールを添加することにより、水相中のＤＮＡを沈殿させた。混合物を氷上（４℃）に１０分間放置し、ミクロ遠心機により４℃において１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによりＤＮＡ沈殿を採取した。ＤＮＡペレットを７０％冷エタノール水溶液で２回洗浄した。洗浄したペレットを真空乾燥し、１０μｌの水に溶解し、これに２μｌの１０×リゲーション緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、６μｌの水、および１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加した。混合物を４℃で一夜インキュベートし、１０μｌアリコートを用いて大腸菌ＤＧ７５′（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら）を形質転換し、ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。これはＨＩＳ４および３′側ＡＯＸ１、ならびにこれらの配列を結合するのに用いた小範囲のｐＢＲ３２２配列の欠失を示す。ＨＩＳ４、３′側ＡＯＸ１およびｐＢＲ３２２配列の欠失により、ｐＨＳＡ１１３ベクター中に存在するＣｓｐ４５Ｉ部位２カ所のうち１カ所が排除される。残りのＣｓｐ４５Ｉ部位はＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）中にある。【００４２】Ｂ．ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成５μｇのｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、ＲＥａｃｔ２緩衝液１００μｌ中のＢｓｔＥＩＩ １０単位により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノールで抽出し、工程Ａの詳述に従って沈殿させた。ＤＮＡ沈殿をＣｓｐ４５Ｉ緩衝液１００μｌに溶解し、１０単位のＣｓｐ４５Ｉの存在下に３７℃で２時間消化した。次いで消化したＤＮＡをフェノール抽出し、工程Ａの詳述に従って沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を２０μｌの水に溶解し、１０μｌアリコートを０．９％アガロースゲルの隣接ウェル２個に装填した。電気泳動ののち、レーンの１つに対応するゲル部分を染色し、これを用いて未染色レーン中のｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａのＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントの位置を決定した。大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを含むゲル部分を切り出し、ゲル中のＤＮＡを５００μｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中へ電気泳動により溶出した（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。ＤＮＡ溶液を工程Ａの詳述に従ってフェノール抽出し、ＤＮＡ沈殿を１００μｌの水に溶解した。次いで大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを下記のＢｓｔＥＩＩ−Ｃｓｐ４５Ｉオリゴヌクレオチドリンカーとリゲートした。アリコート（１０μｌ）を４℃で一夜、２０ｎｇのアニールしたリンカーオリゴヌクレオチド５′−ＣＧＡＡＡＣＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および５′−ＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）と、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩衝液２０μｌ中においてリゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａベクターは上記リンカーにより、外来ＤＮＡ配列を含まない天然ＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）の３′末端とＨＳＡのＡＴＧ開始コドンとの間のイグザクト結合を有する。【００４３】Ｃ．ｐＨＳＡ３１３の形成１μｇのｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩衝液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化した。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファターゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分間処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、約１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存した。【００４４】１μｇのｐＡＯ８０７Ｎ（図８、その構成は欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記載）をＲＥａｃｔ２緩衝液１００μｌ中のＰｓｔＩにより３７℃で４時間消化した。消化したＤＮＡをアルカリホスファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファターゼで２００μｌの反応容量において５５℃で１５分間処理した。１５分間の終了時にさらに１０単位のホスファターゼを添加し、１５分間インキュベートした。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させた。１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＲＥａｃｔ１緩衝液１００μｌ中のＣ１ａＩ ５単位によりＤＮＡを３７℃で４時間消化し、工程Ａの記載に従ってフェノール抽出し、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を約２０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解した。【００４５】約１００ｎｇ（１０μｌ）のＣ１ａＩ開裂−ホスファターゼ処理ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、約８０ｎｇのＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ処理およびＣ１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（４μｌ）、４μｌの５×リガーゼ緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡと混合し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼをを用いて４℃で一夜リゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＨＳＡ３１３を得た。このリゲーションによるｐＨＳＡ３１３プラスミドは、ＨＩＳ４遺伝子およびＡＯＸ１ ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８０７Ｎ由来）に結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ配列を含む。ｐＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分の相対配向は図７にｐＨＳＡ１１３プラスミドにつき示したものと同じである。【００４６】例２発現ベクターｐＰＧＰ１の構成発現ベクターｐＰＧＰ１を下記に従って構成した。ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ（例１参照）をＢｓｕ３６ＩおよびＰｖｕＩＩ（部分）で消化し、ベクター主鎖を単離した。ｐＨＳＡ１１３（欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記載）に含まれる構造遺伝子に類似のＰｖｕＩＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ上のＨＳＡ構造遺伝子をこのベクター主鎖にリゲートしてｐＰＧＰ１△Ｃ１ａを得た。約１００ｎｇのｐＰＧＰ１△Ｃ１ａをＣ１ａＩにより３７℃で１時間消化した。例１に従ってＤＮＡを採取した。約１００ｎｇのｐＡＯ８０７Ｎ（本明細書の図８に示し、欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記載）をＰｓｔＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理し、次いで例１Ｃの詳述に従ってＣ１ａＩで消化した。次いでこのフラグメントをＣ１ａＩ消化−アルカリホスファターゼ処理ｐＰＧＰ１△Ｃ１ａにリゲートしてｐＰＧＰ１を得た。（ＧＳ１１５ ｐＰＧＰ１−９−６はピチア・パストリスＧＳ１１５をｐＰＧＰ１で形質転換することにより得たクローンであり、このクローンを発酵に用いた。）例３５′側および３′側イグザクトＨＳＡ発現プラスミドｐＨＳＡ４１３の構成ＡＯＸ１ ５′側調節領域の３′末端とＨＳＡ構造遺伝子の開始コドンとの間のイグザクト結合、およびＡＯＸ１ ３′側ターミネーション配列の５′末端とＨＳＡ構造遺伝子の３′末端との間のイグザクト結合を有するベクターを提供するｐＨＳＡ４１３ベクターを構成した。【００４７】Ａ．ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成１μｇのｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、ＲＥａｃｔ３緩衝液１００μｌ中のＥｃｏＲＩ １０単位により３７℃で４時間消化した。消化混合物をフェノール抽出し、例１の詳述に従ってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を２０μｌの水に溶解し、Ｂｓｕ３６Ｉ緩衝液１００μｌ中のＢｓｕ３６Ｉ ２０単位により３７℃で１時間消化した。消化混合物をフェノール抽出し、例１の詳述に従ってＤＮＡを沈殿させ、１００μｌの水に溶解した。約１００ｎｇのＥｃｏＲＩおよびＢｓｕ３６Ｉ開裂ＤＮＡを、１０ｎｇのアニールしたオリゴヌクレオチド５′−ＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および５′−ＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）と混合し、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌ中において４℃で一夜リゲート（ｌｉｇａｔｅ）した。リゲーション混合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を用いて大腸菌を形質転換し、ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。このプラスミドにおいては、ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ中に存在するＢｓｕ３６ＩとＥｃｏＲＩの間の下記配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：が下記の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）により置換されている：Ｂ．ｐＨＳＡ４１３の形成１μｇのｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩衝液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化した。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファターゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分間処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、約１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存した。【００４８】約１００ｎｇ（１０μｌ）のＣ１ａＩ開裂−ホスファターゼ処理ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、約８０ｎｇ（４μｌ）のＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ処理およびＣ１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（例１の工程３、第２節を参照されたい）、４μｌの５×リガーゼ緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡと混合し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて４℃で一夜リゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＨＳＡ４１３を得た。このリゲーションによるｐＨＳＡ４１３プラスミドは、ＨＩＳ４遺伝子およびＡＯＸ１ ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８０７Ｎ由来）に結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ配列を含む。ｐＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分の相対配向は図７にプラスミドｐＨＳＡ１１３につき示したものと同じである。【００４９】例４ｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＰＧＰ１によるピチア・パストリスの形質転換Ａ．ベクターの調製それぞれ約１０μｇのｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３、ｐＰＧＰ１およびｐＡＯ８０７Ｎ（陰性対照）をＨＳ緩衝液２００μｌ中において、５０単位のＮｏｔＩにより３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料をフェノール抽出し、例１の記載に従って沈殿させ、２０μｌのＣａＳに溶解し、次いでピチア・パストリスＧＳ１１５の形質転換に用いた。同様にそれぞれ約１０μｇのｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＡＯ８０７Ｎを、２０単位のＳｓｔＩにより、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＲＥａｃｔ２緩衝液２００μｌ中において３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料をフェノール抽出し、例１の記載に従って沈殿させ、２０μｌのＣａＳに溶解した。【００５０】Ｂ．細胞の増殖ピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）を約１０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１２−２０時間振盪培養した。１００ｍｌのＹＰＤ培地に種培養物を接種して、約０．００１のＯＤ６００を得た。この培地を振盪フラスコ中において３０℃で約１２−２０時間培養した。ＯＤ６００が約０．２−０．３となった時点で、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＢ５Ｃを用いて１５５５ｇで５分間遠心分離することにより培養物を採取した。【００５１】Ｃ．スフェロプラストの調製細胞を１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、次いで１５００ｇで５分間遠心分離した。（遠心分離は特に指示しない限り、各細胞洗浄ののち、ソルバルＲＴ６０００Ｂを用いて１５００ｇで５分間行う。）細胞を１０ｍｌの新たに調製したＳＥＤ中で１回、１０ｍｌの無菌１Ｍソルビトール中で１回洗浄し、最後に１０ｍｌのＳＣＥ緩衝液に再懸濁した。７．５μｌの３ｍｇ／ｍｌチモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）（１００，０００単位／ｇ、マイルズ・ラボラトリーズより入手）を細胞懸濁液に添加した。細胞を３０℃で約１０分間インキュベートした。（５％ＳＤＳ中におけるＯＤ６００の６０％低下を正確な時間マーカーとして利用しうる。）スフェロプラストを１０ｍｌの無菌１Ｍソルビトール中において７００ｇで５−１０分間遠心分離することにより洗浄した。１０ｍｌの無菌ＣａＳを細胞の最終洗浄液として用い、細胞を再度７００ｇで５−１０分間遠心分離し、次いで０．６ｍｌのＣａＳに再懸濁した。【００５２】Ｄ．形質転換ピチア・パストリスＧＳ１１５細胞を１０μｇの線状ＤＮＡ（工程Ａ参照）により、スリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｇｅｎｅ５９，１１５−１２５（１９８７）のスフェロプラスト形質転換法によって形質転換した。ＤＮＡ試料を１２×７５ｍｍの無菌ポリプロピレン試験管に添加した（２０μｌの容量となるまで）。（ＤＮＡは適切な緩衝液、たとえばＴＥ緩衝液、またはＣａＳ中に含有すべきである。）１００μｌのスフェロプラストを各ＤＮＡ試料に添加し、室温で約２０分間インキュベートした。１ｍｌのＰＥＧ溶液を各試料に添加し、室温で約１５分間インキュベートし、７００ｇで５−１０分間遠心分離した。ＳＯＳ（１５０μｌ）をペレットに添加し、室温で約３０分間インキュベートした。最後に８５０μｌの１Ｍソルビトールを添加した。【００５３】Ｅ．スフェロプラストのリジェネレーション形質転換試料を用意する少なくとも３０分前に、平板当たり２０ｍｌのリジェネレーション用寒天ＳＤＲの底部アガロース層を注入した。さらに、形質転換試料がＳＯＳ中にある期間中に、４５℃の水浴中の１５ｍｌコニカルボトム型コーニング試験管に８ｍｌアリコートのリジェネレーション用寒天を分配した。形質転換した試料５０または２５０μｌアリコートを４５℃に保持された溶融リジェネレーション用寒天８ｍｌアリコートに添加し、２０ｍｌ固形底部寒天層を含む平板上に注入した。これらの平板を３０℃で３−５日間インキュベートした。【００５４】Ｆ．形質転換体の選択ヒスチジンを欠如する培地ＳＤＲ上で培養することにより形質転換体を選択した。ＮｏｔＩ線状ベクターを用いて得た形質転換体の場合は、ヒスチジンの不在下で増殖したコロニーを″メタノール−スロー″表現型（ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントによるＡＯＸ１構造遺伝子の置換を示す）についてもスクリーニングした。次いで″メタノール−ノーマル″（ＳｓｔＩ線状ＤＮＡを用いて得たもの）およびメタノール−スローを示す数種類の形質転換ＧＳ１１５細胞を培養し、ＨＳＡの産生につきアッセイした。【００５５】例５ピチア・パストリスのインテグラティブ形質転換体におけるメタノール誘導ＨＳＡ分泌ｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＰＧＰ１を用いて形質転換したピチア・パストリスＧＳ１１５株を振盪試験管培養においてＨＳＡ分泌につき分析した。メタノール−スローおよびメタノール−ノーマル双方の株を用いた。それぞれの場合、３６の独立コロニーを試験した。ｐＡＯ８０７Ｎを用いて得た形質転換体を陰性対照とした。培地中へのＨＳＡの効果的な分泌および安定な蓄積を保証するためのプロトコールを開発した。【００５６】細胞を５０ｍｌの試験管に入れた１０ｍｌのＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達するまで増殖させた（２−３日間）。細胞は１０−２０Ａ６００単位である。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、次いでペレットを２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁した。試験管にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズクロス）で蓋をした。次いで試験管を３０℃の振盪機に戻した。２−３日間の終了時に細胞をペレット化し、上澄液を産生物につきアッセイした。ペレットを新鮮な培地で再懸濁し、新たな分泌のために振盪機へ戻すことができる。ピチア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクマシー染色による分析のために、１０μｌの培地上澄液で十分であった。これらの条件下でＨＳＡに対応する６７ｋＤの単一バンドが認められた。形質転換体ＧＳ１１５／ｐＨＳＡ３１３とＧＳ１１５／ｐＨＳＡ４１３の発現水準に有為差はなく、これはｐＨＳＡ３１３中に存在するＨＳＡ遺伝子からの３′側非翻訳配列の欠失は発現水準に有為に影響を与えないことを示す。メタノール−スローとメタノール−ノーマルの形質転換体間にＨＳＡ発現水準の有為差は認められず、これはＡＯＸ１の分断が効果的ＨＳＡ発現にとって本質的でないことを示す。予想どおりＧＳ１１５／ｐＡＯ８０７Ｎ形質転換体（陰性対照）の培地および細胞抽出液のいずれにもＨＳＡは存在しなかった。ＨＳＡ分泌水準の上昇を示した変異クローンを選択した。【００５７】例６ＨＳＡ産生のためのＭｕｔ−ピチア・パストリスのバッチ供給式発酵ピチア・パストリスＧＳ１１５：ｐＨＳＡ ４１３−６およびｐＰＧＰ１−９−６を作業容量８．５リットルの２０リットル容バイオラフィッテ（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ）発酵槽２個に接種した。接種物は下記の方法で調製された：培養物をＹＭ平板上で増殖させ、次いで振盪フラスコ中のＹＭブロス１００ｍｌに移し、約２４時間増殖させた。この培養物５０ｍｌを振盪フラスコ中のＹＭブロス１リットルに移し、同様に約２４時間増殖させた。次いでこの１リットルをバイオラフィッテ発酵槽中の発酵培地８．５リットルに移した。発酵培地は最少塩類＋ビオチン＋５％グリセリンからなっていた。バッチ増殖条件には下記のものが含まれる：ｐＨ＝５．８（ＮＨ３で調整）、温度＝３０℃、および空気飽和２０％以上の溶存酸素。【００５８】約２４時間後にグリセリン消費が完了し、この時点で１０−１５ｍｌ／時の量で緩徐なメタノール供給を開始した。発酵槽中のメタノール濃度を監視し、ブロス中のメタノール濃度０．５−０．９％を維持すべく供給量を調整した。【００５９】クマシーブルー染色したＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の濃度測定により、培地中に分泌されたＨＳＡを定量した。領域は同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で実験した一連の既知重量の真正ＨＳＡを参考にした。これらのゲルから得たデータを表３および４に示す。【００６０】次表はｐＨ変化がＨＳＡ産生量に及ぼす影響を示す：【表３】次表は比較的高いｐＨ水準において達成されるＨＳＡ産生水準を示す：【表４】例７ピチア・パストリスからの振盪試験管および振盪フラスコ内蛋白質分泌に関するプロトコール振盪試験管および振盪フラスコ内でのＨＳＡの効果的な分泌および安定な蓄積のためには、発酵培地について５．０または５．２の代わりに５．７−６．４のｐＨを用い、発酵槽培地に少量の酵母エキス（０．５−０．１％）およびペプトン（０．１−０．２％）を添加し、低い細胞密度（乾燥細胞重量２０−２５ｇ／ｌ）において発現を誘発することが必要である。これらの方法を利用して、本発明者らは振盪試験管およびフラスコ内で増殖する細胞からＨＳＡを効果的に分泌させうるプロトコールを開発した。このプロトコールはピチア・パストリスからの蛋白質の分泌一般に利用しうると考えられる。【００６１】振盪試験管：細胞を５０ｍｌの試験管に入れた１０ｍｌのＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達するまで増殖させた（２−３日間）。細胞のＡ６００は１０−２０単位である。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、ペレットを２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁した。試験管にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズクロス）で蓋をした。試験管を振盪機に戻し、振盪機を約３０℃に保持した。２−３日間の終了時に細胞をペレット化し、上澄液を産生物につき分析した。ペレットを新鮮な培地で再懸濁し、新たな分泌のために振盪機へ戻すことができる。ピチア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクマシー染色による分析のために、１０μｌの培地上澄液で十分であった。これらの条件下でＨＳＡサイズ（６７ｋＤ）に対応する単一バンドが認められた。【００６２】振盪フラスコ：細胞を上記に従って２リットルのフラスコ中の１リットルの培地（ＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ）中で増殖させた。細胞を採取し、発酵フラスコ（チューンエア（Ｔｕｎａｉｒ、商標）振盪フラスコ発酵システム、リサーチ・プロダクツ・インタナショナル・コーポレーション）またはチーズクロスで蓋をしたバフル付きフラスコ中のＢＭＭＲまたはＢＭＭＹ５０−７５ｍｌに懸濁した。３０℃の振盪機に戻し、２−４日間誘導した。２−４日間の終了時に細胞をペレット化し、上澄液を産生物につき分析した。ペレット化した細胞を新鮮な培地に再懸濁することにより、振盪試験管分泌を再開することができる。【００６３】【配列表】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：９４０ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：６００ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１８３０ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１６ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１９ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１３ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１４ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２３１ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：リンカーオリゴヌクレオチド（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２０ｂｐ（Ｂ）種類：ＤＮＡ（Ｃ）鎖形成状態：１本（Ｄ）位相幾何学的状態：線状（ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド（ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：【図面の簡単な説明】【図１】Ｂｇ１ＩＩからＢｇ１ＩＩへ時計回りにフラグメント中に線状部位特異性インテグラティブベクターを含むプラスミドｐＡＯ８０４を示す図である。構造遺伝子をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することができる。このプラスミドはＮＲＲＬ Ｂ−１８１１４のプラスミドＤＮＡから、ＥｃｏＲＩ消化およびゲル電気泳動を行い、図１に対応する線状の〜７．４ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを採取することにより得られる。【図２】環状のｐＨＳＡ１３を示す図である。【図３】ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１ ５′側調節領域を示す制限地図である。【図４】ピチア・パストリスから単離されたＤＡＳ１ ５′側調節領域を示す制限地図である。【図５】ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１ ３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。【図６】ピチア・パストリスから単離されたＤＡＳ１ ３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。【図７】線状ｐＨＳＡ１１３を示す図である。【図８】ＮｏｔＩからＮｏｔＩへ時計回りにフラグメント中に線状部位特異性インテグラティブベクターを含むプラスミドｐＡＯ８０７Ｎを示す図である。構造遺伝子をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することができる。 形質転換したピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞において異種蛋白質を分泌させるための、下記よりなる改良法：（ａ）分泌シグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードし、該シグナル配列が成熟ＨＳＡ蛋白質をコードする配列にオペラブル結合しているＨＳＡ構造遺伝子を発現しうる形質転換したピチア・パストリス細胞を、発酵機中の発酵ブロス中において、形質転換したピチア・パストリス細胞の生存を維持するのに適した条件下で、該ピチア・パストリス細胞による成熟ＨＳＡ蛋白質の発現に適した条件下に培養し、そして（ｂ）異種蛋白質の発現と同時期に、該発酵ブロスのｐＨを５．７−５．９７のｐＨに保持する。 ピチア・パストリスが環状プラスミドおよび線状プラスミドよりなる群から選ばれるベクターにより形質転換される、請求項１に記載の方法。 ベクターが線状インテグラティブ部位特異性ベクターである、請求項２に記載の方法。 線状インテグラティブ部位特異性ベクターが下記の順次配置を含み：（ａ）第１挿入性ＤＮＡフラグメント、（ｂ）マーカー遺伝子少なくとも１個、ならびにシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードし、ピチア・パストリスＡＯＸ１調節領域およびターミネーション配列にオペラブル結合しているＨＳＡ構造遺伝子を含む発現カセット少なくとも１個、ならびに（ｃ）第２挿入性ＤＮＡフラグメント；その際成分（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットの順序は互いに交換することができ、用いられる第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはピチア・パストリスゲノムの別個の部分と相同であり、これらの挿入性フラグメントはピチア・パストリスゲノム中に存在するものと同一の相対配向である、請求項３に記載の方法。 第１挿入性ＤＮＡフラグメントおよび第２挿入性ＤＮＡフラグメントが、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＤＡＳ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＨＯ１遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子よりなる群から選ばれるピチア・パストリスからの遺伝子のＤＮＡ配列より得られる、請求項４に記載の方法。 マーカー遺伝子が、ピチア・パストリスから単離されたＨＩＳ４、ピチア・パストリスから単離されたＡＲＧ４、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＳＵＣ２、Ｔｎ９０３のＧ４１８R遺伝子、およびＴｎ６０１のＧ４１８R遺伝子よりなる群から選ばれる、請求項４または５に記載の方法。 異種蛋白質発現に際して発酵ブロスのｐＨが５．７５−５．８５に保持される、請求項４、５または６に記載の方法。 プラスミドが自己複製ＤＮＡ配列およびマーカー遺伝子からなる、請求項４、５、６または７に記載の方法。 プラスミドが下記よりなる、請求項２−８のいずれかに記載の方法：（ａ）ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１調節領域；下記にオペラブル結合：（ｂ）ＨＳＡに対する天然シグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードし、該ＨＳＡシグナル配列が成熟ＨＳＡ蛋白質をコードする配列にオペラブル結合しているＨＳＡ構造遺伝子；下記にオペラブル結合：（ｃ）ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１のターミネーション配列；下記にオペラブル結合：（ｄ）少なくとも１個のマーカー遺伝子、ならびに（ｅ）約０．１９キロベース配列の自己複製ＤＮＡ配列である第２ＤＮＡフラグメント。 形質転換したピチア・パストリス細胞をＨＳＡの発現に際してバッチ供給式で増殖させ、異種蛋白質発現に際して発酵ブロスのｐＨがｐＨ５．７−ｐＨ５．９７に保持される、請求項１−９のいずれかに記載の方法。 形質転換したピチア・パストリス細胞の生存を維持するために、発酵ブロスが有効量の適切な最少塩類混合物、増殖因子、ならびにメタノール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、フルクトースおよびそれらのうち１または２以上の組み合わせよりなる群から選ばれる少なくとも１種類の適切な炭素源を含有する、請求項１０に記載の方法。 発酵ブロスの炭素源が消費されたのち、形質転換したピチア・パストリス細胞をメタノールと接触させ、その際メタノールがそれと接触するピチア・パストリス細胞の生存を維持するのに十分な量で供給され、かつメタノール濃度が約５．０重量％を越えない、請求項１１に記載の方法。 ピチア・パストリス細胞のバッチ供給式増殖に際してのｐＨがｐＨ５．８である、請求項１０に記載の方法。