生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B1)_新規微生物 |
| 出願番号： | 2014222126 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 1/20,B09B 3/00 |
特許情報キャッシュ
岡村 好倫 山村 正一 JP 5689560 特許公報(B1) 20150206 2014222126 20141031 新規微生物 株式会社 山有 598052089 特許業務法人 もえぎ特許事務所 110000774 岡村 好倫 山村 正一 20150325 C12N 1/20 20060101AFI20150305BHJP B09B 3/00 20060101ALI20150305BHJP JPC12N1/20 AC12N1/20 DC12N1/20 FB09B3/00 A Ｃ１２Ｎ Ｂ０９Ｂ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＰｕｂＭｅｄ 特開２０１１−０２４５６９（ＪＰ，Ａ） 特開２００８−２７８８９０（ＪＰ，Ａ） 特開２００５−０１３０６３（ＪＰ，Ａ） 9 NPMD NITE BP-01764 NPMD NITE BP-01948 NPMD NITE BP-01949 NPMD NITE BP-01950 NPMD NITE BP-01925 40 20141031 櫛引 明佳 本発明は、新属フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種となる新規微生物に関する。さらに詳しくは、次の１）〜１０）の特性を有するフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）に関する。１）グラム染色が陰性であり、胞子を形成する２）オキシダーゼテストは陰性、カタラーゼテストは陽性で好気性である３）１％の糖および２．０％のＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）に、該糖としてＤ−ガラクトースまたはシュークロースを加えた場合には酸生成を行わないが、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、グリセリンまたはＮ−アセチルグルコサミンを加えた場合には酸生成を行う４）至適生育温度は４５℃〜５５℃であり、３５℃以下または６５℃以上では増殖が確認されない５）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．７以下またはｐＨ１０．０以上では増殖が確認されない６）ＣＹＣ培地にＮａＣｌを終濃度７％まで添加しても増殖が確認される７）主要なメナキノンはＭＫ７である８）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む９）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は５１．２％〜５２．４％である１０）最も主要な菌体脂肪酸はｉｓｏ−Ｃ１６：０である 従来の堆肥化の過程では、カビなどの真菌、放線菌と呼ばれるアクチノマイセテイルズ目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目）の細菌、サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属）などサーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）の細菌、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）やゲオバチラス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）などバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）の細菌が有機物を分解・資化して、堆肥化を担っている。これらの微生物は胞子形成能を有し、各個体の生育温度以上に昇温した環境では胞子の状態で耐熱性を示して安定的に堆肥内に留まることができるため、生育適温において有機廃棄物を分解・資化した後も、戻し堆肥として繰り返し堆肥化に利用することができる。 堆肥化では、嫌気的発酵よりも好気的発酵のほうが有機物の分解が早く、悪臭も低減できるため望ましい。好気的発酵による堆肥化の過程では、通気による好気的な発酵を開始して１０日以内に堆肥内部の温度が４５℃を越える高温となり、高温状態は堆肥化終了まで長期的に維持される。４５℃〜７０℃の堆肥内の高温環境ではミクロモノスポラジー科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ科）、ストレプトマイセタジー科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）、サーモモノスポラジー科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｎｃｅａｅ科）、ストレプトスポランジアジー科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ科）などアクチノマイセテイルズ目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目）の放線菌群、好熱性で糸状性の形態を有するサーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）の細菌群が有機物の分解を担っている（非特許文献１）。また、ゲオバチラス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）が属するバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）の細菌群も高温環境下の堆肥内に存在している（非特許文献２、非特許文献３）。高温状態の堆肥内部ではこれらの限られた分類学群内に属した菌群が主に堆肥化を担っているが、各科（ｆａｍｉｌｙ）内の菌種は性状の似た菌で構成されているので、一般的に高温になって以降の堆肥内部の菌群は多様性が低い状態である。 特許文献１にはＡｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株を用いて堆肥を製造する方法、特許文献２にはＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌株を用いて堆肥を製造する方法が記載されているが、いずれもバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）の細菌を利用している。 一方、廃棄物処理に出される有機廃棄物は有機性汚泥、食品残渣物、動物糞尿など多岐に渡り、廃棄物原料の種類によって堆肥内のｐＨや塩濃度、腐植酸濃度、Ｃ／Ｎ比は大きく変わる。このため、多様な有機廃棄物を効率的に堆肥化処理するためには、既存の菌群と異なる菌群を添加して堆肥中で生育させ、多様な菌種により有機物を分解・資化することが望ましい。また、添加する菌群は胞子形成能を有することで休眠状態を維持でき、環境の変化に耐えられるものが望ましい。安定した胞子の状態は保管、運搬が容易であり、さらに、戻し堆肥として繰り返し使用できるために経済的である。 これまで本発明者らは、堆肥化に利用できることができる新規の細菌を探索し、８０℃以上の環境下で生育する新規な属に属する超好熱菌を見出している（特許文献３）。特開２０１１−２４５６９号公報特開２００８−２７８８９０号公報特開２００５−１３０６３号公報Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ．９９， ｐ１−１１， ２００５Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．５２， ｐ２２５１−２２５５， ２００２Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３４， ｐ４１９−４２３，２０１１ 本発明は、し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用な新規微生物の提供を課題とする。 本発明者らは、新規微生物を見出し、これを単離、同定することにより、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は以下の通りのものである。〔１〕フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種であり、次の１）〜１０）の特性を有するフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。１）グラム染色が陰性の桿菌であり、胞子を形成する２）オキシダーゼテストは陰性、カタラーゼテストは陽性で好気性である３）１％の糖および２％のＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）に、該糖としてＤ−ガラクトースまたはシュークロースを加えた場合には酸生成を行わないが、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、グリセリンまたはＮ−アセチルグルコサミンを加えた場合には酸生成を行う４）至適生育温度は４５℃〜５５℃であり、３５℃以下または６５℃以上では増殖が確認されない５）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．７以下またはｐＨ１０．０以上では増殖が確認されない６）ＣＹＣ培地にＮａＣｌを終濃度７％まで添加しても増殖が確認される７）主要なメナキノンはＭＫ７である８）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む９）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は５１．２％〜５２．４％である１０）最も主要な菌体脂肪酸はｉｓｏ−Ｃ１６：０である〔２〕配列番号１、または配列番号８〜配列番号１９のいずれかに示す塩基配列に対して９８．７％以上の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する、上記〔１〕に記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔３〕ＹＭ１７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７６４）、ＹＭ１７−２株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４８）、ＹＭ１７−３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４９）、ＹＭ１７−４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５０）またはＹＭ１７−５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９２５）とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション相同値が７０％以上である、上記〔１〕または〔２〕に記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔４〕さらに、菌体脂肪酸として、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０のいずれか一種以上を含む、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔５〕菌体脂肪酸としてｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０を含むフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔６〕菌体脂肪酸としてｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０を含むフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔７〕有機廃棄物の処理に使用する、上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔８〕有機廃棄物がし尿、有機性汚泥、食品残渣物、又は動物糞尿である、上記〔７〕に記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔９〕ＹＭ１７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７６４）、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、ＹＭ１７−２株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４８）、ＹＭ１７−３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４９）、ＹＭ１７−４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５０）、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、ＹＭ１７−５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９２５）、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株またはＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株のいずれかである、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を使用する、有機廃棄物の処理方法。〔１１〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を使用する、タンパク質の分解方法。 本発明によって得られた新規微生物は、新属フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種である。この新規微生物はし尿、汚泥等の有機廃棄物の処理、タンパク質の分解等に有用であり、また、様々な用途に使用し得る。ＹＭ１７株の細胞写真を示した図である（実施例１）。近隣結合法により作成された系統樹を示した図である（実施例１）。ＹＭ１７株と分離した１２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子による系統樹を示した図である（実施例２）。堆肥培養中の菌の状態を示した図である（実施例２）。ゼラチンザイモグラフィーの結果を示した図である（実施例２）。 本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）とは、次の１）〜１０）の特性を有する新属フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種のことをいう。１）グラム染色が陰性であり、胞子を形成する２）オキシダーゼテストは陰性、カタラーゼテストは陽性で好気性である３）１％の糖および２．０％のＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）に、該糖としてＤ−ガラクトースまたはシュークロースを加えた場合には酸生成を行わないが、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、グリセリンまたはＮ−アセチルグルコサミンを加えた場合には酸生成を行う４）至適生育温度は４５℃〜５５℃であり、３５℃以下または６５℃以上では増殖が確認されない５）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．７以下またはｐＨ１０．０以上では増殖が確認されない６）ＣＹＣ培地にＮａＣｌを終濃度７％まで添加しても増殖が確認される７）主要なメナキノンはＭＫ７である８）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む９）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は５１．２％〜５２．４％である１０）最も主要な菌体脂肪酸はｉｓｏ−Ｃ１６：０である この「主要なメナキノン」としてＭＫ７を８１．８％以上含むものが挙げられる。 また、「主要な菌体脂肪酸」として、ｉｓｏ−Ｃ１６：０を３４．１％以上４２．６％以下含むものが挙げられる。 さらに「菌体脂肪酸」として、ｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０のいずれか一種以上を含むものであっても良い。本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）はこれらの脂肪酸を合計して８６．１％以上含むものであることが好ましい。 さらに、本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）は、配列番号１、または配列番号８〜１９のいずれかに示す塩基配列に対して９８．７％以上の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するものであることが好ましい。 さらに、本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）はＹＭ１７株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株またはＹＭ１７−５株とＤＮＡ−ＤＮＡハイブリゼーションの相同値が７０％であることが好ましい。 このような本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）として、上記１）〜１０）の性質を有し、さらに、菌体脂肪酸としてｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０を含むフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）が挙げられる。 このようなフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）として、ＹＭ１７株、ＹＭ１７−５株等が挙げられる。 また、本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）として、上記１）〜１０）の性質を有し、さらに、菌体脂肪酸としてｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０を含む、フラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）も挙げられる。 このようなフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）として、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株およびＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株等が挙げられる。 本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）として挙げられるＹＭ１７株は、上記の特性を有するとともに、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が配列表配列番号１に記載の塩基配列と１００％同一である。 本菌株は本出願人の申請により、独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７６４（４）識別のための表示：ＹＭ１７（５）原寄託日：２０１３年１１月２９日 また、同様に本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）として挙げられるＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株およびＹＭ１７−５株についても、本出願人の申請により、独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託されている。これらの寄託を特定する内容は実施例等に示した。 本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）には、このフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）に該当する菌株の変異株も含まれる。また、フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）のうち、フラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）やフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）の変異株も含まれる。 本発明におけるこの変異株とは化学的変異導入、自然突然変異、形態変異、トランスフェクション等の遺伝子工学的手法により、その物理的特性や化学的特性が改変されたものであり、上記１）〜１０）の全ての特性を有するもののことをいう。 本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）は、有機性汚泥、食品残渣物、又は動物糞尿等の有機廃棄物の処理に使用することができる。これらの有機廃棄物に、フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を加えることにより、堆肥等を製造することも可能である。 本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を使用する有機廃棄物の処理方法では、有機廃棄物にフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を加えるのみならず、有機廃棄物の処理において有用なその他の工程を含んでいても良い。 さらに、本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）は、タンパク質の分解に使用することができる。 本発明のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を使用するタンパク質の分解方法では、タンパク質やタンパク質を含む分解対象にフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を加えるのみならず、タンパク質の分解において有用なその他の工程を含んでいても良い。 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。〔実施例１〕フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）の単離・同定１．菌株の単離 鹿児島県曽於市の堆肥化場の堆肥からＹＭ１７株を単離した。 即ち、５０μｇ／ｍＬ Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎ を含む４ｍＬの１／２Ｎｕｔｒｉｅｎｔ培地（ペプトン：０．２５％、塩化ナトリウム：０．２５％、酵母エキス：０．１％、肉エキス：０．０５％、ｐＨ７．４）に該堆肥４００ｍｇを加え、５５℃で２日間培養した後、この液体培養液を５０μｇ／ｍＬ Ｎｏｖｏｂｉｏｃｉｎを含む１／２Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天培地に塗布して４日間培養しＹＭ１７株のコロニーを単離した。２．分類学的性質Ａ．試験方法 菌株の分類学的性質は「新生化学実験講座第１７巻微生物実験法（東京化学同人発行）」、「改訂版微生物の分類と同定＜下＞（学会出版センター発行）」、「微生物の分類・同定実験法（シュプリンガー・ジャパン発行）」、ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ Ｓｙｅｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに記載の方法に従って分析した。単離菌株の分類と同定はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌に記載されている種との比較により行った。 この解析により得られた形態的性質、培養的性質、生理学的性質、生育範囲、及び化学分類学的性質を表２−１、表２−５に示した。また、ＹＭ１７株を５５℃で培養した細胞写真を図１に示した。図１において、ＹＭ１７株は桿菌であり、細胞の末端に胞子を形成することが確認できた。図１のバーは１０μｍを表す。なお、表２（表２−１〜表２−５）には、実施例２において分離した１２菌株の分類学的性質も合わせて示した。Ｂ．試験培地 各培地のｐＨは表２−１中に記載したとおりである。リトマスミルクを除く各培地は１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌をした。リトマスミルクは１１０℃で１０分間オートクレーブ滅菌をした。クリステンセン尿素培地の尿素、ＯＦテスト培地の糖、糖からの酸生成を調べた糖類はフィルター滅菌を行い、記載した終濃度になるように各培地に加えた。なお、糖からの酸生成は１％の糖と２％のＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）を用いて調べた。（１）ＣＹＣ寒天培地（スクロース：３％、カザミノ酸：０．６％、硝酸ナトリウム：０．３％、酵母エキス：０．２％、リン酸水素二カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０５％、硫酸鉄七水和物：０．００１％、寒天：１．５％）（２）ＣＹＣ液体培地（スクロース：３％、カザミノ酸：０．６％、硝酸ナトリウム：０．３％、酵母エキス：０．２％、リン酸水素二カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０５％、硫酸鉄七水和物：０．００１％）（３）肉汁寒天培地（肉エキス：１％、ペプトン：１％、塩化ナトリウム：０．５％、寒天：１．５％）（４）肉汁液体培地（肉エキス：１％、ペプトン：１％、塩化ナトリウム：０．５％）（５）リトマスミルク（スキムミルク：１０％、１％リトマス液：数滴）（６）ＶＰ培地（酵母エキス：０．１％、トリプトン：０．７％、ソイトン：０．５％、グルコース：１％、塩化ナトリウム：０．５％、寒天：０．３％）（７）ＳＩＭ培地（肉エキス：０．３％、ペプトン：３％、チオ硫酸ナトリウム：０．００５％、塩酸システイン：０．０２％、クエン酸鉄アンモニウム：０．０５ｇ、寒天：０．５％）（８）ＬＢ寒天培地（トリプトン：１％、塩化ナトリウム：０．５％、酵母エキス：０．５％、寒天：１．５％）（９）ＳＹ寒天培地（硫酸アンモニウム：０．２％、リン酸水素二ナトリウム：０．１４％、リン酸二水素カリウム：０．０７％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０２％、硫酸鉄七水和物：０．０００５％、硫酸マンガン五水和物：０．０００５％、グルコース：１％）（１０）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天培地（肉エキス：０．３％、ペプトン：０．５％、寒天：１．５％）（１１）Ｓｉｍｍｏｎｓ培地（リン酸二水素アンモニウム：０．１％、リン酸水素二カリウム：０．１％、塩化ナトリウム：０．５％、クエン酸ナトリウム：０．２％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０２％、寒天：１．５％、ＢＴＢ：０．００８％）（１２）Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地（酵母エキス：０．０５％、システイン塩酸塩：０．０１％、塩化ナトリウム：０．５％、クエン酸ナトリウム：０．３％、グルコース：０．０２％、リン酸二水素カリウム：０．１％、寒天：１．５％、フェノールレッド：０．００１２％）（１３）硝酸塩培地（グルコース：１．０％、リン酸二水素カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０２％、硝酸ナトリウム：０．１％）（１４）アンモニウム塩培地（グルコース：１．０％、リン酸二水素カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０２％、硫酸アンモニウム：０．０７８％）（１５）クリステンセン尿素培地（ペプトン：０．１％、塩化ナトリウム：０．５％、グルコース：０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．２％、フェノールレッド：０．０００８％、寒天：１．５％、尿素：２％）（１６）ＯＦテスト培地（ペプトン：０．２％、塩化ナトリウム：０．５％、リン酸水素二カリウム：０．０３％、寒天：０．２％、ＢＴＢ：０．００８％、糖：１％）Ｃ．脂肪酸の分析１）試料調整とガスクロマトグラフィーによる分析 ５Ｌの三角フラスコに３ＬのＣＹＣ液体培地を入れた本培養培地に、種培養した菌を植菌し、５２℃で対数増殖期後期から定常期初期まで培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体は生理食塩水にて２回洗浄した。約５００ｍｇ〜７００ｍｇの湿菌体をスクリューキャップ付遠心管に入れた。１ｍＬのアルカリけん化液を加え、密栓し１００℃で５分間保った。５分後、１０秒間よく振り、さらに１００℃で３０分間保った。遠心管を冷却した後、２ｍＬの塩酸メタノール試薬を加え、密栓し、８０℃で１０分間保った。遠心管を冷却した後、１．２５ｍＬの抽出用溶媒を加え、１０分間ゆっくり撹拌した。遠心管を１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上層を別のスクリューキャップ付遠心管に移し、３ｍＬの洗浄液を加えた。再び密栓して５分間撹拌した。この遠心管を１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、溶媒層をガラスアンプルに取り、窒素ガスで乾燥させた。各試薬の組成は下記に示した。得られた乾燥試料を脂肪酸分析試料として、株式会社テクノスルガ・ラボでガスクロマトグラフィーにより分析した。得られた結果を表１に示した。２）試薬（１）アルカリけん化液（水酸化ナトリウム：７．５ｇ、メタノール：２５ｍＬ、超純水：２５ｍＬ）（２）塩酸メタノール試薬（６Ｎ塩酸：２１．７ｍＬ、メタノール：１８．３ｍＬ）（３）抽出用溶媒（ヘキサン：１０ｍＬ、ｔ−ブチルメチルエーテル：１０ｍＬ）（４）洗浄液（水酸化ナトリウム：０．５８６ｇ、超純水：４８．８ｍＬ）Ｄ．細胞壁ペプチドグリカン１）試料調整 約２ｇの湿菌体を６ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、超音波破砕機（ＴＡＩＴＥＣ社製ＶＰ−３０Ｓ）により３０分間処理して細胞を破砕した。破砕液を温度４℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心をして、上清を回収した。上清を温度４℃にて９０００ｒｐｍで６０分間遠心をして、上清を取り除き、沈殿物を新しい遠心管に移した。沈殿物に６ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて洗浄した後、温度４℃にて９０００ｒｐｍで６０分間遠心をして、上清を取り除いた。沈殿物に２ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と４００μＬの２５％ＳＤＳを加え、１００℃で４０分間保った。６５℃に温めておいた１０ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）をさらに加え、撹拌した後、温度３０℃にて９０００ｒｐｍで６０分間遠心した。 上清を取り除き、沈殿物に６５℃に温めておいた５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて洗浄した後、温度３０℃にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして上清を取り除いた。この洗浄作業を２回行った。洗浄後、沈殿物に２ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）と１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ Ｐｒｏｎａｓｅ液を加え、３７℃で２時間保った。このＰｒｏｎａｓｅ反応後の液に５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を加え、細胞壁成分を洗浄した後、温度４℃にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして上清を取り除いた。この洗浄作業を２回行った。 洗浄後の沈殿物に２ｍＬの５％トリクロロ酢酸水溶液を加え、１００℃で２０分間保った。この懸濁液をガラス製のスクリューキャップ付遠心管に移し、５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて洗浄した後、室温にて１０００ｒｐｍで１分間遠心をして、上清を取り除いた。この洗浄作業を２回行った。洗浄後の沈殿物に３ｍＬのエタノールを加え、室温にて１０００ｒｐｍで１分間遠心をして、上清を取り除いた。沈殿物に３ｍＬのジエチルエーテルを加え、室温にて１０００ｒｐｍで１分間遠心をして、上清を取り除き、沈殿物を乾燥させて細胞壁試料とした。２）ＴＬＣによる分析 ５ｍｇの細胞壁試料に２５０μＬの４Ｎ塩酸を加え、１００℃で１６時間加水分解反応を行った。加水分解反応後、水酸化カリウムを置いたデシケーター内で塩酸を取り除き、得られた処理液をＴＬＣに供試した。 ＴＬＣプレートはＭｅｒｃｋ社製ＴＬＣセルロースプレートＮｏ．１．０５７１６．０００１を用いた。構成アミノ酸の検出では一次元目をイソプロパノール：酢酸：超純水＝７５：１０：１５の展開溶媒で展開し、二次元目をメタノール：ピリジン：１０Ｎ塩酸：超純水＝６４：８：２：１４で展開した。展開後ＴＬＣプレートにニンヒドリン試薬をスプレーし、細胞壁ペプチドグリカンに含まれるアミノ酸を検出した。また、ジアミノピメリン酸の異性型の検出は同じＴＬＣプレートを用いて、メタノール：ピリジン：１０Ｎ塩酸：超純水＝６４：８：２：１４で展開し、標準品との移動度の比較により特定した。その結果、細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含むことが確認された。Ｅ．メナキノン１）試料調整 約５００ｍｇの乾燥菌体に２０ｍＬのクロロホルム：メタノール＝２：１液を加え、冷暗所で一晩、緩やかに撹拌した。この懸濁液を濾過し、濾液を湯浴温度３０℃のロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。乾固物を３ｍＬのアセトンに溶かし、窒素ガスで約２００μＬに濃縮した。Ｍｅｒｃｋ社製ＨＰＴＬＣシリカゲル６０ Ｆ２５４プレートＮｏ．１．０５６２８．０００１にこの濃縮液を供試し、トルエンを展開溶媒として展開した。展開後にＴＬＣプレートを乾燥して、メナキノンのバンドをＵＶランプ（２５４ｎｍ）の下で確認し、その部分のシリカゲルをスパーテルでかき取り、試験管に入れた。かき取ったシリカゲルに４ｍＬのアセトンを加えて緩やかに撹拌し、フィルター濾過してシリカゲル粒子を除去した。得られた上清を窒素ガスによって約２００μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣの試料とした。２）ＨＰＬＣによる分析 試料２５μＬをＨＰＬＣに注入した。カラムはＯＤＳカラム（ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製 ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０ Ｓ−５）を用い、展開溶媒にはメタノール：イソプロパノール＝２：１液を用いた。移動速度１．５ｍＬ／分、カラム温度４０℃で展開し、ＵＶ（２７０ｎｍ）で検出した。ＨＰＬＣの機械はＨＥＷＬＥＴＴ ＰＡＣＫＡＲＴ社製ＳＥＲＩＥＳ １１００を用いた。この分析を複数回行ったところ、ＭＫ７の含有量が１回目は８３．９％であり、２回目は８５．２％であったことから、主要なメナキノンがＭＫ７であることが確認された。Ｆ．ＧＣ含量１）ＤＮＡ調整 ゲノムＤＮＡの抽出は参考文献１の方法に従って行った。 即ち、０．９ｇ〜１．６ｇの湿菌体をＳａｌｉｎｅ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で洗浄後、５ｍＬの同溶液に懸濁した。卵白リゾチームを終濃度１ｍｇ／ｍＬで添加して３５℃にて溶菌させた後、溶菌液を凍結させた。凍結品に等量のＴｒｉｓ−ＳＤＳ（ｐＨ ９．０）を加え、６０℃の湯浴で融解し、１０分間保った。その後、氷冷し、等量の水飽和フェノールを加えて１０分間振盪した。遠心して上清を回収し、２倍量のエタノールを加えて繊維状のＤＮＡをガラス棒で巻き取った。巻き取ったＤＮＡを７０％、９０％、９９．５％のエタノールで段階的に洗浄し、フェノールを除去した。ＤＮＡを乾燥後、適量の０．１ＸＳＳＣ溶液で溶解し、ＲＮａｓｅを加えて３５℃で３０分以上反応させ、ＲＮＡを除去した。氷冷後、１／５量の水飽和フェノールを加えて、同様に振盪、遠心、エタノール沈殿、フェノール除去、０．１ＸＳＳＣ溶液で溶解、ＲＮａｓｅ処理を行った。 ＲＮａｓｅ処理後のＤＮＡをフェノール処理し、遠心してＤＮＡ溶解画分を分取し、ＤＮＡ溶解画分に１／１０量のＡｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡと０．６倍量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを再度巻き取った。巻き取ったＤＮＡを７０％、９０％、９９．５％のエタノールで洗浄し、乾燥後、ＤＮＡ濃度が５００μｇ／ｍＬ以上となるように０．１ＸＳＳＣ溶液で溶解した。ＤＮＡの純度が低い場合には、フェノールによるタンパク質の除去とＲＮａｓｅ処理を繰り返した。参考文献１：Ｓａｉｔｏ，Ｈ．＆Ｍｉｕｒａ，Ｋ．１９６３．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｐｈｅｎｏｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２：６１９−６２９．２）試薬（１）Ｓａｌｉｎｅ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ＮａＣｌ：８．７７ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ：３７．２２ｇ、ｐＨ：８．０、超純水：総液量が１０００ｍＬとなるように加えた）（２）Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ（Ｔｒｉｓ：１２．１ｇ、ＳＤＳ：２０．０ｇ、ｐＨ９．０、超純水：総液量が１０００ｍＬとなるように加えた）（３）２０ＸＳＳＣ（ＮａＣｌ：１７５ｇ、Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：７７．４ｇ、超純水：総液量が１０００ｍＬとなるように加えた。０．１ＸＳＳＣと１ＸＳＳＣは２０ＸＳＳＣを超純水で希釈して作成した）（４）Ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（Ａ液：ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２Ｏ：８１．６５ｇ／超純水２００ｍＬ、Ｂ液：ＣＨ３ＣＯＯＨ：３６．０３ｇ／超純水２００ｍＬ。Ａ液とＢ液を混合してｐＨ７．０に調整した。ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ：７４．４５ｍｇ／調整液２００ｍＬとしてＡｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡとした）３）ＧＣ含量の測定 ＧＣ含量の測定はＤＮＡ ＧＣ ｋｉｔ（ヤマサ醤油株式会社社製）を用いた。７μｇ相当量のＤＮＡを２０μＬの０．１ＸＳＳＣに溶解し、１００℃で１０分間熱変成させ、すぐに氷冷した。氷冷後、２０μＬの４Ｕ／ｍＬヌクレアーゼＰ１溶液を加え、５０℃で１時間反応させた。ヌクレアーゼＰ１処理後、２０μＬの２．４Ｕ／ｍＬアルカリフォスファターゼ溶液を加え、３７℃で１時間反応させたものをＨＰＬＣに供試した。 ＨＰＬＣのカラムはＯＤＳカラム（ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製 ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０ Ｓ−５）を用い、展開溶媒には０．０２Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４：アセトニトリル＝２０：１液を用いた。移動速度１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃で展開し、ＵＶ（２７０ｎｍ）で検出した。ＤＮＡ ＧＣ ｋｉｔに付属のスタンダードを基準としてＹＭ１７株のＧＣ含量を計算したところ、ＧＣ含量は５１．４％であった。Ｇ．１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析１）ＰＣＲ反応 ＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をコロニーダイレクトＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応にはＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）とＥＵ１０Ｆプライマー（配列表配列番号２）、ＥＵ１５００Ｒプライマー（配列表配列番号３）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成はＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの説明書に記載されている混合割合に従った。ＰＣＲ反応は９４℃で１分の熱処理を１サイクル行った後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で１分３０秒の反応を３０サイクル行った。２）シークエンス反応 得られたＰＣＲ反応物はＷｉｚａｒｄ（登録商標） ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により精製した。精製産物とＥＵ１０Ｆプライマー、ＥＵ５２０Ｆプライマー（配列表配列番号４）、ＥＵ９０７Ｒプライマー（配列表配列番号５）、又はＥＵ１５００Ｒプライマーを用いてシークエンス反応を行い、単離菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。 ＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表配列番号１に示した。 ＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列について、遺伝子データベースであるＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ のＢＬＡＳＴホモロジー検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を行った結果、ＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と最も高い相同性を示す種はメカカリマイセス アスポロフォリゲネンス（Ｍｅｃｈｅｒｃｈａｒｉｍｙｃｅｓ ａｓｐｏｒｏｐｈｏｒｉｇｅｎｅｎｓ）であり、相同性は９１％であった。 続いてＹＭ１７株に近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＴｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースより収集し、系統解析を行った。 収集した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｘ ２．０．１２プログラムによりアライメントし、近隣結合法により系統樹を作成した。得られた系統樹を図２に示した。括弧内の数字はＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を示し、ＹＭ１６は本発明と同様の方法で本発明者らが単離した菌株を示す。Ｈ．ＹＭ１７株の同定と分類１）ＹＭ１７株 図２の系統解析に示すようにＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子はバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）やアリシクロバチラジー科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、サーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）とは大きく分かれる枝分かれを形成する。 ＹＭ１７株が示す桿菌の形態や細胞内で芽胞形成する形態はバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）やアリシクロバチラジー科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）で見られる性質であり、糸状性の菌糸を形成するサーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）とは明らかに異なる。 ＹＭ１７株とバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、及びアリシクロバチラジー科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）に属する種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性を比較した。結果を表３に示す。全ての属で相同性は８９％以下となり、ＹＭ１７株はバチラジー科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）、及びアリシクロバチラジー科（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科）に属する種とは分類学的に大きく異なる。図２の系統樹においてＹＭ１７株と分岐が近いアリシクロバチラス アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、カルディテリコラ サツメンシス（Ｃａｌｄｉｔｅｒｒｉｃｏｌａ ｓａｔｓｕｍｅｎｓｉｓ）、カルダルカリバチラス サーマラム（Ｃａｌｄａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）、カルディバチラス デビリス（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）とＹＭ１７株との分類学的性質の比較を行った。結果を表４に示す。 表４のうちＹＭ１７株以外のデータはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００２），５２，１６８１−１６８５、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９７１），６７，９−１５、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （２０１１），６１，６３１−６３６、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００６），５６，１２１７−１２２１、及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （２００４），５４，２１９７−２２０１から得た。 アリシクロバチラス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）は主要な脂肪酸にω−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｃ１７：０、ω−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｃ１９：０を有することが属の特徴的な性質であり、ＹＭ１７株と異なる。 カルディテリコラ属（Ｃａｌｄｉｔｅｒｒｉｃｏｌａ属）は７５℃以上で生育できる高度好熱性細菌でありＹＭ１７株と異なる。 カルダルカリバチラス属（Ｃａｌｄａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）はグラム染色が陽性であること、ＤＮＡの塩基組成が４５％であることがＹＭ１７株と異なる。 カルディバチラス属（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）は６５℃以上でも生育し、グルコースからの酸生成が見られないため、ＹＭ１７株と異なる。 以上よりＹＭ１７株は新科（フラテリバチラジー科）、新属（フラテリバチラス属）の新種と判定し、ＹＭ１７株をフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）（以下、単にフラテリバチラス フラボアルバスと示す場合がある）と命名した。〔実施例２〕フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）種の分離 上記の実施例１により、フラテリバチラス フラボアルバス種は既知の科・属・種と異なることが示された。そこで、フラテリバチラス フラボアルバス種の特性を明確にするため、ＹＭ１７株以外のフラテリバチラス フラボアルバス種に属する菌株の分離を行った。１．フラテリバチラス フラボアルバス種の分離 鹿児島県曽於市の堆肥化場および鹿児島市の堆肥化場の堆肥を分離源としてフラテリバチラス フラボアルバス種の菌株の分離を試みた。 上記の実施例１におけるＹＭ１７株の培養性状を参考にして、ＣＹＣ寒天培地に７％または１０％の塩化ナトリウムと５０μｇ／ｍＬアンピシリンを添加または無添加したものを分離培地とし、５５℃の培養温度で６日間培養して菌の分離を行ったところ、糸状性細菌の多数のコロニーと桿菌状の細菌のコロニーが分離培地上に現れた。 この中から桿菌状の細菌のコロニーを分離して、次の２．に示したフラテリバチラス フラボアルバス種を検出するための特異的ＰＣＲによって判定を行ったところ、表５に示すように、合計１２菌株がフラテリバチラス フラボアルバス種と判定された。 特にＣＹＣ寒天培地に７％塩化ナトリウムと５０μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した培地での分離頻度が高く、この培地を用いて５５℃で培養することによりフラテリバチラス フラボアルバス種を効率的に分離することが可能であった。 分離した１２菌株について、それぞれＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株またはＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株とした。 このうち、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株およびＹＭ１７−５株については、本出願人の申請により、独立行政法人 製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターにブタペスト条約に基づく国際寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。ＹＭ１７−２株（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４８（４）識別のための表示：ＹＭ１７−２（５）原寄託日：２０１４年１０月６日ＹＭ１７−３株（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４９（４）識別のための表示：ＹＭ１７−３（５）原寄託日：２０１４年１０月６日ＹＭ１７−４株（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０ （３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５０（４）識別のための表示：ＹＭ１７−４（５）原寄託日：２０１４年１０月６日ＹＭ１７−５株（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１２９２５（４）識別のための表示：ＹＭ１７−５（５）原寄託日：２０１４年８月２８日２．フラテリバチラス フラボアルバス種を検出するための特異的ＰＣＲ フラテリバチラス フラボアルバス種を検出するための特異的ＰＣＲを次のように行った。まず、ＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列を用いて、ＴＩＰ１５５Ｆ１プライマー（５‘−ＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴ−３’）（配列表配列番号６）とＴＩＰ１５５Ｒ１プライマー（５‘−ＴＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＣＧＣＴＡＡＧＡ−３’）（配列表配列番号７）を作成した。 ＰＣＲ反応にはＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ（登録商標） ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＴＩＰ１５５Ｆ１プライマー、ＴＩＰ１５５Ｒ１プライマーおよび分離菌株のＤＮＡを用いた。ＰＣＲ反応液の組成はＴｋｓ Ｇｆｌｅｘ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの説明書に記載されている混合割合に従った。ＰＣＲ反応は９４℃で１分の熱処理を１サイクル行った後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で１分の反応を２５サイクル行い、電気泳動で３２８ｂｐ付近に増幅産物が確認された菌株をフラテリバチラス フラボアルバス種と判定した。３．分離菌株の分類学的解析 上記１．および２．によって分離した１２菌株の分類学的性質をＹＭ１７株についての実施例１と同様の方法で調べ、結果を表２−１〜表２−５に示した。４．分離離菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析 上記１．および２．によって分離した１２菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をＹＭ１７株についての実施例１と同様の方法で調べた。各株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は配列表配列番号８〜１９にそれぞれ示した。配列番号８はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、配列番号９はＹＭ１７−２株、配列番号１０はＹＭ１７−３株、配列番号１１はＹＭ１７−４株、配列番号１２はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、配列番号１３はＹＭ１７−５株、配列番号１４はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、配列番号１５はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、配列番号１６はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、配列番号１７はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、配列番号１８はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株、配列番号１９はＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株に対応する。 ＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子とこれらの１２菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の相同性を表６に示した。表６に示されるように、分離した１２菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はＹＭ１７株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列と９８．７％以上の相同性があった。５．ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション 上記１．および２．によって分離した１２菌株とＹＭ１７株のゲノムＤＮＡを用いてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験を行った。また、ネガティブコントロールとして近縁属であるＣａｌｄｉｔｅｒｒｉｃｏｌａ ｓａｔｓｕｍｅｎｓｉｓＹＭＯ８１株のＤＮＡを用いた。ＤＮＡの調整は〔実施例１〕のＧＣ含量測定で調整した方法と同じ方法により行った。 得られたゲノムＤＮＡはいずれも濃度が５００μｇ／ｍＬ以上、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０値が１．８以上、ＯＤ２６０／ＯＤ２３０値が２．０以上でＲＮＡの混入はなく、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験に用いることができる高い品質であった。 ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験は参考文献２と微生物の分類・同定実験法（シュプリンガー・ジャパン発行））に記載の方法に従った。 まず、ＤＮＡプレートの作成を行った。ゲノムＤＮＡ溶液を０．１ＸＳＳＣで希釈し、１００μｇ／ｍＬとした。希釈したＤＮＡ溶液を１００℃で５分間加熱して一本鎖とした後、すぐに氷冷した。熱変成したＤＮＡ溶液をＰＢＳ−Ｍｇ溶液で１０倍希釈し、１０μｇ／ｍＬとした。１０μｇ／ｍＬとしたＤＮＡ溶液を１００μＬずつマイクロプレートのウェルに分注し、マイクロプレートにシールをして３０℃で３時間以上静置した。その後、ウェル内のＤＮＡ溶液を捨てて、試験用のＤＮＡプレートとした。バックグランドコントロールにはＳａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡを用いた。 ＤＮＡプレートの準備と並行して、ＤＮＡのフォトビオチン標識を行った。５００μｇ／ｍＬのＤＮＡ溶液を３０μＬ調整し、超音波洗浄機で１０分間処理してＤＮＡを切断した。切断したＤＮＡ溶液に２５μＬの１ｍｇ／ｍＬフォトビオチン液を加え、ＤＮＡを完全に溶解した後、氷冷しながら２５０Ｗの低圧水銀ランプで３０分間照射し、ＤＮＡをフォトビオチン標識した。余分なフォトビオチンを取り除くため、照射後のＤＮＡ溶液に５４０μＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）を加えた後、６００μＬの２−ブタノールを加えて混合した。１５，０００ｒｐｍで５秒間遠心し、過剰なフォトビオチンが含まれる上清を捨てた。２−ブタノールを加えて過剰なフォトビオチンを取り除く作業は合計２度行った。フォトビオチン標識したＤＮＡ溶液を１００℃で５分間加熱した後、直ちに氷冷し、ハイブリダイゼーションに用いた。 次にハイブリダイゼーション操作を行った。ＤＮＡプレートの各ウェルに２００μＬのＰｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｉｘｔｕｒｅを分注し、３７℃で１５分間静置した。熱変成させた３００μＬのフォトビオチン標識ＤＮＡ溶液を６ｍＬのＨｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅと混合した。ＤＮＡプレートの各ウェルからＰｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｉｘｔｕｒｅを除き、フォトビオチン標識ＤＮＡを含むＨｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを１００μＬずつ分注して、ＤＮＡプレートをシールした。このＤＮＡプレートを４６℃で２時間以上静置し、ハイブリダイゼーション処理を行った。ハイブリダイゼーション処理後、フォトビオチン標識ＤＮＡを含むＨｙｂｒｉｄａｚａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを捨て、３００μＬの１ＸＳＳＣ溶液で各ウェルを洗浄する作業を合計３度行った。 洗浄後の各ウェルに１００μＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｅｎｚｙｍｅ溶液を分注した。３７℃で３０分間静置した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｅｎｚｙｍｅ溶液を捨てた。１００μＬの１ＸＳＳＣ溶液で各ウェル洗浄した後、さらに３００μＬの１ＸＳＳＣ溶液で各ウェルを合計３回洗浄した。洗浄後の各ウェルに１００μＬの蛍光基質溶液を加え、マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定した（励起波長３６０ｎｍ，測定波長４５０ｎｍ）。３７℃で保温し、１分毎に蛍光強度を測定した。ＤＮＡの各組み合わせの蛍光強度は６ウェルの反復の中から中央値４ウェルの平均値を算出し、Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡを張り付けたウェルの平均蛍光強度値をバックグラウンド値として差し引いて算出した。相同値は同じ菌株のＤＮＡをウェルおよび標識に用いたホモの数値に対する百分率で表示した。参考文献２：Ｅｚａｋｉ，Ｔ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ． ＆Ｙａｂｕｕｃｈｉ，Ｅ．，１９８９．Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ ｗｅｌｌｓ ａｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ ａｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ ａｍｏｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．３９：ｐ２２４−２２９試薬（１）ＰＢＳ−Ｍｇ溶液（ＭｇＣｌ２：０．９５ｇ／ＰＢＳ１００ｍＬ）（２）０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ：１２．１ｇ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ：０．４ｇ、ｐＨ９．０、超純水：総液量が１０００ｍＬとなるように加えた）（３）Ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｉｘｔｕｒｅ（２０ＸＳＳＣ：１ｍＬ、５０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ液：１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ 変性Ｓａｌｍｏｎ ＤＮＡ：０．１ｍＬ、ホルムアミド：５ｍＬ、超純水：２．９ｍＬ）（４）Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｉｘｔｕｒｅ（２０ＸＳＳＣ：１ｍＬ、５０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ液：１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ 変性Ｓａｌｍｏｎ ＤＮＡ：０．１ｍＬ、ホルムアミド：５ｍＬ、硫酸デキストラン：０．２５ｇ、超純水：２．８ｍＬ）（５）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｅｎｚｙｍｅ溶液（Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：１０μＬ、０．５％ウシ血清アルブミン（ｆｌａｃｔｉｏｎ Ｖ）／ＰＢＳ溶液：１０ｍＬ）（６）蛍光基質溶液（１０ｍｇ／ｍＬ ４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ溶液：１００μＬ、ＰＢＳ＋１ｍｍｏｌＭｇＣｌ２溶液：１０ｍＬ） ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション試験の結果を表７に示した。 表７に示されるように、ＹＭ−１７株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株およびＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株の相互のＤＮＡ−ＤＮＡ相同値は全て７０％以上であった。 参考文献３に示されるように、微生物分類学においてＤＮＡ−ＤＮＡ相同値が７０％以上であれば同種と考えられていることから、これらの８株が同種であることが確認された。参考文献３：Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｅ．＆Ｅｂｅｒｓ，Ｊ．，２００６．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｏｄａｙ Ｎｏｖ．：ｐ１５２−１５５６．フラテリバチラス フラボアルバスの性質 上記の各解析、試験により、フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）は次の１）〜１０）の特徴を性質として有する種であることが確認された。１）グラム染色が陰性であり、胞子を形成する２）オキシダーゼテストは陰性、カタラーゼテストは陽性で好気性である３）１％の糖および２．０％のＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）に、該糖としてＤ−ガラクトースまたはシュークロースを加えた場合には酸生成を行わないが、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、グリセリンまたはＮ−アセチルグルコサミンを加えた場合には酸生成を行う４）至適生育温度は４５℃〜５５℃であり、３５℃以下または６５℃以上では増殖が確認されない５）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．７以下またはｐＨ１０．０以上では増殖が確認されない６）ＣＹＣ培地にＮａＣｌを終濃度７％まで添加しても増殖が確認される７）主要なメナキノンはＭＫ７である８）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む９）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は５１．２％〜５２．４％である１０）最も主要な菌体脂肪酸はｉｓｏ Ｃ１６：０である７．フラテリバチラス フラボアルバス種内の亜種分類 ＹＭ１７株と分離した１２株（ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株およびＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子による系統樹を図３に示した。図３に示されるようにＹＭ１７株とＹＭ１７−５株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は他の菌株と分岐した。 また、表８に示したようにＹＭ１７株とＹＭ１７−５株の主要な菌体脂肪酸上位４種がｉｓｏ−Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０であるのに対して、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株およびＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株はｉｓｏ−Ｃ１６：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０であり異なっていた。このため、ＹＭ１７株・ＹＭ１７−５株とその他の菌株はフラテリバチラス フラボアルバスで同種であるが、異なる亜種であった。 以上の結果より、ＹＭ１７株とＹＭ１７−５株の２株をフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）と命名し、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株およびＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株の１１株をフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）と命名した。 即ち、フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）はフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）と、フラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）の２亜種からなる新属・新種であった。８．フラテリバチラス フラボアルバスのタンパク質分解活性 次にフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）のタンパク質分解活性を調べた。基本培地（塩化ナトリウム：２．０％、酵母エキス：０．１％）に２．０％のゼラチンまたは０．４％のカゼインを加えてｐＨを８．０に調整した後、１．５％の寒天を加えて、１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌をし、試験培地とした。 試験培地にＹＭ１７株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿０４株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿１９株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿２８株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３０株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３４株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株またはＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株を塗布し、５５℃で７日間培養した。培養後、試験培地に塩酸―塩化第二水銀溶液（塩化第二水銀１５ｇ、濃塩酸２０ｍＬ、蒸留水１００ｍＬ）を滴下し、ハロ形成によって、タンパク質の分解活性を調べた。試験の結果、１３菌株全てで、ゼラチンおよびカゼインの分解活性が見られた。９．フラテリバチラス フラボアルバスの堆肥環境での生育と有機物分解活性 フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）の堆肥中での生育と有機物分解活性を調べた。 １２０℃、３０分間のオートクレーブ滅菌を２度した１０ｇ堆肥に対して、フィルター濾過滅菌した１０％酵母エキス溶液１ｍＬ、１％カゼイン溶液または滅菌水３ｍＬ、２％ＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）を用いて５５℃で１日間培養した菌の培養液１ｍＬを添加し、水分が堆肥に全体に行きわたるように滅菌した薬さじで混合した。混合物は気相が十分にある状態で容器を密閉して、５５℃で３日間培養（以下堆肥培養と称する）した。菌の培養液の代わりに滅菌した２％ＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）を添加したものをネガティブコントロールとした。試験菌として、ＹＭ１７株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株およびＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株を用いた。 堆肥培養３日後の培養物を顕微鏡で観察したところ、ＹＭ１７株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株またはＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株の培養液を添加した試験区では全てにおいて良好な菌の生育が確認された。一方、菌の培養物を添加していないネガティブコントールでは菌体が見らなかった。図４にＹＭ１７株またはネガティブコントロールのカゼイン添加堆肥培養３日後の顕微鏡写真を示す。 図４、Ａの丸に示されるように、ＹＭ１７株については菌体の良好な生育が確認できた。一方で、図４、Ｂに示されるように、ネガティブコントロールでは堆肥の固形物のみが観察され、菌体は見られなかった。 堆肥培養３日後の培養物からタンパク質を抽出した。まず、培養物に３０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁液とし、室温で３時間静置した。静置後の懸濁液を濾過（濾紙：アドバンテック東洋，型式ＮＯ．５Ｂ，１１０ｍｍ）し、濾液を回収した。残った残渣物をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄するようにして、濾液を総量３０ｍＬに調整した。３０ｍＬの濾液に１４．２ｇの硫酸アンモニウムを加え、緩やかに撹拌し、硫酸アンモニウムを溶かした。硫酸アンモニウム溶解後、氷上で一晩静置した。静置後の液を４℃、１０，０００ｇで３０分間遠心し、上清を取り除いて沈殿物を回収した。沈殿物を１ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶かし、溶解物を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，スペクトラ／ポア（登録商標） １，ＭＷ ６，０００−８，０００）に入れて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で透析して脱塩処理をした。脱塩後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で調整して、液量を２ｍＬとし、ザイモグラムの供試試料とした。 ザイモグラフィー用の電気泳動ゲルには基質として終濃度０．１％のゼラチンを加えた。脱塩後のタンパク質溶解液１５μＬとＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ５μＬを混合し、２０μＬの混合液をザイモグラフィーに供試した。 電気泳動後のゲルを０．２％ＴｒｉｔｏｎＸを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に１０分間置いた後、本バッファーを捨て、ＴｒｉｔｏｎＸを含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２度洗浄した。洗浄後のゲルを２ｍＭのＣａＣｌ２および２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む２０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に浸けて５５℃で１６時間静置し、活性培養を行った。活性培養後、２ｍＭのＣａＣｌ２および２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む２０ｍＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を捨ててゲルを３０分間クマシー染色し、クマシー染色後に脱色をして、タンパク質の分解活性を調べた。 ザイモグラフィーの結果、カゼイン無添加の堆肥培養から抽出したタンパク質もゼラチン分解活性を示したが、カゼイン添加の堆肥培養から抽出したタンパク質はより強い活性を示した。また、菌の培養液を添加していないネガティブコントロールでは、カゼイン添加の有無にかかわらず堆肥培養から抽出したタンパク質はゼラチン分解活性を示さなかった。 菌の培養液を添加した場合、カゼイン無添加の堆肥培養の場合でもタンパク質の分解活性が見られたのは、基材とした堆肥中にタンパク質が残存しており、活性が誘導されているためであった。また、カゼインを添加して堆肥培養をすることで、活性誘導がより強く表れていた。 以上の結果から、ＹＭ１７株、ＹＭ１７−２株、ＹＭ１７−３株、ＹＭ１７−４株、ＹＭ１７−５株、ＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３７株またはＮａＣｌ＿２０１３１０１６＿３８株などのフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）種は堆肥中でも生育して、タンパク質分解活性を有することが示された。図５にゼラチンザイモグラフィーの結果を示した。図５、Ａは、カゼイン無添加堆肥培養より抽出したタンパク質を用いたザイモグラフィーの結果であり、図５、Ｂはカゼイン添加堆肥培養より抽出したタンパク質を用いたザイモグラフィーの結果である。試薬（１）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（Ｔｒｉｓ：６．１ｇ、濃塩酸でｐＨ８．０に調整、超純水：総液量が１０００ｍＬとなるように加えた）（２）ザイモグラム用電気泳動ゲルセパレイト層（３０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：２０００μＬ、１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）：１５００μＬ、超純水：１８００μＬ、１０％ＳＤＳ：６０μＬ、１０％ＡＰＳ：５０μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬ、１％ゼラチン：６００μＬ）スタッキング層（３０％Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：４５０μＬ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）：７５０μＬ、超純水：１７００μＬ、１０％ＳＤＳ：３０μＬ、１０％ＡＰＳ：５０μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬ）セパレイト層が固化した後、スタッキング層を重層して固化させる。（３）１０Ｘザイモグラム用電気泳動バッファー（Ｔｒｉｓ：３０．３ｇ、Ｇｌｙｃｉｎｅ：１４４ｇ、超純水：総液量が１０００ｍＬとなるように加えた）。ザイモグラムの電気泳動では１０Ｘザイモグラム用電気泳動バッファーを超純水で希釈して１Ｘバッファーとし、終濃度０．１％となるようにＳＤＳを加えた。 本発明によって得られた新規微生物は、新属フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種として、し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用であり、また、様々な用途に使用し得る。［寄託生物材料への言及］（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７６４（４）識別のための表示：ＹＭ１７（５）原寄託日：２０１３年１１月２９日［寄託生物材料への言及］（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４８（４）識別のための表示：ＹＭ１７−２（５）原寄託日：２０１４年１０月６日［寄託生物材料への言及］（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４９（４）識別のための表示：ＹＭ１７−３（５）原寄託日：２０１４年１０月６日［寄託生物材料への言及］（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５０（４）識別のための表示：ＹＭ１７−４（５）原寄託日：２０１４年１０月６日［寄託生物材料への言及］（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（２）連絡先：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８電話番号０４３８−２０−５５８０（３）受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９２５（４）識別のための表示：ＹＭ１７−５（５）原寄託日：２０１４年８月２８日フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種であり、配列番号１、または配列番号８〜配列番号１９のいずれかに示す塩基配列に対して９８．７％以上の相同性を有する塩基配列からなる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、ＹＭ１７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７６４）、ＹＭ１７−２株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４８）、ＹＭ１７−３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４９）、ＹＭ１７−４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５０）またはＹＭ１７−５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９２５）とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション相同値が７０％以上であり、かつ、次の１）〜１０）の特性を有する、フラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。１）グラム染色が陰性の桿菌であり、胞子を形成する２）オキシダーゼテストは陰性、カタラーゼテストは陽性で好気性である３）１％の糖および２．０％のＮａＣｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）に、該糖としてＤ−ガラクトースまたはシュークロースを加えた場合には酸生成を行わないが、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、グリセリンまたはＮ−アセチルグルコサミンを加えた場合には酸生成を行う４）至適生育温度は４５℃〜５５℃であり、３５℃以下または６５℃以上では増殖が確認されない５）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．７以下またはｐＨ１０．０以上では増殖が確認されない６）ＣＹＣ培地にＮａＣｌを終濃度７％まで添加しても増殖が確認される７）主要なメナキノンはＭＫ７である８）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む９）ゲノムＤＮＡのＧＣ含量は５１．２％ 〜５２．４％である１０）最も主要な菌体脂肪酸はｉｓｏ−Ｃ１６：０であるさらに、菌体脂肪酸として、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０のいずれか一種以上を含む、請求項１に記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。菌体脂肪酸としてｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０、ｉｓｏ−Ｃ１７：０を含むフラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）である、請求項１または２に記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。菌体脂肪酸としてｉｓｏ−Ｃ１６：０に加えて、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０を含む、フラテリバチラス フラボアルバス 亜種 フィメタリウム（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｆｉｍｅｔａｒｉｕｍ）である、請求項１〜３のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。有機廃棄物の処理に使用する、請求項１〜４のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。有機廃棄物がし尿、有機性汚泥、食品残渣物、又は動物糞尿である、請求項５に記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。ＹＭ１７株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７６４）、ＹＭ１７−２株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４８）、ＹＭ１７−３株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９４９）、ＹＭ１７−４株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９５０）またはＹＭ１７−５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１９２５）のいずれかである、請求項１〜６のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）。請求項１〜７のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を使用する有機廃棄物の処理方法。請求項１〜７のいずれかに記載のフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を使用するタンパク質の分解方法。【課題】し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用な新規微生物の提供を課題とする。【解決手段】フラテリバチラス属（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）の新種であり、１）グラム染色が陰性であり、胞子を形成する、２）オキシダーゼテストは陰性、カタラーゼテストは陽性で好気性である、３）１％の糖および０．２％のＮａｃｌを含むＬＢ培地（ｐＨ８．０）に、該糖としてＤ−ガラクトースまたはシュークロースを加えた場合には酸生成を行わないが、Ｄ−グルコース、ラクトース、Ｄ−マンニトール、グリセリンまたはＮ−アセチルグルコサミンを加えた場合には酸生成を行う、等の特性を有するフラテリバチラス フラボアルバス（Ｆｒａｔｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｏａｌｂｕｓ）を提供する。【選択図】なし配列表