生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ファブリー病の発症危険度を判定する方法及びマーカー |
| 出願番号： | 2014115488 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | G01N 33/92 |
特許情報キャッシュ
末岡 英明 市原 準二 櫻庭 均 兎川 忠靖 月村 考宏 JP 2015230199 公開特許公報(A) 20151221 2014115488 20140604 ファブリー病の発症危険度を判定する方法及びマーカー 大日本住友製薬株式会社 000002912 学校法人 明治薬科大学 505082350 長谷川 芳樹 100088155 清水 義憲 100128381 沖田 英樹 100140578 末岡 英明 市原 準二 櫻庭 均 兎川 忠靖 月村 考宏 G01N 33/92 20060101AFI20151124BHJP JPG01N33/92 Z 13 ＯＬ 15 2G045 2G045AA25 2G045CA26 2G045DA60 2G045FB06 本発明は、ファブリー病の発症危険度を判定する方法に関する。 ファブリー病は、α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧＡＬ）の酵素活性が欠損又は低下することによって生じる、先天性の糖脂質代謝異常症である。α−ＧＡＬは、糖脂質又は糖タンパク質の非還元末端のα−ガラクトシド結合を切断する反応を触媒する酵素であり、生体内では糖脂質の分解を担っている。α−ＧＡＬはライソゾームの中にあり、主にスフィンゴ糖脂質を基質として分解する。 したがって、α−ＧＡＬの活性が欠損又は低下すれば、スフィンゴ糖脂質の一種であるグロボトリアオシルセラミド（「Ｇｂ３」、「ＧＬ−３」、「セラミドトリヘキソアミド（ＣＴＨ）」ともいう。）が分解されずに、血管内皮細胞（血管内壁を構成している細胞）、全身の細胞、全身の組織に蓄積し、ファブリー病を発症する。その結果、四肢の痛み、低汗症、アンジオケラトーマ、角膜混濁、消化器障害、目眩、聴覚障害、脳血管障害、腎障害及び心障害等の様々な症状が出現し、時間の経過とともに重症化することが知られている。Ａｅｒｔｓ ＪＭ， ｅｔ ａｌ．、Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｉｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ Ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（２００８）１０５： ２８１２−２８１７．Ｇｏｌｄ Ｈ ｅｔ ａｌ．、Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ｏｆ Ｆａｂｒｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｕｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．（２０１３）５９、ｐ．５４７−５５６．Ａｕｒａｙ−Ｂｌａｉｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．、Ｕｒｉｎａｒｙ ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２０１２）８４、ｐ．２７４５−２７５３．Ｄｕｐｏｎｔ ＦＯ， ｅｔ ａｌ．、 Ａ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍａ ｌｙｓｏ−Ｇｂ３ ａｎａｌｏｇｓ ａｓ Ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（２０１３）２０： ２８０−２８８．Ｌａｖｏｉｅ Ｐ ｅｔ ａｌ．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｕｒｉｎａｒｙ ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２０１３）８５、ｐ．１７４３−１７５２．Ｂｏｕｔｉｎ Ｍ、Ａｕｒａｙ−Ｂｌａｉｓ Ｃ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍａ ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ Ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２０１４）８６、ｐ．３４７６−３４８３．Ｍａｎｗａｒｉｎｇ Ｖ ｅｔ ａｌ．、Ａ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｎｅｗ ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｏｆ Ｆａｂｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（２０１３）８５、ｐ．９０３９−９０４８． ファブリー病は、その症状、及び、被験者の白血球中のα−ＧＡＬの酵素活性、被験者のα−ＧＡＬをコードする遺伝子（ＧＬＡ）を調べることによって診断することができる。例えば、男性患者では、ＧＬＡ遺伝子の変異の種類によって、酵素活性がほぼ消失している古典型（Ｃｌａｓｓｉｃ）と、酵素活性がわずかに残っている遅発型（Ｌａｔｅｒ−Ｏｎｓｅｔ）に分類できることが知られている。しかしながら、近年、通常行われている蛋白質コード領域の遺伝子解析ではＧＬＡ遺伝子の配列に変異が認められないにも拘わらず、ファブリー病様の症状を呈する患者が存在することがわかってきている。また、Ｘ染色体上に存在するＧＬＡ遺伝子に変異がある男性患者の場合には、酵素活性の有無によってα−ＧＡＬの欠損を判別することができるが、Ｘ染色体のランダムな不活性化が生じているヘテロ接合型の遺伝子型を有する女性患者においては、α−ＧＡＬ酵素活性では、ファブリー病の発症危険度を判定することは難しい。以上のことから、遺伝子解析、α−ＧＡＬ酵素活性の測定によらない、ファブリー病の発症危険度を判定する方法が求められている。 一方、ファブリー病患者の血管内皮及び内臓組織に蓄積され、患者から採取される体液において検出可能な糖脂質としては、尿及び血漿中で検出可能なグロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質［Ｌｙｓｏ−ｅｎｅ−Ｇｂ３（−Ｈ２（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）））、＋Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋１６））、＋Ｈ２Ｏ２（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））］、尿中で検出可能なＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質［−Ｃ２Ｈ４（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２８））、−Ｃ２Ｈ４＋Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−１２））、−Ｈ２＋Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋１４））、＋Ｈ２Ｏ３（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋５０））］、又は血漿中で検出可能なＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質［＋Ｈ２Ｏ（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋１８））］、又は血漿中で検出可能なグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）関連物質が報告されている（非特許文献１〜７）。個々のＬｙｓｏ−Ｇｂ３及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質の測定によって健常人とファブリー病患者を判定する方法については報告されているが、特定の物質の組み合わせを用いて判定する方法は報告されていない。 本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ファブリー病の発症危険度を判定する方法を提供することを目的とする。 本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、血漿等の体液に存在する複数のＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質の量から算出される指標値、好ましくは量比、具体的には、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（+３４））の量に基づいて算出される指標値を用いることで、従来の方法に比べて、より正確にファブリー病の発症危険度を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は以下に関する。［１］ファブリー病の発症危険度を判定する方法であって、 被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、 上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、を含む方法。［２］被験者の組織へのグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積の可能性を判定する方法であって、 被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、 上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性があると判定する工程と、を含む方法。［３］上記指標値が上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量に対する上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率である、上記［１］又は［２］に記載の方法。［４］上記基準値Ａが、健常人における上記比率である、上記［３］に記載の方法。［５］上記体液が血漿又は血清であって、上記基準値Ａが、１〜２の間で設定される値である、上記［３］に記載の方法。［６］上記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含み、 上記指標値が上記基準値Ａよりも小さく、かつ上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、上記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。［７］上記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含み、 上記指標値が、［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、上記［１］又は［２］に記載の方法。［８］上記基準値Ａが、健常人における上記［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、上記［７］に記載の方法。［９］上記体液が血漿又は血清であって、上記基準値Ａが、１０〜８０の間で設定される値である、上記［７］に記載の方法。［１０］上記指標値が上記基準値Ａよりも小さく、かつ上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、上記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。［１１］上記基準値Ｂが、健常人における上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量である、上記［６］又は［１０］に記載の方法。［１２］上記体液が血漿又は血清であって、上記基準値Ｂが０．２ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される体液中濃度である、上記［６］又は［１０］に記載の方法。［１３］上記体液が血漿又は血清である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。 本発明によれば、ファブリー病の発症危険度を判定する方法を提供することが可能になる。健常人及びファブリー病を発症している患者における、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度及びアナログ比を示すグラフである。 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 本実施形態に係るファブリー病の発症危険度を判定する方法（以下、単に「判定方法」という場合がある。）は、（１）被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、（２）上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、を含む。 ファブリー病とは、α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧＡＬ）の酵素活性が欠損又は低下することによって生じる、先天性の糖脂質代謝異常症を意味する。α−ＧＡＬの活性が欠損又は低下すると、スフィンゴ糖脂質の一種であるグロボトリアオシルセラミド（「Ｇｂ３」、「ＧＬ−３」、「セラミドトリヘキソアミド（ＣＴＨ）」ともいう。）が分解されずに、血管内皮細胞、全身の細胞、全身の組織に蓄積する。その結果、四肢の痛み、低汗症、アンジオケラトーマ、角膜混濁、消化器障害、目眩、聴覚障害、脳血管障害、腎障害及び心障害等の様々な症状が出現し、時間の経過とともに重症化することが知られている。したがって、上記判定方法は、被験者の組織へのグロボトリアオシルセラミドの蓄積の可能性を判定する方法として把握することもできる。 被験者から採取された体液としては、特に制限はなく、例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液等が挙げられ、血漿又は血清が好ましく用いられる。 グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（以下、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）」という場合がある。）及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（以下、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）」という場合がある。）は、グロボトリアオシルスフィンゴシン（以下、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３」という場合がある。）の類似体（アナログ体）である。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３から２個の水素原子が脱離した構造を有する類似体である。一方、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３に２個の水素原子と２個の酸素原子とが付加した構造を有する類似体である。以下、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の類似体を、「Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質」という場合がある。 Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量、及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量を測定する方法としては、特に制限はなく公知の方法によって測定することが可能であるが、液体クロマトグラフィー法と質量分析法とを組み合わせた方法（ＬＣ−ＭＳ法）が好ましく用いられる。 液体クロマトグラフィー用のカラムとしては、例えば、逆相カラム、ＨＩＬＩＣ（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）カラム等が挙げられる。内径が２０〜１００μｍの逆相カラム（ナノカラム）は、微量の試料でも測定できることから好ましく用いられる。市販されているナノカラムとしては、例えば、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ｎａｎｏ ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍｘ０．１ｍｍ、３ｍｍ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。 液体クロマトグラフィーの移動相は、用いるカラムによって適宜設定できるが、例えば逆相カラムを用いる場合、メタノール、アセトニトリル等が好ましく用いられる。 質量分析法としては、例えば、大気圧化学イオン化法(ＡＰＣＩ)、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、ナノエレクトロスプレー法等が挙げられ、好ましくは、ナノエレクトロスプレー法が挙げられる。質量分析法に用いられる機器としては、市販されているものであれば特に制限はないが、例えば、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。 上記の測定を行うにあたり、当業者に周知の方法で適宜工程（１）における測定前に、被験者から採取された体液に対して前処理を行ってもよい。例えば、体液が血液である場合、まず被験者の末梢血を採血管に採取し、凝固させた後、遠心分離を行うことによって上清を得る。得られた上清画分を、固相抽出等の前処理を行うことで、測定試料とすることができる。ここでナノエレクトロスプレー法を用いた測定を行う場合、１μｌ〜５μｌ程度の血漿量又は血清量で測定が可能である。 上記の測定は、適宜内部標準物質の存在下で行ってもよい。当該内部標準物質としては、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３又はＬｙｓｏ−Ｇｂ３関連物質の任意の炭素原子又は水素原子が、それぞれ１３Ｃ、重水素原子等の安定同位体に置換された物質を用いることができる。内部標準物質として、具体的には後述の実施例に示す、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の末端メチル基の水素原子が重水素原子に置換され、かつスフィンゴシン骨格３位の炭素原子が１３Ｃに置換された化合物（グロボトリアオシル−［３−１３Ｃ１，１８−２Ｈ３］−スフィンゴシン）が挙げられる。 本実施形態に係る判定方法に用いられる測定用キットであって、当該内部標準物質があらかじめ充填された容器を含む測定用キットもまた、本実施形態の範疇である。測定用キットとしては、例えば、上記内部標準物質があらかじめ充填された体液注入用容器等が挙げられる。上記体液注入用容器に上記体液を注入することで、ＬＣ−ＭＳ等の分析機器で測定するための試料を作製できる。 被験者におけるＬｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、被験者がファブリー病を発症している可能性がある、又は、被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性があると判定する。 上記指標値は、上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量に対する上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率であることが好ましい。この場合、上記基準値Ａとしては、健常人における上記比率であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有する健常人及び患者の測定値のうち、患者群が含まれない指標値を適宜設定することができ、好ましくは、健常人群にも患者群にも含まれず、健常人群と患者群との間の値を設定する。あらかじめ設定された値を用いる場合、体液が血漿又は血清であるときには、基準値Ａは、１〜２の間で設定される値であることが好ましく、１．４〜２の間で設定される値であることがより好ましく、１．４〜１．５の間で設定される値であることが更により好ましい。 本実施形態に係る判定方法は、上記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含んでもよい。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を測定する方法としては、特に制限はなく公知の方法によって測定することが可能であるが、例えば、内部標準物質を用いたＬＣ−ＭＳ法が好ましく用いられる。内部標準物質としては、例えば、安定同位体標識したＬｙｓｏ−Ｇｂ３が挙げられる。 Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を測定することによって、判定方法の精度が更に向上する傾向がある。すなわち、上記指標値が上記基準値Ａよりも小さく、かつ上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、上記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は、上記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定できる。 基準値Ｂは、健常人におけるＬｙｓｏ−Ｇｂ３の量であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有する健常人及び患者の測定値のうち、患者群が含まれない測定値を適宜設定することができ、好ましくは、健常人群にも患者群にも含まれず、健常人群と患者群との間の値を設定する。健常人におけるＬｙｓｏ−Ｇｂ３の量は男性、女性で分けてもよく、平均値±標準偏差等で設定してもよい。あらかじめ設定された値を用いる場合、体液が血漿又は血清であるときには、基準値Ｂは体液中濃度０．２ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される値であることが好ましく、０．５ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される値であることがより好ましい。 Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量を測定する工程を含む場合、指標値は、［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値であることが好ましい。判定方法の精度が更に向上する傾向がある。このときの基準値Ａは、健常人における上記［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有する健常人及び患者の測定値のうち、患者群が含まれない指標値を適宜設定することができ、好ましくは、健常人群にも患者群にも含まれず、健常人群と患者群との間の値を設定する。あらかじめ設定された値を用いる場合、体液が血漿又は血清であるときには、基準値Ａは、１０〜８０の間で設定される値であることが好ましく、３０〜８０の間で設定される値であることがより好ましく、３０〜４０の間で設定される値であることが更に好ましい。 以上説明したように、本実施形態に係る判定方法は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値を用いて行われるため、ヘテロ接合型の遺伝子型を有する女性患者等の被験者においても、精度よく判定することが可能になる。また、本実施形態に係る判定方法は、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及びＬｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率に基づく指標値を用いる場合、内部標準物質を用いることなく、精度高く算出できる点で、特に有用である。 以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。試薬 Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３は、Ｍａｔｒｅｙａ社（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）から購入した。内部標準物質として使用した安定同位体標識したＬｙｓｏ−Ｇｂ３（ａｂｂｒ． Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳ）は、Ｌ−セリン−１−１３Ｃとパルミチン酸−ＣＤ３を原料の一部とし、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１１：１６５２−１６６３に記載の方法で、合成した。すなわち、Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳはひとつの１３Ｃと３つの重水素とを含む以下の式：で表される化合物（グロボトリアオシル−［３−１３Ｃ１，１８−２Ｈ３］−スフィンゴシン）である。 サンプル調製及びｎａｎｏ−ＬＣ／ＭＳに用いたメタノール（ＭｅＯＨ、ＬＣ−ＭＳグレード）、並びに、アセトニトリル（ＡｃＮ、ＬＣ−ＭＳグレード）は、関東化学株式会社から購入した。ギ酸（ＦＡ、ＬＣ−ＭＳグレード）は和光純薬工業株式会社から購入した。サンプル調製 血漿は、健常人（男性２０名、女性２０名）、並びに、ファブリー病男性患者（Ｃｌａｓｓｉｃ９名、Ｌａｔｅｒ−ｏｎｓｅｔ８名）及び女性患者（１０名）から採取した。採取された血漿からのＬｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の抽出は、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ４１４：２７３−２８０に記載の方法を最適化して実施した。まず、標準血漿を作製した。具体的には、チャコール処理した血漿に０、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０、５０及び２５０ｎＭの濃度でＬｙｓｏ−Ｇｂ３を添加して標準血漿を作製した。次にＬｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳを１％Ｈ３ＰＯ４／ＭｅＯＨに終濃度が２．５ｎＭになるように希釈し、ＩＳ溶液（内部標準溶液）を作製した。２０μＬの標準血漿にＩＳ溶液を８０μＬ添加し、混合後に遠心し、タンパク質を除去した。一方、ファブリー病患者又は健常人から採取した上記血漿試料も同様に血漿２０μＬにＩＳ溶液を８０μＬ添加して、混合後に遠心した。遠心後、得られた混合液の上清８０μＬに１％Ｈ３ＰＯ４／４０％ＭｅＯＨを９２０μＬ添加混合し、１２００μＬのＭｅＯＨ及び１２００μＬの２％Ｈ３ＰＯ４で予めコンディショニングしたＯＡＳＩＳ ＭＣＸカートリッジ（ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、３０ｍｇ、６０ｍｍ）に添加した。その後、カートリッジを１２００μＬの２％ＦＡ、１２００μＬの０．２％ＦＡ／ＭｅＯＨ、１２００μＬの２％ＮＨ４（２８％（ｖ／ｖ））／５０％ＭｅＯＨの順に洗浄した。アナログ体の抽出の場合は１２００μＬの２％ＮＨ４（２８％（ｖ／ｖ））／５０％ＭｅＯＨによる洗浄は実施しなかった。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体は１２００μＬの２％ＮＨ４（２８％（ｖ／ｖ））／ＭｅＯＨでガラスチューブに溶出し、エバポレーターで乾固した。得られた乾固物は適切な容量の０．１％ＦＡ／５０％ＡｃＮで溶解し、得られたサンプルをｎａｎｏ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。機器及び定量方法 ｎａｎｏ−ＬＣシステムとして、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）はＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳＬＣｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、オートサンプラーはＰＡＬ ＨＴＳ ＸＴ−ＣＴＣ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＡＧ、Ｚｗｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。サンプルは１μＬ ｎａｎｏ Ｖｉｐｅｒ Ｌｏｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて注入した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の分離にはＺｏｒｂａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８ ｎａｎｏ ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍｘ０．１ｍｍ、３ｍｍ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。溶媒Ａは０．２％ＦＡ／５％ＡｃＮ、溶媒Ｂは０．２％ＦＡ／ＡｃＮを用い、２５分間のグラジエントを使用した（０分、１％溶媒Ｂ；１０分、９９％溶媒Ｂ；１６分、９９％溶媒Ｂ；１６．１分、１％溶媒Ｂ；２５分、１％溶媒Ｂ）。流速は０．５μＬ／分とした。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＬｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の検出に用いた。装置のキャリブレーションは全ての測定前に実施した。Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３及びそのアナログ体の定量はＴａｒｇｅｔｅｄ ＭＳ／ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＨＲＰＳ）ｍｏｄｅで実施した。一段目の四重極は１．０ ＦＷＨＮ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ検出器は１７５００ ＦＷＨＮに設定した。ＡＧＣターゲット値は１ｅ５、ｍａｘｉｍｕｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅは１００ｍｓに設定した。すべての測定対象化合物のコリジョンエネルギーは２５％に設定した。ターゲットとした質量はＬｙｓｏ−Ｇｂ３に対してｍ／ｚ ７８６．４４８２、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳに対してｍ／ｚ ７９０．４７０、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）に対してｍ／ｚ ７８４．４３３、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）に対してｍ／ｚ ８２０．４５４とした。Ｑｕａｎ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてデータ処理を行った。スフィンゴシン由来の最も強度が強いピークを定量のために選択した。選択した質量はＬｙｓｏ−Ｇｂ３に対してｍ／ｚ ２８２．２７８、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３−ＩＳに対してｍ／ｚ ２８６．３０１、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）に対してｍ／ｚ ２８０．２６３、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）に対してｍ／ｚ ３３４．２９５とした。 上述したｎａｎｏ−ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステムによる分析の結果に基づいて、健常人及びファブリー病患者における、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の内部標準に対する相対量（ピーク面積比）、並びに、（−２）／（＋３４）、（＋３４）／（−２）及び｛（＋３４）／（−２）｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の各比率（以下、「アナログ比」という場合がある。）を算出した（表１〜表５）。ここで、「（−２）」及び「（＋３４）」は、それぞれ、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）を示す。 横軸にアナログ比（＋３４）／（−２）、縦軸にｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度をとったプロット、及び、横軸にアナログ比｛（＋３４）／（−２）｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３、縦軸にｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度をとったプロットを、それぞれ図１（Ａ）及び（Ｂ）に示す。これらのプロットから、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度よりも、上記アナログ比の方が、健常人とファブリー病患者とを区別しやすいことが分かった。すなわち、上記アナログ比の方が、ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度よりもファブリー病の発症危険度を判定するための指標として適していることが分かった。さらに、アナログ比｛（＋３４）／（−２）｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３は、アナログ比（＋３４）／（−２）よりも、健常人とファブリー病患者との差が更に明確となり、指標としてより適していることが分かった。 また、上記アナログ比及びｌｙｓｏ−Ｇｂ３の濃度の２つのパラメータを用いることでも、健常人とファブリー病患者との区別が行いやすくなることがわかった。 ファブリー病の発症危険度を判定する方法であって、 被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、 前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、前記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、を含む方法。 被験者の組織へのグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積の可能性を判定する方法であって、 被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、 前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、前記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性があると判定する工程と、を含む方法。 前記指標値が前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量に対する前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量の比率である、請求項１又は２に記載の方法。 前記基準値Ａが、健常人における前記比率である、請求項３に記載の方法。 前記体液が血漿又は血清であって、前記基準値Ａが、１〜２の間で設定される値である、請求項３に記載の方法。 前記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含み、 前記指標値が前記基準値Ａよりも小さく、かつ前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、前記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は前記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 前記体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３）の量を測定する工程を更に含み、 前記指標値が、［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、請求項１又は２に記載の方法。 前記基準値Ａが、健常人における前記［｛Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量｝／Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量］で表される値である、請求項７に記載の方法。 前記体液が血漿又は血清であって、前記基準値Ａが、１０〜８０の間で設定される値である、請求項７に記載の方法。 前記指標値が前記基準値Ａよりも小さく、かつ前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量が基準値Ｂよりも多い場合、前記被験者がファブリー病を発症している可能性がより高い、又は前記被験者の組織にＧｂ３が蓄積している可能性がより高いと判定する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。 前記基準値Ｂが、健常人における前記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３の量である、請求項６又は１０に記載の方法。 前記体液が血漿又は血清であって、前記基準値Ｂが０．２ｎＭ〜０．７ｎＭの間で設定される体液中濃度である、請求項６又は１０に記載の方法。 前記体液が血漿又は血清である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。 【課題】ファブリー病の発症危険度を判定する方法を提供すること。【解決手段】ファブリー病の発症危険度を判定する方法であって、被験者から採取された体液に含まれる、グロボトリアオシルスフィンゴシン（−２）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２））の量、及びグロボトリアオシルスフィンゴシン（＋３４）体（Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４））の量を測定する工程と、上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（−２）の量及び上記Ｌｙｓｏ−Ｇｂ３（＋３４）の量に基づいて算出される指標値が、基準値Ａよりも小さい場合に、上記被験者がファブリー病を発症している可能性があると判定する工程と、を含む方法。【選択図】なし