生命科学関連特許情報

タイトル:公開特許公報(A)_ジャガイモそうか病抑制剤
出願番号:2014082612
年次:2014
IPC分類:A01N 43/22,A01P 3/00,A01N 63/00,C12N 1/20


特許情報キャッシュ

小林 有紀 小林 晃 副島 洋 佐久間 太 眞木 祐子 JP 2014224102 公開特許公報(A) 20141204 2014082612 20140414 ジャガイモそうか病抑制剤 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 501203344 雪印種苗株式会社 391009877 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 小林 有紀 小林 晃 副島 洋 佐久間 太 眞木 祐子 JP 2013088146 20130419 A01N 43/22 20060101AFI20141107BHJP A01P 3/00 20060101ALI20141107BHJP A01N 63/00 20060101ALI20141107BHJP C12N 1/20 20060101ALI20141107BHJP JPA01N43/22A01P3/00A01N63/00 FC12N1/20 AC12N1/20 E 5 OL 25 4B065 4H011 4B065AA50X 4B065AC14 4B065AC20 4B065BA23 4B065BB37 4B065CA05 4B065CA08 4B065CA16 4B065CA18 4B065CA47 4H011AA01 4H011BB08 4H011BB21 4H011DA13 4H011DA15 4H011DD04 4H011DG06 本発明は、ジャガイモそうか病抑制剤及びジャガイモそうか病抑制方法に関する。 ジャガイモそうか病(common scab,deep scab)は土壌中のジャガイモそうか病菌(Streptomyces scabiei,Streptomyces turgidiscabiesなど)がジャガイモ(バレイショ)に感染することにより、可食部である塊茎の表皮の汚れ・陥没などを引き起こすことにより品質の低下を招き、重度の場合は減収となる難防除土壌病害である。その被害は全世界に広まっており、発生面積は国内北海道だけでも22,215haで栽培面積の実に39%に上る(2008年,北海道病害虫防除所資料)。その防除方法として、化学農薬による種芋消毒のほか、輪作、休閑緑肥栽培、土壌酸度調整、土壌水分調整など様々な対策が講じられているものの、十分な防除効果は得られていない。また、抵抗性品種の育成も精力的に行われているが、抵抗性が極めて弱い従来品種の栽培を望む声は依然として高い。小規模畑作である暖地においては、化学農薬を用いた土壌消毒によりそうか病防除が可能である。しかし、土壌消毒は、防除効果は高いが環境負荷の面からは望ましくなかった。 微生物を利用した新たなそうか病防除方法として、これまでに、各種糸状菌(特許文献1〜4)、細菌(特許文献5〜10)、放線菌(特許文献11)を利用した方法が開発されている。ジャガイモそうか病菌は土壌水分が少ない条件で被害が大きくなる一方で、糸状菌、細菌は増殖に高水分を要求することもあり、その防除効果は十分ではなかった。この点から、ジャガイモそうか病菌と同様に乾燥条件で増殖が旺盛な放線菌の中でジャガイモそうか病抑制作用の高いものが望まれていた。また、これら微生物は単独でそうか病防除に利用されているが、微生物単独での施用法は、殺菌土壌では効果があっても、自然土壌では効果が低いことが問題であった。この原因としては(1)土壌中は栄養の豊かな培地上とは異なり、根圏や新鮮な有機物の近傍を除き極めて貧栄養であり、微生物が培地上で発現する拮抗作用を土壌中では発揮できない場合が多いこと;(2)根圏や有機物の近傍では在来微生物との競合が激しく、添加した微生物が定着できない場合も多いこと;などが挙げられる。 また、拮抗微生物の病害抑制機構が明らかでないため、防除効果がばらつく原因の解析や技術的な改良ができないことも問題であった。病害抑制機構の1つとして、バチルス属またはロドコッカス属細菌やストレプトマイセス属放線菌がそうか病菌に対し抗菌活性を有する物質を産生することが報告されている(特許文献5、11、12)。そうか病菌に対し抗菌活性を有する物質としては、バチラス属細菌が産生するサーファクチン、イツリンA、マクロラクチンAが報告されている(特許文献13、非特許文献1)。 一方、マクロライド系抗生物質の一種であるボレリジン(borrelidin)は、ダニ・シラミ媒介性の回帰熱の原因菌(スピロヘータ)であるボレリア(Borrelia)属菌を抑制する物質として放線菌培養液中から単離された。その後、この物質は脈管新生阻害活性があることから抗がん剤のリード化合物として(非特許文献2)、また、薬剤耐性となったマラリア病原体プラスモジウム(Plasmodia)属原虫の抑制作用があることからマラリア薬のリード化合物として(非特許文献3)開発がすすんでいる。特開2009−136216号公報特開2006−199601号公報特開2004−262801号公報特開平10−17422号公報特開2007−153873号公報特開2005−289878号公報特開2005−60287号公報特開2001−327281号公報特公平5−87044号公報特公平2−48509号公報特開2005−295924号公報特開2008−231023号公報特開2007−99626号公報J.S.Han et al.2005.J.Appl.Microbiol.99:213−221.Wakabayashi et al.1997.J.Antibiotics 50:671−676.Otoguro et al.2003.J.Antibiotics 56:727−729. 本発明の課題は、新たなジャガイモそうか病抑制剤及び抑制方法を提供することにある。 そこで本発明者は、ジャガイモそうか病の原因菌に対する抗菌作用が高い物質を探索したところ、ボレリジン(borrelidin)、その塩又はそれらのエステルの効果が極めて高いことを見出した。またボレリジン、その塩又はそれらのエステルを産生する微生物もジャガイモそうか病を抑制する効果があることを見出した。さらに、ボレリジン類又はその塩を含有する培地を用いて土壌等の試料を培養し、生育する微生物を選抜すればボレリジン類又はその塩を生産する微生物が選抜できることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、次の〔1〕〜〔5〕を提供するものである。〔1〕一般式(1)(式中、R1はヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)で表されるボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物を含有するジャガイモそうか病抑制剤。〔2〕一般式(1)(式中、R1はヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)で表されるボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物を用いるジャガイモそうか病抑制方法。〔3〕ボレリジン類若しくはその塩、ボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物、ボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物の培養物、又はボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物を接種した植物を用いる〔2〕記載のジャガイモそうか病抑制方法。〔4〕ストレプトマイセス sp.ARDB−1(NITE P−1162)、ストレプトマイセス sp.ARDB−2(NITE P−1163)、ストレプトマイセス sp.ARDB−3(NITE P−1164)又はそれらの突然変異体。〔5〕ボレリジン類又はその塩を含有する培地で試料を培養し、生育する微生物を選抜することを特徴とするボレリジン類又はその塩を生産する微生物の選抜方法。 本発明によれば、ボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物を用いることにより、ジャガイモそうか病の発生を顕著に抑制することができる。 本発明のジャガイモそうか病抑制剤の有効成分は、上記一般式(1)で表されるボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物である。ここで、ボレリジン類は、ボレリジン及びそのアルキルエステル(R1=アルコキシ基)である。 一般式(1)において、R1はヒドロキシ基又はアルコキシ基である。アルコキシ基としてはメトキシ基、エトキシ基、n−プロポキシ基、i−プロポキシ基、n−ブトキシ基、n−ペンチルオキシ基、n−ヘキシルオキシ基など炭素数1〜6の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基が挙げられる。これらのアルコキシ基のうち、炭素数1〜4の直鎖又は分岐鎖のアルコキシ基が好ましく、メトキシ基、エトキシ基がより好ましい。 また、一般式(1)において、R1がヒドロキシ基である場合の塩としては、特に限定されないが、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩;カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩;アンモニウム塩等が挙げられる。 当該ボレリジン類(1)又はその塩は、ストレプトマイセス属に属するボレリジン生産菌を培養することによって製造することができ、また公知の化学合成法によっても製造することができる(Nagamitsu et al.2004.Organic Letters 6:1865−1869)。ボレリジン類生産菌としては、Streptomyces abikoensis、S.aburaviensis、S.abyssalis、S.achromogenes、S.acidiscabies、S.acrimycini、S.aculeolatus、S.afghaniensis、S.africanus、S.alanosinicus、S.albaduncus、S.albiaxialis、S.albidochromogenes、S.albidoflavus、S.albiflaviniger、S.albireticuli、S.albofaciens、S.alboflavus、S.albogriseolus、S.albolongus、S.alboniger、S.albospinus、S.albosporeus、S.alboverticillatus、S.albovinaceus、S.alboviridis、S.albulus、S.albus、S.aldersoniae、S.almquistii、S.alni、S.althioticus、S.amakusaensis、S.ambofaciens、S.aminophilus、S.anandii、S.angustmyceticus、S.anthocyanicus、S.antibioticus、S.antimycoticus、S.anulatus、S.aomiensis、S.arabicus、S.ardus、S.arenae、S.argenteolus、S.armeniacus、S.artemisiae、S.ascomycinicus、S.asiaticus、S.asterosporus、S.atacamensis、S.atratus、S.atriruber、S.atroaurantiacus、S.atroolivaceus、S.atrovirens、S.aurantiacus、S.aurantiogriseus、S.auratus、S.aureocirculatus、S.aureofaciens、S.aureorectus、S.aureoversilis、S.aureoverticillatus、S.aureus、S.avellaneus、S.avermectinius、S.avermitilis、S.avicenniae、S.avidinii、S.axinellae、S.azaticus、S.azureus、S.baarnensis、S.bacillaris、S.badius、S.baldaccii、S.baliensis、S.bambergiensis、S.bangladeshensis、S.beijiangensis、S.bellus、S.bikiniensis、S.biverticillatus、S.blastmyceticus、S.bluensis、S.bobili、S.bottropensis、S.brasiliensis、S.brevispora、S.bungoensis、ストレプトマイセス カカオイ(S.cacaoi)、S.caelestis、S.caeruleatus、S.caeruleus、S.californicus、S.calvus、S.canarius、S.candidus、S.canescens、S.cangkringensis、S.caniferus、S.canus、S.capillispiralis、S.capoamus、S.carpaticus、S.carpinensis、S.castelarensis、S.catenulae、S.caviscabies、S.cavourensis、S.cellostaticus、S.celluloflavus、S.cellulolyticus、S.cellulosae、S.champavatii、S.chartreusis、S.chattanoogensis、S.cheonanensis、S.chibaensis、S.chrestomyceticus、S.chromofuscus、S.chryseus、S.chrysomallus、S.cinereorectus、ストレプトマイセス シネレオルバー(S.cinereoruber)、S.cinereospinus、S.cinereus、S.cinerochromogenes、S.cinnabarinus、S.cinnamonensis、S.cinnamoneus、S.cirratus、S.ciscaucasicus、S.citreofluorescens、S.clavifer、S.clavuligerus、S.coacervatus、S.cochleatus、S.cocklensis、S.coelescens、S.coelicoflavus、S.coelicolor、S.coeruleoflavus、S.coeruleofuscus、S.coeruleoprunus、S.coeruleorubidus、S.coerulescens、S.collinus、S.colombiensis、S.corchorusii、S.costaricanus、S.cremeus、S.crystallinus、S.curacoi、S.cuspidosporus、S.cyaneofuscatus、ストレプトマイセス シアネウス(S.cyaneus)、S.cyanoalbus、S.cystargineus、S.daghestanicus、S.daliensis、ストレプトマイセス デカネンシス(S.deccanensis)、S.decoyicus、S.demainii、S.diastaticus、ストレプトマイセス ジアスタトクロモゲネス(S.diastatochromogenes)、S.distallicus、S.djakartensis、S.drozdowiczii、S.durhamensis、S.durmitorensis、S.echinatus、S.echinoruber、S.ederensis、S.ehimensis、S.emeiensis、S.endophyticus、S.endus、S.enissocaesilis、S.erumpens、S.erythraeus、S.erythrogriseus、S.eurocidicus、S.europaeiscabiei、S.eurythermus、S.exfoliatus、S.felleus、S.fenghuangensis、S.ferralitis、S.fervens、S.filamentosus、S.fildesensis、S.filipinensis、S.fimbriatus、S.fimicarius、S.finlayi、S.flaveolus、S.flaveus、S.flavidofuscus、S.flavidovirens、S.flaviscleroticus、S.flavofungini、S.flavofuscus、S.flavogriseus、S.flavopersicus、S.flavotricini、S.flavovariabilis、S.flavovirens、S.flavoviridis、S.flocculus、S.floridae、S.fluorescens、S.fradiae、S.fragilis、S.fulvissimus、S.fulvorobeus、S.fumanus、S.fumigatiscleroticus、S.galbus、S.galilaeus、S.gancidicus、S.gardneri、S.gelaticus、S.geldanamycininus、S.geysiriensis、S.ghanaensis、S.gibsonii、S.glaucescens、S.glauciniger、S.glaucosporus、S.glaucus、S.globisporus、S.globosus、S.glomeratus、S.glomeroaurantiacus、S.glycovorans、S.gobitricini、S.goshikiensis、S.gougerotii、S.graminearus、S.gramineus、S.graminofaciens、S.griseiniger、S.griseinus、S.griseoaurantiacus、S.griseobrunneus、S.griseocarneus、S.griseochromogenes、S.griseoflavus、S.griseofuscus、S.griseoincarnatus、S.griseoloalbus、S.griseolosporeus、S.griseolus、S.griseoluteus、S.griseomycini、S.griseoplanus、S.griseorubens、S.griseoruber、S.griseorubiginosus、S.griseosporeus、S.griseostramineus、S.griseoverticillatus、S.griseoviridis、S.griseus、S.guanduensis、S.gulbargensis、S.hachijoensis、S.hainanensis、S.haliclonae、S.halstedii、S.hawaiiensis、S.hebeiensis、S.heilongjiangensis、S.heliomycini、S.helvaticus、S.herbaceus、S.herbaricolor、S.himastatinicus、S.hiroshimensis、S.hirsutus、ストレプトマイセス ヒュミダス(S.humidus)、S.humiferus、S.hyderabadensis、S.hydrogenans、S.hygroscopicus、S.hypolithicus、S.iakyrus、S.incanus、S.indiaensis、S.indicus、S.indigoferus、S.indonesiensis、S.intermedius、S.inusitatus、S.ipomoeae、S.iranensis、S.janthinus、S.javensis、S.jietaisiensis、S.kanamyceticus、S.kashimirensis、S.kashmirensis、S.kasugaensis、S.katrae、S.kentuckensis、S.kifunensis、S.kishiwadensis、S.koyangensis、S.kunmingensis、S.kurssanovii、S.labedae、S.laceyi、S.lacticiproducens、S.laculatispora、S.ladakanum、S.lanatus、S.lateritius、S.laurentii、S.lavendofoliae、S.lavendulae、S.lavenduligriseus、S.lavendulocolor、S.levis、S.libani、S.lienomycini、S.lilacinus、S.limosus、S.lincolnensis、S.lipmanii、S.litmocidini、S.lomondensis、S.longisporoflavus、S.longispororuber、S.longisporus、S.longwoodensis、S.lucensis、S.lunalinharesii、S.koyangensis、S.kunmingensis、S.kurssanovii、S.labedae、S.laceyi、S.lacticiproducens、S.laculatispora、S.ladakanum、S.lanatus、S.lateritius、S.laurentii、S.lavendofoliae、S.lavendulae、S.lavenduligriseus、S.lavendulocolor、S.levis、S.libani、S.lienomycini、S.lilacinus、S.limosus、S.lincolnensis、S.lipmanii、S.litmocidini、S.lomondensis、S.longisporoflavus、S.longispororuber、S.longisporus、S.longwoodensis、S.lucensis、S.lunalinharesii、S.misakiensis、S.misionensis、S.mobaraensis、S.monomycini、S.mordarskii、S.morookaense、S.morookaensis、S.murinus、S.mutabilis、S.mutomycini、S.naganishii、S.nanhaiensis、S.nanshensis、S.narbonensis、S.nashvillensis、S.netropsis、S.neyagawaensis、S.niger、S.nigrescens、S.nigrifaciens、S.nitrosporeus、S.niveiscabiei、S.niveoruber、S.niveus、S.noboritoensis、S.nodosus、S.nogalater、S.nojiriensis、S.noursei、S.novaecaesareae、S.ochraceiscleroticus、S.odorifer、S.olivaceiscleroticus、S.olivaceoviridis、S.olivaceus、S.olivochromogenes、S.olivomycini、S.olivoreticuli、S.olivoverticillatus、S.olivoviridis、S.omiyaensis、S.orinoci、S.osmaniensis、S.pactum、S.panacagri、S.paracochleatus、S.paradoxus、S.parvisporogenes、S.parvulus、S.parvus、S.paucisporeus、S.peucetius、S.phaeochromogenes、S.phaeofaciens、S.phaeogriseichromatogenes、S.phaeoluteichromatogenes、S.phaeoluteigriseus、S.phaeopurpureus、S.phaeoviridis、S.pharetrae、S.pharmamarensis、S.phosalacineus、S.phytohabitans、S.pilosus、S.platensis、S.plicatus、S.plumbiresistens、S.pluricolorescens、S.polyantibioticus、S.polychromogenes、S.poonensis、S.praecox、S.prasinopilosus、S.prasinosporus、S.prasinus、S.pratens、S.prunicolor、S.psammoticus、S.pseudoechinosporeus、S.pseudogriseolus、S.pseudovenezuelae、S.pulveraceus、S.puniceus、S.puniciscabiei、S.purpeofuscus、S.purpurascens、S.purpureus、S.purpurogeneiscleroticus、S.qinglanensis、S.racemochromogenes、S.radiopugnans、S.rameus、S.ramulosus、S.rangoonensis、S.rapamycinicus、S.recifensis、S.rectiverticillatus、S.rectiviolaceus、S.regensis、S.resistomycificus、S.reticuliscabiei、S.rhizosphaericus、S.rhizosphaerius、S.rimosus、ストレプトマイセス リシリエンシス(S.rishiriensis)、S.rochei、S.rosealbus、S.roseiscleroticus、S.roseodiastaticus、S.roseoflavus、S.roseofulvus、S.roseolilacinus、S.roseolus、S.roseosporus、S.roseoverticillatus、S.roseoviolaceus、S.roseoviridis、S.ruanii、S.ruber、S.rubidus、S.rubiginosohelvolus、S.rubiginosus、S.rubrogriseus、S.rubrus、S.rutgersensis、S.salmonis、S.sampsonii、S.samsunensis、S.sanglieri、S.sannanensis、S.sanyensis、S.sapporonensis、S.scabiei、S.scabrisporus、S.sclerotialus、S.scopiformis、S.scopuliridis、S.sedi、S.seoulensis、S.septatus、S.seranimatus、S.setae、S.setonii、S.shaanxiensis、S.shenzhenensis、S.showdoensis、S.silaceus、S.sindenensis、S.sioyaensis、S.sodiiphilus、S.somaliensis、S.sparsogenes、S.sparsus、S.specialis、S.spectabilis、S.speibonae、S.speleomycini、S.spheroides、S.spinoverrucosus、S.spiralis、S.spiroverticillatus、S.spitsbergensis、S.spongiae、S.sporocinereus、S.sporoclivatus、S.spororaveus、S.sporoverrucosus、S.staurosporininus、S.stelliscabiei、S.stramineus、S.subrutilus、S.sulfonofaciens、S.sulphureus、S.sundarbansensis、S.synnematoformans、S.syringium、S.tacrolimicus、S.tanashiensis、S.tateyamensis、S.tauricus、S.tendae、S.termitum、S.thermoalcalitolerans、S.thermoautotrophicus、S.thermocarboxydovorans、S.thermocarboxydus、S.thermocoprophilus、S.thermodiastaticus、S.thermogriseus、S.thermolineatus、S.thermonitrificans、S.thermospinosisporus、S.thermoviolaceus、S.thermovulgaris、S.thinghirensis、S.thioluteus、S.torulosus、S.toxytricini、S.tricolor、S.tritolerans、S.tubercidicus、S.tuirus、S.turgidiscabies、S.umbrinus、S.variabilis、S.variegatus、S.varsoviensis、S.vastus、S.venezuelae、S.vietnamensis、S.vinaceus、S.vinaceusdrappus、S.violaceochromogenes、S.violaceolatus、S.violaceorectus、S.violaceoruber、S.violaceorubidus、S.violaceus、S.violaceusniger、S.violarus、S.violascens、S.violatus、S.violens、S.virens、S.virginiae、S.viridiflavus、S.viridiviolaceus、S.viridobrunneus、S.viridochromogenes、S.viridodiastaticus、S.viridoflavum、S.viridosporus、S.vitaminophilus、S.wedmorensis、S.wellingtoniae、S.werraensis、S.willmorei、S.xanthochromogenes、S.xanthocidicus、S.xantholiticus、S.xanthophaeus、S.xiamenensis、S.xinghaiensis、S.xishensis、S.yanglinensis、S.yanii、S.yatensis、S.yeochonensis、S.yerevanensis、S.yogyakartensis、S.yokosukanensis、S.youssoufiensis、S.yunnanensis、S.zaomyceticus、S.zinciresistensに属する微生物が挙げられる。このうち、ストレプトマイセス ロケイ(Streptomyces rochei)、ストレプトマイセス グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトマイセス パルバルス(Streptomyces parvulus)、ストレプトマイセス カリフォルニカス(Streptomyces californicus)、ストレプトマイセス アルボビナセウス(Streptomyces albovinaceus)及びストレプトマイセス カンジダス(Streptomyces candidus)に属する微生物が好ましい。 本発明に用いられる微生物の好ましい具体例としては、ストレプトマイセス sp.ARDB−1(NITE P−1162)、ARDB−2(NITE P−1163)、ARDB−3(NITE P−1164)株、及びそれらの突然変異体が挙げられる。ここで、突然変異体には、自然発生突然変異体及び通常の物理的、化学的手段による突然変異体が含まれる。 上記のボレリジンを産生する微生物の選抜法としては、土壌、根圏土壌、バレイショ塊茎表面、堆肥、腐葉土、河川水など任意の自然環境に存在する分離源サンプルから単離した微生物を培養し、その培養液中からボレリジン量を測定する方法が挙げられる。この場合用いる培地に特に制限はないが、オートミール・カザミノ酸添加培地、Tryptic Soy Brothなどが好ましい。また、分離源としては特に制限はないが、緑肥への定着性の面から緑肥作物の根圏土壌や、バレイショへの定着性の面からバレイショ表面およびその付着土壌が好ましい。 また、試料を、ボレリジンを含有する選択培地に接種し、コロニーを形成できる微生物をボレリジン産生株の候補として選抜することもできる。この場合、培地中のボレリジン濃度は0.1〜100μg/mLとするのが好ましく、1〜35μg/mLとするのが特に好ましい。 これらの微生物を増殖させる場合、また、これらの微生物を用いて一般式(1)のボレリジン類またはその塩を製造するには、通常のストレプトマイセス属微生物が増殖する条件で培養を行えばよい。培地には、ストレプトマイセス属微生物の増殖に必要な炭素源、窒素源、ビタミン源、ミネラル源等を添加するのが好ましい。炭素源としては、グルコース、水飴、可溶性デンプンなどが用いられる。窒素源としては、カザミノ酸、カゼイン酵素分解物、大豆酵素分解物、オートブラン、小麦フスマ、米糠、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、アミノ酸液、大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることが出来る。炭素源及び窒素源の双方を兼用するものとして、オートミール、小麦全粒粉等を用いることが出来る。ミネラル源としては、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩などを用いることが出来る。培地は固形培地でもよいし、液体培地でも良い。液体培養の場合は、振盪培養、撹拌培養を行えばよい。 培養条件としては好気的条件で、8〜45℃、pH3.2〜9.5が好ましい。培養時間は24〜240時間でよい。 前記培養により、培地中に菌体が増殖し、ボレリジン類又はその塩が蓄積するので、これら培養液をそのまま用いることが出来る。また、菌体と培養液を常法により分離して、それぞれ使用することもできる。 また、上記ボレリジン類又はその塩を含む培養物から、多孔性合成吸着剤、イオン交換樹脂、溶媒抽出等によってボレリジン類又はその塩を部分精製又は精製単離して利用することも出来る。 例えば、当該培養液はポリスチレン系合成吸着剤、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤又はメタクリル系合成吸着剤に吸着させた後、アルコール又はケトン水溶液で溶出することによって濃縮液を得ることができる。 また、例えば、当該濃縮液は酢酸エチル、ジエチルエーテル、n−ブタノールなどの有機溶媒と混和、分離することによって有機溶媒中にボレリジン類又はその塩を濃縮することができる。 上記菌体を用いる場合は、液体培養後、遠心分離により沈殿を回収し、通常用いられる保護剤を加えて凍結乾燥したものを用いることが出来る。保護剤としては例えばスキムミルク、トレハロースなどを挙げることが出来る。 ボレリジンの単離物は以下の方法により、各種アルキルエステルに変換することも出来る。すなわち、ボレリジン(b−1)を原料として、例えば硫酸、p−トルエンスルホン酸などの酸触媒の存在下にて、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール(R2OH)中、加熱還流することによって、化合物(b−2)を得ることが出来る。この時、ボレリジン(b−1)の初濃度に特に制限はないが、例えば1〜20質量%、特に5〜10質量%であることが好ましい。反応後、反応液から生成物を採取するには、反応溶媒を留去し、水と混合しない生成物可溶性有機溶媒と水を加え、有機溶媒層を回収後、アルカリ水溶液、例えば飽和炭酸ナトリウム水溶液で、洗浄し、次いで水で洗浄した後乾燥し、有機溶媒を留去した後、必要に応じて単一もしくは混合溶媒から再結晶すればよい。また、必要に応じてHPLCによって単離すればよい。(式中、R2はアルキル基を示す) ボレリジン類又はその塩は、後記実施例に示すように、優れたジャガイモそうか病菌の生育抑制効果を有し、ジャガイモそうか病の発病を抑制する効果に優れる。また、ボレリジン類又はその塩のジャガイモそうか病抑制効果は、ボレリジン類又はその塩を直接用いても得られるが、ボレリジン類又はその塩を産生する微生物、当該微生物の培養物、又は当該微生物を接種した植物を用いても得られる。従って、本発明のジャガイモそうか病抑制剤及び抑制方法は、ボレリジン類若しくはその塩、ボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物、ボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物の培養物、又はボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物を接種した植物を用いることができる。 上記によって得られたボレリジン類又はその塩、ボレリジン類又はその塩を含有する培養物や、その培養物の精製物はそのまま土壌に混和してもよいが、粉剤、粒剤、水和剤、乳剤、ペースト剤等、通常用いられている担体を利用して製剤化してもよい。 例えば、固体担体としては、植物質粉末(小麦粉、コーングリッツ、大豆粉、小麦フスマ、オートブラン、デンプン、結晶セルロース、米糠、菜種油粕、大豆油粕、脱脂米糠等)、鉱物質粉末(バーミキュライト、ゼオライト、カオリン、クレー、ベントナイト、タルク、ケイソウ土等)、高分子化合物(ポリビニル酢酸樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、石油樹脂等)、更に、アルミナ、ワックス類等を使用することが出来る。また、液体担体としては、例えば、アルコール類(メタノール、エタノール、プロパノール等)、エーテル類(ジオキサン、テトラヒドロフラン等)、エステル類(酢酸エチル、酢酸ブチル等)、又は水等を使用することができる。 本発明のジャガイモそうか病抑制剤を水溶液又は懸濁液とした場合のpHは、2〜8となるのが好ましく、当該pHを調整する緩衝剤としては、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸などの無機塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は2種以上組み合わせて用いてもよく、さらに他のpH調整剤と適宜組み合わせてもよい。 本発明のジャガイモそうか病抑制剤はそのまま土壌処理してもよく、農薬、肥料、土壌改良資材、堆肥等と混用してもよい。特に農薬としてはジャガイモそうか病抑制効果を持つD−D剤、オキシテトラサイクリン剤、ストレプトマイシン剤、オキソリニック酸剤、カスガマイシン剤、カーバム剤、チオファメートメチル剤、ダゾメット剤、トルクロホスメチル剤、フルスルファミド剤、フルアジナム剤、銅水和剤などと併用することが望ましいことは言うまでもない。 また、上記によって得られたボレリジン類又はその塩、ボレリジン類又はその塩を含有する培養物や、その培養物の精製物を土壌混和用として使用する場合の使用濃度は、土壌中のボレリジン類又はその塩の濃度として0.01〜100ppm、より好ましくは0.1〜10ppmの範囲とすることができる。この場合、播種前にあらかじめ混合しておいてもよく、生育期間中に散布あるいは灌注してもよい。 投与時期も特に制限はないが、バレイショ作付け直前や塊茎形成期に処理することが特に有効である。 ボレリジン類又はその塩を産生する微生物は直接土壌に混和してもよく、ジャガイモ(種バレイショ)に接種してもよく、また植物に接種してもよい。 直接土壌に施用する場合は、菌体をそのまま土壌に混和してもよく、培養液と合わせて混和しても良いが、さらに粉剤、粒剤、水和剤など、通常用いられている担体を利用して製剤化しても良い。 例えば、固体担体としては、植物質粉末(小麦粉、コーングリッツ、大豆粉、小麦フスマ、オートブラン、デンプン、結晶セルロース、米糠、菜種油粕、大豆油粕、脱脂米糠等)、鉱物質粉末(バーミキュライト、ゼオライト、カオリン、クレー、ベントナイト、タルク、ケイソウ土等)、高分子化合物(ポリビニル酢酸樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、石油樹脂等)、更に、アルミナ、ワックス類等を使用することが出来る。この中で、オートブラン、小麦フスマ、米糠が好ましい。また、液体担体としては、例えば水等を使用することができる。 上記微生物を水溶液又は懸濁液とした場合のpHは、5〜8となるのが好ましく、当該pHを調整する緩衝剤としては、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸などの無機塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は2種以上組み合わせて用いてもよく、さらに他のpH調整剤と適宜組み合わせてもよい。 また、上記微生物を土壌混和用として使用する場合、土壌中の当該微生物数は乾土1g当り105〜109c.f.u.(Colony forming unit,以下CFU)、より好ましくは107〜108CFUの範囲とすることができる。この場合、播種前にあらかじめ混合しておいてもよく、生育期間中に散布あるいは灌注してもよい。 投与時期も特に制限はないが、バレイショ作付け直前や塊茎形成期に処理することが特に有効である。 また、上記の微生物をバレイショに接種する場合は、溶液中の当該微生物数は1mL当り106〜108CFU、より好ましくは108CFUとすることができる。この場合、溶液に展着剤、例えばカルボキシメチルセルロースを加え、種バレイショを浸漬して植え付けることができる。 また、上記の微生物を植物に接種し、その植物を混和して使用することも出来る。この場合は、当該植物の種子に接種してもよいし、当該植物が生育中に接種してもよく、当該植物を生育させた後、地上部を刈り倒した後に接種してもよい。土壌混和は当該植物が生育中に行ってもよいし、刈り倒した後に行っても良い。その場合、土壌混和前に植物地上部はチョッパー、モアーなどで細断することが望ましい。植物生育中あるいは生育後に接種する場合は、上記微生物を水で懸濁したものを通常用いられる農薬散布用スプレーヤーで散布することもできる。この場合、散布液中の当該微生物密度が1mL当り107〜1010CFU、より好ましくは108〜1010CFUの範囲とすることができる。また、散布液量は土地面積1ha当り100〜10,000L、より好ましくは400〜1,000Lの範囲とすることができる。 この場合用いられる植物は特に限定されないが、例えば、一般に緑肥作物として用いられているものが好ましい。具体例としては、エンバク野生種(Avena strigosa)、エンバク(Avena sativa)、クリムソンクローバ(Trifolium incarnatum)、シロガラシ(Sinapis alba)、ハイブリッド・ソルガム(Sorghum bicolor×S. sudanense)、カラシナ(Brassica juncea)、アカクローバ(Trifolium pratense)、ハゼリソウ(Phacelia tanacetifolia)、ウーリーポッドベッチ(Vicia villosa ssp. dasycarpa)、スーダングラス(Sorghum sudanense)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、ライムギ(Secale cereale)、トウモロコシ(Zea mays)、イタリアンライグラス(Lolium multiflorum)、センチピードグラス(Eremochloa ophiuroides)、ナギナタガヤ(Vulpia myuros)、ヘアリーベッチ(Vicia villosa)、レンゲ(Astragalus sinicus)、クロタラリア(Crotalaria juncea、C.spectabilis)、セスバニア(Sesbania rostrata、S. cannabina)、ダイカンドラ(Dichondra micrantha)、ギニアグラス(Panicum maximum)、アニュアルライグラス(Lolium multiflorum)、バヒアグラス(Cynodon dactylon)、トールフェスク(Festuca arundinacea)、ケンタッキーブルーグラス(Poa pratensis)、シロクローバ(Trifolium repens)、ライコムギ(×Triticosecale)、ソバ(Fagopyrum esculentum)、マリーゴールド(Tagetes erecta)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、ヒエ(Echinochloa esculenta)、エビスグサ(Senna obtusifolia)等が挙げられる。また、スイートコーン(Zea mays)は雌穂を収穫後、地上部を土壌混和することが出来るため緑肥作物と同様に好ましい。これらのうち、エンバク野生種(Avena strigosa)、エンバク(Avena sativa)、ハイブリッド・ソルガム(Sorghum bicolor×S. sudanense)、スーダングラス(Sorghum sudanense)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、ライムギ(Secale cereale)、トウモロコシ(Zea mays)、イタリアンライグラス(Lolium multiflorum)、センチピードグラス(Eremochloa ophiuroides)、ナギナタガヤ(Vulpia myuros)、ギニアグラス(Panicum maximum)、アニュアルライグラス(Lolium multiflorum)、バヒアグラス(Cynodon dactylon)、トールフェスク(Festuca arundinacea)、ケンタッキーブルーグラス(Poa pratensis)、ライコムギ(×Triticosecale)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、ヒエ(Echinochloa esculenta)などが特に好ましい。 次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。製造例1(ボレリジンの生産) オートミール(The Quaker Oats Company社製)20g/Lとカザミノ酸1g/L加えた培地をpH7.2に調整した後、オートクレーブ滅菌し、3L容ジャー3本に各2.5L分注した。この培地にあらかじめTryptic Soy Broth(ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下TSB)で前培養したストレプトマイセス sp.ARDB−1株を接種した。培養温度は27℃とし、撹拌回転数100rpmで10日間ジャーファーメンター[TS−M3L型ミニジャーファーメンターシステム、(株)高杉製作所製]で通気培養した。得られた培養液は以下の通り粗精製した。培養液を6,500rpm、30分で遠心分離し、上澄み液を塩酸でpH3.0に調整した。別途、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂ダイヤイオンHP20をプロパノールで洗浄した後、カラム(内径450mm×長さ550mm)に充填し、次いでpH3.0酢酸水を通液して調整した。本カラムに、上記上澄み液を流すことによってボレリジンを吸着した。カラムは30容量%イソプロパノール2Lで洗浄した後、99容量%イソプロパノール3Lでボレリジンを溶出した。溶出液はエバポレータで約500mLに濃縮し、酢酸エチルを混合・撹拌を3回繰り返すことによってボレリジンを抽出した。酢酸エチル層は無水硫酸マグネシウムで脱水した後、シリカゲル(ワコーゲルC100、和光純薬社製)を加えてから溶媒を留去した。このシリカゲルは別途n−ヘキサンで懸濁、充填したシリカゲルカラム(内径20mm×長さ250mm)の上部に重層した。このカラムはn−ヘキサン:酢酸エチル=6:4混合液1Lで洗浄し、次いでn−ヘキサン:酢酸エチル=2:8混合液1Lでボレリジンを溶出した。溶出液は濃縮、乾固し、少量の10容量%メタノールに溶解し、別途メタノールで洗浄後、10容量%メタノールを通液して調整したSepPak tC18カートリッジに通液することによってボレリジンを吸着した。カートリッジは40容量%メタノール20mLで洗浄した後、次いで99容量%メタノール20mLでボレリジンを溶出した。 このサンプルはHPLC[カラム,YMC ODS−A内径10mm×長さ250mm(YMC社製);移動相,80容量%メタノール;流速,3.0mL/分]を用いて精製し、ボレリジン保持時間相当画分(8〜14分)を分取した。さらに分取した画分はHPLC(カラム,YMC ODS−A内径10mm×長さ250mm;移動相,60容量%アセトニトリル;流速,3.0mL/分)を用いて精製し、ボレリジン保持時間相当画分(13〜16分)を分取した。さらに分取した画分はHPLC(カラム,YMC Phe内径10mm×長さ250mm;移動相,60容量%メタノール;流速,3.0mL/分)を用いて精製し、ボレリジン保持時間に相当する単一ピークを示す画分(9〜18分)を分取した。このピークの紫外部吸光極大は259nmで、試薬として販売されているボレリジン(Alexis社製,北海道和光純薬販売)と一致した。得られた画分は濃縮乾固し、五酸化二燐存在下、デシケータ内で減圧乾燥した結果、ボレリジンの結晶3.1mgを得た。この結晶についてEMS−MS(負イオン)によって質量分析を行ったところ、m/z488.3002に脱プロトン分子(M−H)−が認められた。この質量数について組成演算を行った結果、誤差1.6mDaでC28H43NO6が得られ、ボレリジンと一致した。また、1H−NMR(600MHz)・13C−NMR(150MHz)の化学シフトを表1に示したが、この内容はボレリジンの化学構造を支持した。この結果から、上記培養液中のボレリジン濃度は0.4mg/Lと算出された。 これらの結果から、ストレプトマイセス sp.ARDB−1株はボレリジン生産能を有することが確認され、この菌株を培養することによってボレリジン含有培養液を製造し、さらにこれを精製することによってボレリジンを製造できることが確認された。製造例2(別菌株) 500mL容バッフル付き三角フラスコに製造例1に示した培地を300mL入れ、オートクレーブ滅菌後、ストレプトマイセス sp.ARDB−2株を接種し、撹拌回転数60rpmで10日間振盪培養を行った。培養液は製造例1と同様に遠心分離し、以下の通り粗精製した。上澄を製造例1と同様に調整したHP20カラム(内径20mm×長さ250mm)に通液することによってボレリジンを吸着し、次いで30容量%イソプロパノール500mLで洗浄した後、99容量%イソプロパノール500mLでボレリジンを溶出した。溶出液はエバポレータで濃縮し、酢酸エチルを混合・撹拌を3回繰り返すことによってボレリジンを抽出した。酢酸エチル層は無水硫酸マグネシウムで脱水した後、濃縮し、製造例1と同様にSepPak tC18で精製した。この粗精製物はHPLC[カラム,YMC ODS−A内径10mm×長さ250mm(YMC社製);移動相,80容量%メタノール;流速,3.0mL/分]を用いて分析した。保持時間10.5分にピークが認められ、これはボレリジンの保持時間とほぼ一致した。また、紫外部吸光極大は258nmで、ボレリジンとほぼ一致した。ピーク面積から培地中のボレリジン濃度は0.2mg/Lと算出された。 以上の結果から、ARDB−2菌株はボレリジン生産能を有することが確認された。製造例3(培地種類) 500mL容バッフル付き三角フラスコにTSB、オートミール(The Quaker Oats Company社製)2%とカザミノ酸0.1%を混合した培地、オートミール2%とソイトン(Soytone、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製)0.3%を混合した培地を、各300mL準備し、pH7.2に調整後、オートクレーブ滅菌した。ここにあらかじめTSBで前培養したストレプトマイセス sp.ARDB−1株を接種した。培養温度は27℃とし、回転数80rpmで7日間振盪培養することによってボレリジンとボレリジン生産菌の混合物を得た。これをさらに6,500rpmで30分間遠心分離することによってボレリジン含有液を得た。 これらのボレリジン含有液中のボレリジン濃度を測定するため、培養液の上澄を製造例2と同様に粗精製し、HPLC[カラム,Jupiter C18 300Å内径10mm×長さ250mm(phenomenex社製);移動相,1容量%酢酸含有70容量%メタノール;流速,3.0mL/分]を用いて、ボレリジンに相当するピーク(保持時間,11.2分;紫外部吸光極大,259nm)の面積によって定量を行った。結果を表2に示した。 この結果から、上記のような様々な培地を用いてボレリジン生産菌とボレリジンを含有する培養液を調製できることが明らかとなった。製造例4(オートミール濃度) 500mL容バッフル付き三角フラスコにオートミール(The Quaker Oats Company社製)0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%とカザミノ酸0.1%を混合した培地をそれぞれ300mL準備し、pH7.2に調整後、オートクレーブ滅菌した。ここにあらかじめTSBで前培養したストレプトマイセス sp.ARDB−1株を接種した。培養温度は27℃とし、回転数80rpmで7日間振盪培養することによってボレリジンとボレリジン生産菌の混合物を得た。これをさらに6,500rpmで30分間遠心分離することによってボレリジン含有液を得た。 これらのボレリジン含有液中のボレリジン濃度を測定するため、培養液の上澄を製造例3と同様に粗精製・HPLC定量を行った。結果を表3に示した。 この結果から、ボレリジンを高含有させるためにはオートミール濃度は1〜2%が好ましいことが明らかとなった。製造例5(菌体スキムミルクFD) 製造例1と同様に調整した培養液を遠心分離し、沈殿した菌体に10重量%のスキムミルクに懸濁した後、凍結乾燥を行った。4℃で保存した後、凍結乾燥品中の当該菌数を希釈平板法で測定した。すなわち、凍結乾燥品を滅菌水に懸濁し、段階希釈した液をそれぞれ100μLずつデンプン培地(培地1L当りに寒天15g、デンプン10g、酵母エキス1g、サッカロース1g、塩化カリウム0.1g、リン酸水素一カリウム0.1g、硫酸マグネシウム七水和物0.1g、硝酸カリウム0.1gを溶解し、オートクレーブ滅菌したもの)に塗布した。25℃で7日間培養後、コロニー数を計測した結果を表4に示した。 凍結乾燥品中の当該菌数は105CFU/gであり、本方法によって凍結乾燥菌体を製造できることが確認された。製造例6(HP20粗精製物) オートミール(The Quaker Oats Company社製)10g/Lとカザミノ酸1g/L加えた培地をpH7.2に調整した後、オートクレーブ滅菌し、3L容ジャー3本に各2.5L分注した(計7.5L)。この培地にあらかじめTSBで前培養したストレプトマイセス sp.ARDB−1株を接種した。培養温度は27℃とし、撹拌回転数100rpmで10日間ジャーファーメンター[TS−M3L型ミニジャーファーメンターシステム、(株)高杉製作所製]で通気培養した。得られた培養液は6,500rpm、30分で遠心分離し、上澄み液を塩酸でpH3.0に調整した。別途、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂ダイヤイオンHP20をプロパノールで洗浄した後、カラム(内径450mm×長さ550mm)に充填し、次いでpH3.0酢酸水を通液して調整した。本カラムに、上記上澄み液を流すことによってボレリジンを吸着した。カラムは30容量%イソプロパノール2Lで洗浄した後、99容量%イソプロパノール3Lでボレリジンを溶出した。溶出液はエバポレータで約500mLに濃縮した。 この濃縮液中のボレリジン濃度を製造例3と同様に粗精製・HPLC定量を行った結果、16.3mg/Lであることが判明した。製造例7(バーミキュライト混合接種源) バーミキュライト・オートミール培地(バーミキュライト1L当たりに粉砕したオートミール5.14gと0.073質量%カザミノ酸350mLを混合したもの)2Lを、ミリシール[(株)アズワン社製]を貼ったオートクレーブバック(300mm×610mm)に詰め、オートクレーブ滅菌(121℃、60分を1日以上あけて2回)した。この培地に、デンプン培地で培養したストレプトマイセス sp.ARDB−1株を寒天片ごと接種し、25℃で6〜8週間培養した。培養物10gを90mLの滅菌水に懸濁し、室温で20分間振盪した後、希釈平板法を行った。 培養物中の当該菌数は3.2×108〜2.3×109CFU/g乾土であり、この培養物を4℃で5週間保存した後にも、同程度の生菌数が確認された。このことから、本方法によって菌体を含むバーミキュライト混合接種源を製造できることが確認された。実施例1(ボレリジンの効果の証明) 製造例1によって得られたボレリジンおよび試薬として販売されているボレリジン(Alexis社製,北海道和光純薬販売)それぞれ1mgをエタノール1mLに希釈し、直径8mmの濾紙ディスクに10μLおよび100μL添加し、減圧デシケータ内で乾燥させた(ディスク当たりのボレリジン量はそれぞれ10μgおよび100μgとなる)。これらのディスクをジャガイモそうか病菌Streptomyces turgidiscabies 94−3株を接種したデンプン培地に置床し、27℃で3日間培養した。培養後の阻止円の大きさ(3反復)を表5に示した。 その結果、市販されているボレリジンも製造例1によって得られたボレリジンも明確な阻止円を形成することから、ジャガイモそうか病菌の生育抑制作用を有することが明らかとなった。実施例2(2菌株のポット試験での効果の証明) ジャガイモそうか病菌(S.turgidiscabies 94−3株)を培地(黒ボク土2.4L、バーミキュライト1.2L、フスマ1.2L、オートミール60g、蒸留水1Lを混合し、硝石灰を14〜16g加えてpHを7.2に調整し、121℃、60分間のオートクレーブ滅菌を1日以上あけて2回行ったもの)で培養し、畑土(黒ボク土、川砂、ピートモスを体積比で7.7:2.3:5に混合したもの)に混合して、そうか病人工汚染土壌を作製した(そうか病菌数は7.4×106CFU/g乾土)。また、ストレプトマイセス sp.ARDB−1およびARDB−2株をバーミキュライト・オートミール培地で培養し、そうか病人工汚染土壌に5または10体積%混合した。これら土壌を3L不織布ポット[(資)桃木商店]に詰めてバレイショ品種「男爵いも」を植え付け、ポットごと圃場(北海道芽室町)に埋めて栽培した。3ヶ月後に新生塊茎のそうか病発生程度を調査した結果を表6に示した。 ARDB−1およびARDB−2株を施用したポットでは、ジャガイモそうか病の発病が軽減されたことから、ボレリジン産生能を有する微生物のバーミキュライト・オートミール培地培養物を土壌に混和することにより、ジャガイモそうか病の発病を抑制できることが明らかとなった。実施例3(圃場試験での効果の証明) ストレプトマイセス sp.ARDB−1株のバーミキュライト・オートミール培地培養物(当該菌数は約1.2×109CFU/g乾土)をそうか病汚染圃場(北海道芽室町、病原菌はS.turgidiscabies)のバレイショ根圏域(1株当たり30cm×30cm×15cm)に10体積%混合し、バレイショ品種「男爵いも」を植え付けた。3ヶ月後に新生塊茎のそうか病発生程度を調査した結果を表7に示した。 ARDB−1株施用区では、ジャガイモそうか病の発病が軽減されたことから、ボレリジン産生能を有する微生物のバーミキュライト・オートミール培地培養物を土壌に混和することにより、圃場においてもジャガイモそうか病の発病を抑制できることが明らかとなった。実施例4[菌体のみ(ボレリジン無し)の効果の証明] 2L容バッフル付き三角フラスコ8本にそれぞれTSB培地を500mL入れ、オートクレーブ滅菌後、ストレプトマイセス sp.ARDB−1株を接種し、25℃、撹拌回転数120rpm/分で3日間振盪培養を行った。培養液を8,000rpmで10分間遠心分離し、上澄み液を捨て、沈殿を滅菌水に懸濁することを繰り返して菌体を洗浄した。菌体は400mLの滅菌水に懸濁し、ホモジナイザー[エースホモジナイザーAM−3、(株)日本精機製作所製]で破砕した。菌体破砕液200mLは、遠心分離後、沈殿を150mLの0.1質量%カルボキシメチルセルロース(carboxymethylcellulose,以下CMC)に懸濁し、半分に切断した種バレイショ(品種「男爵いも」)を浸漬した。また、残りの菌体破砕液200mLは、遠心分離後、沈殿を540mLの0.1%CMCに懸濁し、105mLずつをバーミキュライト300mLと混合した。実施例2と同様に作製したそうか病人工汚染土壌(そうか病菌数は2.0×104CFU/g乾土)を3L不織布ポットに詰め、菌体破砕液に浸漬した種バレイショを植え付けた。また、そうか病人工汚染土壌に菌体破砕液を混合したバーミキュライトを10体積%混合し、ポットに詰めてバレイショ(品種「男爵いも」)を植え付けた。対照として、0.1%CMC浸漬種バレイショ播種区と、0.1%CMC添加バーミキュライト施用区を設けた。各ポットを圃場(北海道芽室町)に埋めてバレイショを栽培し、3ヶ月後に新生塊茎のそうか病発生程度を調査した結果を表8に示した。 ARDB−1株の液体培養菌体を土壌混和または種芋処理したポットでは、ジャガイモそうか病の発病が軽減されたことから、ボレリジン産生能を有する微生物の菌体を施用することにより、ジャガイモそうか病の発病を抑制できることが明らかとなった。実施例5(緑肥との併用による効果の証明) ジャガイモそうか病菌(S.turgidiscabies 94−3株)をバーミキュライト・オートミール培地で培養し、畑土に混合してそうか病人工汚染土壌を作製した(そうか病菌は4.6×106CFU/g乾土)。また、ストレプトマイセス sp.ARDB−1株も同様に培養し、そうか病人工汚染土壌に10体積%混合した(当該菌数は1.5×107CFU/g乾土)。これら土壌を3L不織布ポットに詰め、エンバク野生種(Avena strigosa)、エンバク(Avena sativa)を播種し、温室(18℃、明期14時間/暗期10時間)で2ヶ月間栽培した。エンバク野生種、エンバクの根および葉を細断して土壌と混合した後、水分を補給しながら3週間放置した。エンバク野生種およびエンバクを再度播種して、栽培と植物体の土壌混合を繰り返した土壌にバレイショ品種「男爵いも」を植え付け、3ヶ月後に新生塊茎のそうか病発生程度を調査した。結果を表9に示した。 エンバク野生種およびエンバク栽培は、後作バレイショのそうか病発病軽減効果があることが知られているが、これら緑肥単独よりも、ボレリジン産生微生物を組み合わせることにより、高い発病抑制効果が得られることが明らかとなった。実施例6(作物との併用による効果) ストレプトマイセス sp.ARDB−1株をバーミキュライト・オートミール培地で培養し、畑土に混合して3L不織布ポットに詰め(当該菌数は1.4×107CFU/g乾土)、エンバク野生種(Avena strigosa)、コムギ(Triticum aestivum)、バレイショ(Solanum tuberosum)、テンサイ(Beta vulgaris)、ダイズ(Glycine max)を栽培し、温室(18℃、明期14時間/暗期10時間)で4ヶ月間栽培した。回収した根圏土壌からDNAを抽出し、当該菌のリボソームRNA遺伝子のITS領域をプライマーとした競合的Qprobe−PCR法を行って、当該菌遺伝子のコピー数を定量した。各種作物の栽培期間中に増減した当該菌遺伝子数を表10に示した。 エンバク野生種(Avena strigosa)、コムギ、バレイショの根圏土壌では、ARDB−1株の遺伝子数が増加していたことから、これら作物の併用は、接種したボレリジン産生微生物の菌数を増加させ、土壌への定着性を高める効果があることが明らかになった。製造例8(ボレリジンメチルエステルの合成) ボレリジン500μg(Alexis社製,北海道和光純薬販売)にメタノール10mLを加え、室温で撹拌しながらパラトルエンスルホン酸20μgを加え、62−64℃に加温し、2時間撹拌した。冷却後、pH8.0とし、水と酢酸エチルを加えて分液した。酢酸エチル相は無水硫酸マグネシウムで脱水、乾燥後、減圧化にて酢酸エチルを留去した。この画分は製造例3と同様の条件でHPLCに供試し、未反応のボレリジン(保持時間10〜12.5分で溶出)と合成されたボレリジンメチルエステル(保持時間13〜15.5分で溶出,ピークトップの保持時間14.1分;紫外部吸光極大261nm)を分取した。ボレリジンメチルエステル画分は減圧乾固した結果、収量は70μgであった。実施例7(ボレリジンエチルエステルの効果の証明) 製造例8によって得られたボレリジンメチルエステル50μgをエタノール500μLで溶解し、直径8mmの濾紙ディスクに100μL添加し、減圧デシケータ内で乾燥させた(ディスク当たりのボレリジンメチルエステル量は10μgとなる)。このディスクを実施例1と同様にデンプン培地上でジャガイモそうか病菌に対する阻止円形成活性を検討した。結果は表11に示した。 ボレリジンメチルエステルも明確な阻止円を形成することから、ジャガイモそうか病菌の生育抑制作用を有することが明らかとなった。実施例8(土壌中からのボレリジン生産菌の選抜法) エンバクを2回作付し、その後、ソルガム品種「つちたろう」[雪印種苗(株)]を栽培した圃場(宮崎県都城市)から土壌を採取し、2mm×2mmの篩で植物残渣を除去した。土壌10gを90mLの滅菌水に懸濁し、25℃で30分間振盪した後、段階希釈液を作製した。一方、希釈PTYGA培地[培地1L当りにバクトプロテアーゼペプトン(Difco社製)0.25g、バクトトリプトン(Difco社製)0.25g、酵母エキス(Difco社製)0.5g、グルコース0.5g、硫酸マグネシウム七水和物30mg、塩化カルシウム二水和物3.5mgを溶解し、pH7.0に調整した後、寒天15gを加えてオートクレーブ滅菌したもの]に、エタノールに溶解したボレリジン(5mg/mL)を1プレート当たり100μL添加し、素早くコンラージ棒を用いて均一に塗布し、溶液を風乾した。この培地に上記土壌懸濁液を接種し、30℃で8日間培養後、生育してきたボレリジン耐性放線菌のコロニーを単離した。単離したコロニーについては別途希釈PTYGA培地に移植し、ジャガイモそうか病菌S.turgidiscabies Sy9113株の懸濁液を噴霧接種し、抗菌性の有無を生育阻止円の形成によって確認した。抗菌性を示した28株については,製造例4中のオートミール1.0%とした培地で培養し、培養液の上澄を製造例3と同様に粗精製し,HPLCによって定量した。その結果、1菌株が2.85μg/Lのボレリジンを生産していることが確認された。 以上のことから、ボレリジン添加培地を用いることによって効率よくボレリジン生産菌を選抜することができることが明らかとなった。実施例9(培養液粗精製物による効果の証明) 帯広川西地区のジャガイモそうか病重度発生土壌を採取し、風乾後、5mm×5mmの篩で粗大物を除去し、1/2000aワグナーポットに充填した。一方で、2つ切りにして浴光催芽してあったバレイショ品種「男爵いも」を植え付け、温室内で栽培した。出芽7日後にはさらに同じ土壌を10cmの高さで添加した。栽培開始後から2週間に1回の割合で、製造例6の通り調整した培養液粗精製液を2倍希釈したものをポット当たり500mL潅注処理し、対照区には水500mLを潅注した(各2反復)。この処理は計4回行った。ジャガイモそうか病の発生を誘発するために、栽培中の潅水は下位葉がやや萎れたことを確認してから十分潅水するという方法を繰り返した。地上部が枯凋してから塊茎をサンプリングし、ジャガイモそうか病により陥没した病斑をカウントした結果を表12に示した。 ボレリジンを含有する培養液のHP20粗精製物のみでも生育中に潅注処理することにより、ジャガイモそうか病を抑制できることが明らかとなった.実施例10(菌体コーティング緑肥種子による効果の証明) 製造例4中のオートミール1.0%とした培地に、あらかじめTSBで前培養したストレプトマイセス sp.ARDB−1株を接種し、27℃、回転数80rpmで7日間振盪培養した。培養液を遠心分離し、沈殿した菌体を少量の滅菌水に懸濁した。エンバク野生種(Avena strigosa)の種子を菌体懸濁液に10分間浸漬した後、陰干しした。実施例5と同様に作製したそうか病人工汚染土壌(そうか病菌はS.turgidiscabies KHH1−1−3株、2.0×104CFU/g乾土)を3L不織布ポットに詰め、菌体懸濁液に浸漬したエンバク野生種種子を播種した。対照として、菌体懸濁液に浸漬していないエンバク野生種種子の播種区と、菌体懸濁液を土壌に滴下する区を設けた。各ポットを圃場(宮崎県都城市)に埋め、2ヶ月後にエンバク野生種の根および葉を細断して土壌と混合し、3週間放置した後、全てのポットにバレイショ品種「ニシユタカ」を植え付けた。3ヶ月後に新生塊茎のそうか病発生程度を調査した結果を表13に示した。 種子に付着する菌体は微量であるが、菌体懸濁液に浸漬したエンバク野生種の種子を用いると、エンバク野生種の種子を用いるよりも高い発病抑制効果が得られることが明らかとなった。 一般式(1)(式中、R1はヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)で表されるボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物を含有するジャガイモそうか病抑制剤。 一般式(1)(式中、R1はヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)で表されるボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物を用いるジャガイモそうか病抑制方法。 ボレリジン類若しくはその塩、ボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物、ボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物の培養物、又はボレリジン類若しくはその塩を産生する微生物を接種した植物を用いる請求項2記載のジャガイモそうか病抑制方法。 ストレプトマイセス sp.ARDB−1(NITE P−1162)、ストレプトマイセス sp.ARDB−2(NITE P−1163)、ストレプトマイセス sp.ARDB−3(NITE P−1164)又はそれらの突然変異体。 ボレリジン類又はその塩を含有する培地で試料を培養し、生育する微生物を選抜することを特徴とするボレリジン類又はその塩を生産する微生物の選抜方法。 【課題】新たなジャガイモそうか病抑制剤の提供。【解決手段】一般式(1)(式中、R1はヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す)で表されるボレリジン類、その塩又はそれらを産生する微生物を含有するジャガイモそうか病抑制剤。【選択図】なし


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