生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_次世代シークエンサーのためのＤＮＡライブラリー調製方法 |
| 出願番号： | 2014052203 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C12N 15/00 |
特許情報キャッシュ
細道 一善 井ノ上 逸朗 光永 滋樹 JP 2015173626 公開特許公報(A) 20151005 2014052203 20140314 次世代シークエンサーのためのＤＮＡライブラリー調製方法 ジェノダイブファーマ株式会社 504383519 内田 直人 100149294 細道 一善 井ノ上 逸朗 光永 滋樹 C12N 15/09 20060101AFI20150908BHJP C12N 15/00 20060101ALI20150908BHJP JPC12N15/00 AC12N15/00 2 2 ＯＬ 11 4B024 4B024AA20 4B024CA01 4B024CA09 4B024CA11 4B024CA20 4B024HA20 本発明は、次世代ＤＮＡシークエンサーを用いたＤＮＡタイピングに供するＤＮＡライブラリーの調製方法に関する。 現在、様々なタイプの次世代シークエンサーが市場に出回っており、ヒトゲノムの解析、遺伝子発現解析などの研究に使用されるに至っている。 「次世代シークエンサー（シーケンサー）：ＮＧＳと略記することもある」、「新型シークエンサー」あるいは「超高速シークエンサー」などの呼称は、従来のサンガー法（ジデオキシ法）に基づくマイクロキャピラリーシークエンサー（ＳＢＴ）との対比において用いられている。次世代シークエンサーと呼ばれるＤＮＡシークエンサーは、少量のＤＮＡサンプルに基づいて、高速で大量のＤＮＡ断片を自動的に解析するという点では一致するが、採用されているシークエンス手法は機種によって異なっている。 現在汎用されている次世代シークエンサーで採用されているシークエンス手法の代表例は「逐次合成シークエンシング（sequencing by synthesis: ＳＢＳ）」であり、ＤＮＡ断片をテンプレートとして１塩基ずつ再合成するときの蛍光強度等を検出して塩基配列が決定される。 実際に行われる工程は、（１）サンプルからＤＮＡを抽出し、（２）抽出したＤＮＡを大量並列シークエンスに適するように断片化してＤＮＡライブラリーを作成し、（３）ライブラリーのＤＮＡ断片の次世代シークエンサーに供して塩基配列を解読することを含む。ここで、各ＤＮＡ断片の塩基配列の単位を「リード」と呼ぶことがある。次いで、（４）ゲノム配列が既知の生物種の場合は、データベース等を利用して前記リードをリファレンス配列にマッピングして比較するリシークエンス、ゲノム配列が不明な生物種の場合は、新たにアセンブルを行って配列決定するｄｅ ｎｏｖｏシークエンスが行われる。 次世代シークエンサーにおける大量並列シークエンスを精度良くかつ均一に行うためには、（２）で作成するＤＮＡライブラリーの調製におけるＤＮＡ断片のサイズ（長さ）及び濃度の調整が重要である。 例えば、イルミナ社の次世代シークエンサーであるＭｉｓｅｑ（商品名）には、その装置に特化したＮｅｘｔｅｒａサンプル調製キット（商品名）が市販されている。Ｎｅｘｔｅｒａサンプル調製キットを用いたライブラリー調製では、サンプルから抽出されたＤＮＡの断片化と末端のタグ化が同時に行われ、タグを介してビーズに結合したＤＮＡ断片をエマルジョンＰＣＲにより増幅した後、磁気ビーズ（ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ：商品名）を用いて反応夾雑物及び長すぎるＤＮＡ断片を除去することができる。 本発明者等は、極めて多型性に富み、医学的にも重要なヒトＨＬＡ遺伝子領域のゲノム塩基配列を、次世代シークエンサー（Ｍｉｓｅｑ）及びＮｅｘｔｅｒａサンプル調製キットを用いて完全に決定することに成功した（非特許文献１）。しかしながら、同じキットを使用しても、ＰＣＲ産物の量によって得られるライブラリーに含まれる断片のサイズが異なる、また、前記キットを使用し調製したＤＮＡ断片のサイズ分布範囲が広すぎる、という問題が生じていた。 前記特許文献１では、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等によって断片サイズ（長さ）に応じて展開させた後、そのアガロースゲルの所望のサイズ（５００ｂｐ〜２０００ｂｐ）に該当する部分を切り出すことによりサイズ（長さ）調節を施すことによりタイピングの精度／有効性を向上させることができた。しかしながら、かかる作業は非常に煩雑で時間を要するものであった。 さらに、一般にサンプル（ＤＮＡライブラリー）は多数の容器（例えば、９６ウェル、３８４ウェル）を備えたプレート上で調製されるが、従来の調製方法では、同様の操作をしても各ウェル毎にサンプルに含まれるＤＮＡ濃度（量）が相違することは避けられない。一方、次世代シークエンサーにおけるタイピングの精度を向上させるには、ＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片は均一な濃度であることが望ましい。そこで従来は、調製したライブラリーをバイオアナライザー等で検査して、濃度のばらつきを調節するという煩雑な操作が必要であった。Ｋ．Ｈｏｓｏｍｉｃｈｉ等、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１４巻、３５５頁（２０１３年） よって本発明は、上記のような従来技術の欠点を克服し、簡便かつ短時間にＤＮＡライブラリーに含まれるＤＮＡ断片のサイズのみならず濃度を均一に調節することができ、もって次世代シークエンサーに供するのに適したＤＮＡライブラリーを調製することができる方法を提供することを課題とする。 前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片の磁気ビーズを用いた精製において、ＰＣＲ反応液と混合する磁気ビーズの比率を調節することにより長すぎる断片及び短すぎる断片を両方とも除去し、ＤＮＡ断片の長さを選択すること、さらにはライブラリーに含まれるＤＮＡ濃度を均一化することができることを見出した。この一連の操作の組み合わせによりモル濃度が均一化されることをＤＮＡ断片の長さと濃度を測定するバイオアナライザーの結果およびＭｉＳｅｑから得られるシーケンスデータ量により確認することで、本発明を完成した。 即ち本発明は、以下の工程を含むＤＮＡライブラリーの調製方法を提供する。（１）試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と第１の所定比率で混合して、必要とする範囲の上限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を回収する工程；（２）前記（１）で回収した上清を、磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、必要とする範囲の下限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程；及び（３）前記（２）で回収したＤＮＡ断片を、前記（１）及び（２）で使用した磁気ビーズ分散液の希釈液と混合し、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程。 本発明の方法では、疎水性相互作用を増大させた水性媒体に磁気ビーズを浮遊させた磁気ビーズ分散液を用いたサイズ選択及び濃度調整により簡便にＤＮＡ断片長分布の縮小及び濃度範囲の均一化が達成されるので、極めて短時間で多検体のＤＮＡライブラリーを調製することができる。得られたＤＮＡライブラリーは次世代シークエンサーでの多検体解析におけるデータ量の均一化を実現することから、高精度のタイピングに適したものとなる。実施例１で調製した磁気ビーズ分散液とＤＮＡサンプルとの混合比率と、磁気ビーズに結合するＤＮＡサイズ（長さ）との相関を示す図表である。一定量のＤＮＡサンプルに加える磁気ビーズ分散液の比率を０．４倍（ａ）及び０．５倍（ｂ）としたとき、並びに本発明の工程（１）及び（２）でサイズ選択を施した場合に得られたＤＮＡ断片のサイズ分布を示すグラフである。磁気ビーズ分散液の希釈率と、単位容量の磁気ビーズ分散液に結合するＤＮＡ量との相関を示すグラフである。本発明の工程（３）に従う濃度調節（ノーマライゼーション）を実施する前（ａ）及び実施した後（ｂ）のウェル間でのＤＮＡ濃度の均一性を示すグラフである。本発明の工程（３）に従ってノーマライゼーションを実施した９６サンプルに含まれるＤＮＡ量の分布を示す図である。従来のアガロースゲルを用いたサイズ選択を実施した９６サンプルに含まれるＤＮＡ量の分布を示す図である。 以下に、本発明のＤＮＡライブラリー調製方法を工程毎に詳細に説明する。 まず、本発明の調製方法の工程（１）では、次世代シークエンサーでタイピングすべきＤＮＡを含むサンプルから調製されるＤＮＡ断片（試験すべきＤＮＡ断片）を含むサンプルを用いる。 本発明において「試験すべきＤＮＡ断片」とは、被験体から取得したサンプルから抽出し、断片化し、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片である。このＤＮＡ断片を調製する方法は特に限定されず、エマルジョンＰＣＲ等の当該技術分野で既知の手法を用いて調製してよい。 工程（１）においては、試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と第１の所定比率で混合する。 本発明で用いられる「磁気ビーズ分散液」は、ＰＣＲ増幅反応を行った際に得られるような、ＤＮＡと、残存するｄＮＴＰや塩、プライマーやプライマーダイマーなどの夾雑物を含む反応混合物からＤＮＡを精製する際に使用されている磁気ビーズ分散液でよい。 磁気ビーズ分散液に含まれる磁気ビーズは、特に限定されないが、ビーズの粒子表面にＤＮＡを可逆的に結合させることのできる常磁性微小粒子であり、約１．０μｍ程度の均一な粒子径を有する粒子が好ましい。例えば、可逆的固相法（Solid Phase Reversible Immobilization: SPRI）の原理を利用した磁気ビーズ（Agencourt（商標）SPRI（商標））等が好ましく用いられる。このＳＰＲＩ磁気ビーズは、ポリスチレン製のコアに、約４０％の鉄成分を含有するマグネタイト（磁鉄鉱）層を被覆し、更にカルボン酸修飾ポリマーで表面を被覆したコア−シェル構造を有する直径１．０μｍ±８％の磁気ビーズである。 本発明で最も好ましく使用されるのは、前記ＳＰＲＩ磁気ビーズを、好ましくは２０重量％のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ８０００）及び２．５Ｍのアルカリ金属塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み疎水性相互作用を増大させた水性媒体中に分散させた磁気ビーズ分散液である。この磁気ビーズ分散液としては、「ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ」という商品名で市販されているものを使用することができる。なお、ポリエチレングリコール及びアルカリ金属塩の種類及び濃度は、本発明の効果を奏する範囲内で適宜調整可能である。 従来の「ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ」は、精製されるサンプル量（μＬ）に対して１．８倍量の磁気ビーズ分散液を用いることにより、サイズの大きいＤＮＡを除去する工程で用いられていた。本発明では、試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプル量と混合する磁気ビーズ分散液との比率（容量比率）を変えることによりビーズに吸着されるＤＮＡサイズが変化することに着目し、従来の比率より大幅に低い第1の所定比率で混合することにより、ＤＮＡサイズの上限値を、次世代シークエンサーでのタイピングに適した「必要な範囲」の上限、例えば約１０００ｂｐとすることができた。 本発明の方法の工程（１）で採用される第１の所定比率は、０．３〜０．５、好ましくは０．３５〜０．４５、最も好ましくは約０．４である。試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルに約０．４の比率で磁気ビーズ分散液を混合し、ピペッティングで十分に攪拌した後に静置すると、約１０００ｂｐを超えるサイズのＤＮＡ断片は磁気ビーズに結合し、上清中には約１０００ｂｐ以下のＤＮＡ断片が含まれることになる。 そこで、マグネットスタンド等を用いて磁気ビーズを分離し、上清を回収することにより約１０００ｂｐ以下のサイズのＤＮＡ断片を含むサンプルが得られる。 次に、本発明の方法の工程（２）においては、前記（１）で回収した上清、即ち、約１０００ｂｐ以下のサイズのＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、約５００ｂｐ以下のサイズのＤＮＡ断片を除去する。 前記工程（１）で述べたように、サンプルと磁気ビーズ分散液との配合比率を変えることにより、ビーズに吸着するＤＮＡのサイズが変化する。 この工程（２）においては、サンプルに対する磁気ビーズ分散液の配合比率を、工程（１）における第１の所定比率よりも高い第２の所定比率とすることによって、目的とするサイズの下限値に満たないサイズの短いＤＮＡ断片が除去される。 具体的な手法は工程（１）と同様であるが、工程（２）で採用する第２の所定比率は、０．４５〜０．６、好ましくは約０．５であり、上清を廃棄して磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する点で工程（１）とは異なる。 磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する方法は当該分野で通常用いられている方法でよく、例えば、溶出バッファを加えてＤＮＡ断片を磁気ビーズから溶出させ、溶出したＤＮＡ断片を回収することができる。このようにして、ＤＮＡ断片のサイズの下限値を次世代シークエンサーに適した「必要な範囲」の下限、例えば約５００ｂｐとすることができる。このようにして調製されたサンプルは、好ましくは約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を含んでいる。 なお、本発明におけるＤＮＡ断片サイズの「必要な範囲」とは、そのライブラリーを供する次世代シークエンサーによっても変化するが、一般的には、「必要な範囲」の下限値は約２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、及び８００ｂｐから選択され、上限値は約１０００ｂｐ、１２００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐから選択されるが、これらの値の近傍及び中間値から選択することもできる。 次に、本発明の調製方法の工程（３）では、前記工程（１）及び（２）を通して約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐの範囲にサイズ選択されたＤＮＡ断片を、希釈した磁気ビーズ分散液を用いて濃度調節する。 本発明で用いているＡＭｐｕｒｅ ＸＰ等の磁気ビーズは、ＤＮＡのサイズ選択に使用されていたが、その磁気ビーズ濃度を調節することによりサンプル中のＤＮＡ濃度を均一化できることは全く知られておらず予測もされていなかった。 本発明者等は、磁気ビーズ分散液に含まれる磁気ビーズ量（濃度）によって、磁気ビーズに結合するＤＮＡ量が変化することを見出し、この相関関係を利用することにより、断片サイズに依らずＤＮＡ濃度を均一化（ノーマライゼーション）することに成功した。 具体的には、前記工程（１）及び（２）で使用した磁気ビーズ分散液を、その媒体となる２０％ＰＥＧを含む水溶液で希釈した分散液を用いる。希釈率は、１０倍から４０倍、好ましくは１５〜３０倍、より好ましくは約２０倍である。４０倍以上に希釈した場合は、磁気ビーズが極めて少量になるため回収が困難になり好ましくない。 約２０倍に希釈した前記（１）及び（２）の所定濃度より低濃度で含む磁気ビーズ分散液と混合して静置し、マグネットスタンド等を用いて磁気ビーズを固定して上清を回収して廃棄する。残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収すれば、約５００〜１０００ｂｐのサイズを有するＤＮＡ断片を等濃度で含むサンプルを得ることができる。 上記の本発明の方法に従って調製されたＤＮＡライブラリーは、次世代シークエンサーを用いたタイピングに適した範囲のサイズのＤＮＡ断片を等濃度で含有しているため、次世代シークエンサーにおける塩基配列の読み取りの精度が向上し、より正確なタイピングが可能となる。 また、本発明のＤＮＡライブラリー調製方法は、磁気ビーズを用いた簡便な手法であり、従来の調製方法に比較して時間的及び人的コストを削減することができる。 以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。（実施例１）磁気ビーズ分散液の調製 Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭｐｕｒｅ ＸＰ（商標）１０００μＬを１２０００ｒｐｍで１分間遠心し、静置後、上清１０００μＬを廃棄して残りの磁気ビーズを回収した。 １００ｇのポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）及び７３ｇの塩化ナトリウムを含む５００ｍＬ水溶液を調製し、当該水溶液５００μＬに前記回収した磁気ビーズを分散させた。すなわち、２０％重量のＰＥＧおよび２．５Ｍの塩化ナトリウムの水溶液に磁気ビーズ濃度がＡＭｐｕｒｅ ＸＰの２倍の濃度にて再浮遊した磁気ビーズ分散液を調整した。 以下の例においては、ここで調製した磁気ビーズ分散液を使用した。（実施例２）磁気ビーズによるＤＮＡ断片のサイズ選択 被検体から取得したＨＬＡ遺伝子領域を含むＤＮＡサンプルを用いて、以下の条件で断片化及びＰＣＲ増幅を行ってＤＮＡ断片を含むライブラリーを調製した。 なお、以下の実験は９６ウェルプレート上で実施した。１．ＰＣＲ増幅 組成： ＤＮＡ（２０ｎｇ） ０．５μＬ ５×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ０．８μＬ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ ５μＭ ０．４μＬ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒ ５μＭ ０．４μＬ ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＧＸＬ ０．４μＬ Ｈ２Ｏ ５．５μＬ 合計 １０．０μＬ プライマー配列： Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ：ＡＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＣＴＣ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒ：ＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＡＣＡ ＰＣＲ条件： （１）９４℃ ２分間 （２）９８℃ １０秒間 （３）６８℃ ５分間 （２）及び（３）を３０サイクル繰り返し、その後は４℃で保存した。２．タグ化 組成： ＰＣＲ産物（１０ｎｇ） ４μＬ ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ ＴＤＥ１ １μＬ 合計 １０μＬ 条件： ５５℃ ５分間 その後は１０℃で保存した。３．タグ化ＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅 組成： タグ化ＤＮＡ ２μＬ Ｉｎｄｅｘ１ Ｐｒｉｍｅｒ １μＬ Ｉｎｄｅｘ２ Ｐｒｉｍｅｒ １μＬ ２×ＫａｐａＨｉＦｉＨＳＲＭ ５μＬ ＰＰＣ １μＬ 合計 １０μＬ ＰＣＲ条件： （１）７２℃ ３分間 （２）９８℃ ３０秒間 （３）９８℃ １０秒間 （４）６３℃ ２０秒間 （５）７２℃ ３分間 （３）〜（５）を８サイクル繰り返し、その後は１０℃で保存した。 ４．ＤＮＡ断片のサイズ選択 上記３で得たタグ化ＤＮＡライブラリーの５μＬを水４５μＬと混合して５０μＬのサンプルとした。当該サンプルに実施例１で調製した磁気ビーズ分散液を各種比率（容積比）で加え、１０回のピペッティングの後に１分間静置し、マグネットスタンドを用いて磁気ビーズを固定し、上清を廃棄した後、磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を溶出させ、得られたＤＮＡ断片のサイズ（長さ）の分布をバイオアナライザーで測定した。その結果を図１に示す。 図１には、ＤＮＡサンプル（容量）に加える磁気ビーズ分散液の比率と、磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片のサイズを示すバイオアナライザーのゲルイメージの結果（上段）及び磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片のおよそのサイズをまとめた表（下段）を示す。 磁気ビーズの比率を上昇させることにより磁気ビーズに結合するＤＮＡ断片のサイズ（長さ）が低下する傾向が顕著に確認された。（実施例３）本発明によるＤＮＡサイズ選択 本発明の方法の工程（１）及び（２）により、ＤＮＡ断片のサイズ選択を行った。具体的には、実施例１と同様にして、ＤＮＡサンプルに対して０．４倍の比率の磁気ビーズ分散液を加え、約１０００ｂｐを超えるＤＮＡ断片が結合した磁気ビーズをマグネットスタンドで固定し、上清を回収した。次いで、前記上清に対して０．５倍の比率で磁気ビーズ分散液を加え、約５００ｂｐ以上のＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させた。 図２は、実施例２において、ＤＮＡサンプルに対して（ａ）０．４倍及び（ｂ）０．５倍の比率で磁気ビーズ分散液を加えて処理したときに磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片、及び（ｃ）実施例３で最終的に磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片の具体的なサイズ分布を示す。 図２から明らかなように、本発明によるサイズ選択（工程（１）及び（２））を実施することにより、長すぎる断片及び短すぎる断片が有効に排除され、ほぼ目的とするサイズ範囲（図２の黒塗り部分）のＤＮＡ断片を含有するＤＮＡライブラリーを調製することができた。（実施例４）磁気ビーズによる濃度調節（ノーマライゼーション） 実施例１〜３で使用した磁気ビーズ分散液を、２０重量％のＰＥＧを含む水溶液で希釈し、その希釈率と（希釈した）磁気ビーズ分散液１００μＬ当たりに結合するＤＮＡ量との関係を測定し、その結果を図３に示す。 磁気ビーズ分散液を希釈すれば単位容量当たり分散液に含まれる磁気ビーズの量が減少するため、結合するＤＮＡ量の減少することが確認された。 一方、磁気ビーズ分散液を希釈すると磁気ビーズに固定されるＤＮＡ量は減少するが、同様の操作を行った各ウェル間のＤＮＡ量を比較すると、希釈率を上げるに従って、ウェル間での固定化されるＤＮＡ量が均一化されることが判明した。 例えば、実施例３でサイズ選択したサンプルでは、ＤＮＡサイズに関しては所定範囲に調節されているものの、各ウェルのサンプルに含まれるＤＮＡ量は、図４（ａ）に示すように不均一であった。これに対して、本発明の工程（３）に従って、２０倍に希釈した磁気ビーズ分散液を加えて処理した場合、磁気ビーズに結合（固定化）されたＤＮＡ量は、高度に均一化された（図４（ｂ））。 前記のように希釈した磁気ビーズ分散液を用いてノーマライゼーションを施した９６サンプルから得られたそれぞれのシーケンスデータ量を、サンプル毎にプロットしたのが図５である。 一方、前記特許文献１に記載されているように、アガロースゲルを切り出して調製した９６サンプルから得られたそれぞれのシーケンスデータ量を図６にプロットした。 図５及び図６から明らかなように、本発明の方法（工程（３））に従ってＤＮＡモル濃度調節（ノーマライゼーション）を実施することにより、９６サンプルそれぞれのデータ量を均一にすることができ、従来の煩雑な処理に比較しても極めて高い均一化が達成できた。（１）試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルを、磁気ビーズ分散液と第１の所定比率で混合して、必要とする範囲の上限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を回収する工程；（２）前記（１）で回収した上清を、磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、必要とする範囲の下限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程；及び（３）前記（２）で回収したＤＮＡ断片を、前記（１）及び（２）で使用した磁気ビーズ分散液の希釈液と混合し、静置した上清を廃棄し、残った磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程を含む、ＤＮＡライブラリーの調製方法。前記磁気ビーズ分散液が２０重量％のポリエチレングリコールおよび２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む、請求項１に記載の方法。 【課題】 簡便かつ短時間にライブラリーに含まれるＤＮＡ断片のサイズ及び濃度を調節でき、もって次世代シークエンサーに供するのに適したＤＮＡライブラリーを調製できる方法を提供する。【解決手段】 （１）試験すべきＤＮＡ断片を含むサンプルを磁気ビーズ分散液と第１の所定比率で混合して、必要とする範囲の上限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を回収する工程；（２）前記（１）で回収した上清を磁気ビーズ分散液と前記第１の所定比率より低い第２の所定比率で混合して、必要とする範囲の下限を超える長さのＤＮＡ断片を磁気ビーズに結合させ、静置した上清を廃棄し、磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程；及び（３）回収したＤＮＡ断片を前記（１）（２）で使用した磁気ビーズ分散液の希釈液と混合し、静置した上清を廃棄し、磁気ビーズに結合したＤＮＡ断片を回収する工程を含む、ＤＮＡライブラリーの調製方法。【選択図】 図２配列表