生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_肝細胞分化ステージを評価する新規測定法 |
| 出願番号： | 2014045980 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12Q 1/02,C12Q 1/68 |
特許情報キャッシュ
畠 恵司 高橋 純一郎 戸嶋 彦 三浦 瑞穂 JP 2014204713 公開特許公報(A) 20141030 2014045980 20140310 肝細胞分化ステージを評価する新規測定法 秋田県 591108178 株式会社スカイライト・バイオテック 503201335 畠 恵司 高橋 純一郎 戸嶋 彦 三浦 瑞穂 JP 2013058166 20130321 C12Q 1/02 20060101AFI20141003BHJP C12Q 1/68 20060101ALN20141003BHJP JPC12Q1/02C12Q1/68 A 7 ＯＬ 8 4B063 4B063QA01 4B063QA05 4B063QA13 4B063QA18 4B063QQ08 4B063QQ42 4B063QQ52 4B063QQ70 4B063QR32 4B063QR35 4B063QR41 4B063QR45 4B063QR55 4B063QR72 4B063QR77 4B063QS02 4B063QS17 4B063QS25本発明は、未分化の細胞から成熟肝細胞を作成する際に、成熟幹細胞への分化ステージを評価する新規測定法に関するものであり、詳しくは、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞などの各種幹細胞から肝細胞を作成する際に、分化の指標として細胞から分泌されるリポタンパク質を測定することおよびその測定方法である。肝臓は解毒や薬物代謝に関わる組織であるが、これに加えて、腸から吸収された中性脂肪やコレステロールなどの脂質を分解・再合成した後に、三種類のリポタンパク質（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＶＬＤＬ、ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＬＤＬ、ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＤＬ）に取り込み、分泌することも重要な機能である。このため、肝疾患患者への移植を最終目標に、正常な肝細胞から人工肝臓を作製する試みがなされている。また、創薬研究においても、前臨床段階で肝毒性や薬物代謝を調べることはコスト削減に繋がるため、肝臓のモデルとして、成熟肝細胞を利用する研究がすすめられている。成熟肝細胞は主に胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞などから作成されるが、成熟肝細胞が作製されたか否かを判定するために、通常はアルブミン、グリコーゲンあるいはチトクロームＰ−４５０などの分化マーカーを細胞分化の指標として用いている。これら分化マーカーの検出には、ウエスタンブロッティング、免疫染色あるいはＲＴ−ＰＣＲ法を用いた発現量を測定する方法が一般的であるが、操作が煩雑な上、分化マーカーの抽出や特異的染色における固定時に細胞を殺す必要があるため、同一試料における経時的な分化ステージ評価は困難であった。そこで、細胞を殺すことなく分化ステージの経時的評価が可能な迅速で簡便な方法が求められていた。本発明は上記事情に鑑み開発されたものであり、その目的は、各種幹細胞から成熟肝細胞への分化を迅速且つ簡便に評価する方法を提供することにある。上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明者等は、肝細胞の分化に伴い、リポタンパク質の構成成分であるアポリポタンパク質、中性脂肪・コレステロールの合成が亢進することを見いだした。そこで、成熟肝細胞の培養液に分泌されるリポタンパク質を分画し、リポタンパク質に含有される脂質を定量することで、細胞を殺すことなく肝細胞の成熟・分化のステージを迅速且つ簡便に評価できる新規手法を完成するに至ったものである。本発明により、これまで煩雑であった肝細胞の分化のステージの評価や確認が迅速・簡便に行えるようになる。また、分化マーカーの抽出が不要なため、従来不可能であった培養したまま分化ステージを経時的に評価することが可能となった。以下、本発明について詳細に説明する。使用する未分化の細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、前駆肝細胞、肝癌細胞などがあげられるが、成熟肝細胞に分化する細胞であれば、これらに限定されるものではない。先述の未分化の細胞株を適当な分化誘導条件で培養後に、培養上清を遠心分離により回収する。培養上清に含まれるリポタンパク質を測定する方法としては、構成成分のアポリポタンパク質、中性脂肪やコレステロールを定量することが挙げられる。アポリポタンパク質の定量は、特異的抗体による ＥＬＩＳＡ法で可能である。中性脂肪・コレステロールを測定する方法としては核磁気共鳴法による測定の他、超遠心分離、電気泳動ならびにゲル濾過ＨＰＬＣなどにより、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬに分画後に、各々を定量する酵素により測定することが一般的であり、いずれの方法を用いてもよい。望ましくは、感度が高くかつ評価する試料が少量で行えるゲル濾過ＨＰＬＣによる分画後、インラインでの酵素反応により中性脂肪とコレステロールを定量する方法（ＬｉｐｏＳＥＡＲＣＨ（登録商標））が挙げられる。以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。ヒト肝癌細胞 ＨｅｐＧ２分化マーカー遺伝子とリポタンパク構成成分遺伝子の相関性の確認を行った。先ず、１ｍｌ の ＨｅｐＧ２細胞（細胞数５ｘ１０５個）を０−５ｍＭの酪酸ナトリウム存在下で４日間培養し、生細胞数ならびに既知の成熟肝細胞マーカーならびにリポタンパク質や脂質合成に関与するタンパク質の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。その結果を表１に示した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析された各分化マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現をコントロールのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｉｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｉｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＧＡＰＤＨ）を １．０にしたときの比較発現量（倍）で示した。成熟肝細胞に特異的な分化マーカーであるアルブミン、トランスフェリン遺伝子やチトクロームＰ−４５０群であるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現が、未処理の区と比較して、酪酸ナトリウム処理区で増加が認められた。次に、肝臓で高レベルに発現していることが知られているミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭＴＴＰ）ならびにＬＤＬリセプターの発現量を調べた。両者の発現量も、酪酸ナトリウム処理により亢進し、２ｍＭの濃度で最高値となった。これらの結果から、ＨｅｐＧ２細胞が酪酸ナトリウム処理により分化誘導されたことが証明され、特に２ｍＭ酪酸ナトリウム処理区で最も効率良く分化が誘導されることが判明した。さらに、ＨｅｐＧ２細胞分化と、リポタンパク質の構成成分であるアポリポタンパク質、中性脂肪ならびにコレステロール合成の相関関係を調べる目的で、これらに関わる遺伝子の発現を定量した。アポリポ蛋白質は５つの主なクラス、アポＡ−Ｅに分類される。アポＡのサブクラスであるアポＡ−１は、ＨＤＬの構成分子で、ＨＤＬ物質代謝に関係する。アポＢ遺伝子にコードされているアポＢ−１００は、肝臓で合成され、ＶＬＤＬとＬＤＬの構成成分となる。アポＡ−１ならびにアポＢ−１００遺伝子の発現は酪酸ナトリウム処理により亢進した。酪酸処理によるＨｅｐＧ２細胞遺伝子の変動を表１に示す。また、酪酸ナトリウム処理の中性脂肪やコレステロールなどのリポタンパク質構成成分の合成遺伝子に対する影響を調べた。未処理の細胞と比較すると、酪酸ナトリウム処理したＨｅｐＧ２細胞では、中性脂肪合成に深く関与する転写因子である Ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ｃ（ＳＲＥＢＰ−１ｃ）、酵素であるステロール脂肪酸シンターゼ（ｓｔｅｒｏｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＦＡＳ）、Ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ（ＳＣＤ）遺伝子の発現がいずれも上昇していた。同様に、コレステロール合成を制御する転写因子であるＳＲＥＢＰ−２、コレステロール合成酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素−１、スクアレン合成酵素の発現も著しく上昇していた。特に、これらのタンパク質の発現量は ＨｅｐＧ２細胞を最も分化させた２ｍＭ酪酸ナトリウム処理区が最も高くなった。以上の結果から、ＨｅｐＧ２細胞分化マーカーの上昇とリポタンパク質各成分の発現量は相関が高く、肝細胞の分化マーカーとしてリポタンパク質の定量は効果的である。次に、分化したＨｅｐＧ２細胞から分泌されるリポタンパク質を測定し、分化の度合いとリポタンパク質の分泌量の相関性を確認した。１ｍｌの ＨｅｐＧ２細胞（細胞数５ｘ１０５個）を０−５ｍＭの酪酸ナトリウム存在下、１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（１ｍｌ）で４日間培養後、１．０％牛血清アルブミンを含むダルベッコ変法イーグル培地０．５ｍｌに交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後に、生細胞数をトリパンブル−色素排除法により計測すると共に、細胞培養上清を、１０，０００回転／分で１０分間遠心分離を行い回収した。細胞上清に含まれるリポタンパク質の定量には、ＬｉｐｏＳＥＡＲＣＨ（登録商標）を用いた。即ち、細胞培養上清８０μｌをゲル濾過ＨＰＬＣで、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬに分離し、各々のリポタンパク質画分に含まれる中性脂肪ならびにコレステロールを、インライン酵素反応後、５５０ｎｍの吸光度を測定することで定量した（参考文献１）。酪酸ナトリウム処理したＨｅｐＧ２細胞からの脂質分泌量を表２に示す。参考文献１：Ｍｉｚｕｈｏ Ｉｔｏｈ他、”ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ： ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ｄｒｕｇｓ”、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔeｒｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００９年、３１号、ｐ．９５３〜９５７酪酸ナトリウム無処理の区と比較して、１−２ｍＭの酪酸ナトリウムで分化誘導した区では、総中性脂肪および総コレステロール値、中でもＶＬＤＬ、ＬＤＬ画分に含まれる中性脂肪およびコレステロール値が顕著に上昇した。ヒト未分化型肝癌細胞株２種（ＨＬＥ、ＨＬＦ）、高分化型肝癌細胞株２種（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７）及びヒト成熟肝細胞（ｈｕｍａｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ、ｈｎＨＣ）から分泌されるリポタンパク質を測定し、分化の度合いとリポタンパク質の分泌量の関係を調べた。ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ―７細胞（細胞数１ｘ１０５個）は１０％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（１ｍｌ）で、ｈｎＨＣ細胞（細胞数１ｘ１０５個）は１０％牛胎児血清、１μＭデキサメサゾン、１ｎｇ／ｍｌのインスリンを含むウイリアムＥ培地で、それぞれ２日間培養後に、１．０％牛血清アルブミンを含むダルベッコ変法イーグル培地あるいはウイリアムＥ培地０．５ｍｌに交換し、さらに２日間培養した。培養終了後に、生細胞数をトリパンブル−色素排除法により計測すると共に、細胞培養上清を、１０，０００回転／分で１０分間遠心分離を行い回収した。細胞上清に含まれるリポタンパク質の定量は、実施例２同様にＬｉｐｏＳＥＡＲＣＨ（登録商標）にて行った。分化ステージが異なる肝由来細胞からの脂質分泌量を表３に示す。未分化肝癌細胞であるＨＬＥならびにＨＬＦ細胞の培養上清については、全てのリポタンパク質画分において中性脂肪ならびにコレステロールは検出されなかった。一方、分化度の高い肝由来細胞株であるＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７ならびにｈｎＨＣの培養上清については、各リポタンパク質画分に中性脂肪ならびにコレステロールが検出された。このことから、リポタンパク質は分化度の低い未分化型の肝癌細胞では産生されず、肝分化が進んだ高分化型肝癌細胞および成熟肝細胞ではリポタンパク質の産生が確認でき、リポタンパク質産生と分化ステージは密接な関係にあることが証明された。ヒト未分化型肝癌細胞株（ＨＬＥ、ＨＬＦ）、高分化型肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ−７）及びｈｎＨＣの肝分化マーカー遺伝子とリポタンパク構成成分遺伝子の発現量を調べた。先ず、１mｌ の培地でそれぞれの細胞（細胞数５ｘ１０５個）を２日間培養し、既知の成熟肝細胞マーカーならびにリポタンパク質または脂質合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量した。分化ステージが異なる肝由来細胞における発現遺伝子解析結果を表４に示す。各分化マーカーおよびリポタンパク質または脂質合成に関与するタンパク質の各々の細胞におけるｍＲＮＡ発現量を、ＨｅｐＧ２細胞の各遺伝子発現値を １．０にしたときの比較発現量（倍）で示した。ＨＬＥあるいはＨＬＦ細胞のような未分化の肝細胞では、分化度の高いＨｅｐＧ２細胞、ＨｕＨ−７細胞あるいは成熟肝細胞（ｈｎＨＣ）と比較して、肝分化マーカーであるアルブミンやトランスフェリン、ＨＮＦ−４α（肝細胞核内転写因子；Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ）の発現量が著しく低下していた。ＨＬＥやＨＬＦ細胞における中性脂肪合成遺伝子（ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＳＣＤ）あるいはコレステロール合成に関与する遺伝子（ＳＲＲＢＰ−２やＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素−１）の発現量は、ＨｅｐＧ２細胞における発現量の０．１〜２．０倍で、先に記載した肝分化マーカーと比較して著しい低下は認められなかった。一方、未分化肝細胞におけるリポタンパク質の構成成分であるアポ−Ａ１やアポ−Ｂ１００あるいは及びＭＴＴＰ発現量（アポＢ−１００のアセンブリーに関係する成分）は、ＨｅｐＧ２細胞やｈｎＨＣなどの肝分化が進んだ細胞株と比較するときわめて少なく、ほとんど発現していないことが判明した。これらの結果より、ＨＬＥやＨＬＦなどの肝由来未分化細胞では、アポリポタンパク質がほとんど発現していないため、リポタンパク質を合成できないと考えられる。つまり、アポリポタンパク質、あるいはアポリポタンパク質を構成成分の一つとするリポタンパク質は、アルブミンなどと同様に、肝細胞分化の指標として捉えられる。以上の結果を総括すると、肝細胞の分化に伴い、アポリポタンパク質、中性脂肪およびコレステロールなどから構成されるリポタンパク質の産生能が上昇し、細胞培養上清に高濃度で分泌されることが判明した。従って、細胞培養上清に分泌される各種リポタンパク質を定量することで、肝細胞分化のステージを判別する新規評価法が確立された。細胞を培養した上清に分泌される脂質の少なくとも１種を分析する工程を含む、細胞の肝臓分化度の評価方法。前記脂質が、コレステロール、中性脂肪、リン脂質のうち少なくとも１種類を含む、請求項１記載の方法。前記脂質の分析工程が、カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬのうち少なくとも１種類のリポタンパク質分画の分析工程を含む、請求項２記載の方法。前記リポタンパク質分画の分析工程が、ゲルろ過ＨＰＬＣ法である請求項３記載の方法。細胞を培養する際に、酪酸ナトリウムを加えることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。酪酸ナトリウムの添加濃度を１〜３ｍＭとすることを特徴とする請求項５記載の方法。培養細胞への化学物質・生物由来物質・環境刺激等による効果・影響・毒性等を評価する方法である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。 【課題】胚性幹細胞などから成熟肝細胞を作成する際の分化ステージ評価において、簡便・迅速且つ細胞を殺すことなく評価する方法を提供する。【解決手段】細胞を培養した上清に分泌される、コレステロール、中性脂肪、リン脂質のうち少なくとも１種類を含む脂質を分析する工程を含む、細胞の肝臓分化度の評価方法。肝細胞から分泌されるリポタンパク質の構成成分を定量することで肝細胞の分化ステージの評価が可能となった。【選択図】なし