生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_コザック配列を有するベクター及びそれを導入した細胞 |
| 出願番号： | 2014006097 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 15/09,C12N 5/10,C07K 16/00,C12P 21/08,C12N 1/21,C12N 1/19 |
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小林 龍司 JP 2015133920 公開特許公報(A) 20150727 2014006097 20140116 コザック配列を有するベクター及びそれを導入した細胞 東ソー株式会社 000003300 小林 龍司 C12N 15/09 20060101AFI20150701BHJP C12N 5/10 20060101ALI20150701BHJP C07K 16/00 20060101ALI20150701BHJP C12P 21/08 20060101ALI20150701BHJP C12N 1/21 20060101ALI20150701BHJP C12N 1/19 20060101ALI20150701BHJP JPC12N15/00 AC12N5/00 102C12N5/00 101C07K16/00C12P21/08C12N1/21C12N1/19 9 1 ＯＬ 8 4B024 4B064 4B065 4H045 4B024AA11 4B024AA20 4B024BA41 4B024BA44 4B024BA55 4B024CA04 4B024DA02 4B024EA04 4B024FA01 4B024GA13 4B064AG27 4B064CA10 4B064CA19 4B064CC24 4B064DA13 4B065AA90X 4B065AA90Y 4B065AB01 4B065AC14 4B065BA02 4B065CA25 4B065CA46 4H045AA11 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA10 4H045CA40 4H045DA76 4H045EA50 4H045FA74本発明は、タンパク質発現ベクター及びそれを導入した細胞等に関するものである。 遺伝子組み換え技術の進歩により、動物細胞を用いてタンパク質を製造することが可能になった。細胞内におけるタンパク質の合成には、転写と翻訳のステップがある。転写とは、タンパク質をコードする遺伝子を基にしてｍＲＮＡが作られる工程である。そして翻訳とは、このｍＲＮＡを基にしてタンパク質が組み上げられる工程である。 タンパク質の生合成における翻訳の工程は、ｍＲＮＡにリボソームが結合することから始まる。ｍＲＮＡに結合したリボソームは、塩基配列を読み取りながらその上を動き、開始コドンを探す。そして開始コドンをみつけると、その場所を起点としてタンパク質の合成を開始する。 タンパク質の合成はこの開始コドンを起点として始まるが、その周辺にはよく保存された配列が存在する。この配列はコザック配列と呼ばれており、タンパク質の翻訳を効率的に行う上で必須なことが示されている（非特許文献１）。ただしこの配列は厳密な共通配列ではなく、これと一致しない配列も存在する。脊椎動物におけるコザック配列は、ｇｃｃｇｃｃａｃｃａｕｇｇ（配列番号１）またはｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｕｇｇ（配列番号２）である（非特許文献２）。その中でも特に重要な役割を果たすのが、開始コドン（ａｕｇ）の３塩基上流にあるプリン塩基（ａまたはｇ）と開始コドン（ａｕｇ）の次にあるｇだと考えられている。 動物細胞を用いて効率的にタンパク質を製造するためには、目的タンパク質の遺伝子配列の上流にこのコザック配列を付加することが必要である。しかし開始コドン（ａｕｇ）の３塩基上流に位置するプリン塩基は、ａとｇのどちらを用いた場合に、即ちコザック配列として配列番号１又は２のどちらを用いた場合に、より高い効率で翻訳を行うのか明確に定まっていない。そのため動物細胞を用いてタンパク質製造を行う場合、どちらのコザック配列がその生産に適しているか個別に調べる必要がある。このコザック配列の最適化を行わないと、タンパク質の翻訳効率が落ちてその生産性が低下する原因となりうる。Ｋｏｚａｋ，Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ．３０８，２４１（１９８４）Ｋｏｚａｋ，Ｍ． Ｎｕｃｌｅｉｃ， Ａｃｉｄｓ， Ｒｅｓ．１５，２０，８１２５（１９８７） 抗体分子は、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）の２種類のポリペプチドが組み合わさって出来ている。そのためこの組み替え体を作る場合、Ｈ鎖とＬ鎖に対応する２種類の遺伝子配列が必要となる。抗体の製造は主に、この２種類の遺伝子を動物細胞へ導入して行われている。そのためその生産性を上げるためにはやはり、それぞれの配列にコザック配列を付加する必要がある。しかしここで問題になるのは、開始コドン（ａｕｇ）の３塩基上流をａとｇのどちらにするかという点である。特に抗体分子はＨ鎖とＬ鎖の２種類の遺伝子を同時に発現させる必要があるため、考えられるコザック配列の組み合わせは４通りある（１：Ｈ鎖ｋｏｚａｋ ａ×Ｌ鎖ｋｏｚａｋ ａ，２：Ｈ鎖ｋｏｚａｋ ａ×Ｌ鎖ｋｏｚａｋ ｇ，３：Ｈ鎖ｋｏｚａｋ ｇ×Ｌ鎖ｋｏｚａｋ ａ，４：Ｈ鎖ｋｏｚａｋ ｇ×Ｌ鎖ｋｏｚａｋ ｇ）。しかしこの中でどの組み合わせが最も高い生産量を示すかは明らかになっておらず、効率よく抗体を製造する上で大きな課題となっていた。 本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。（１）配列番号１又は２に記載のコザック配列と、ウサギ由来の抗体遺伝子とを含むことを特徴とするベクター。（２）コザック配列がウサギ由来の抗体遺伝子に隣接している（１）に記載のベクター。（３）コザック配列が配列番号１である（１）又は（２）に記載のベクター。（４）抗体がＨ鎖及び／又はＬ鎖である（１）〜（３）いずれかに記載のベクター。（５）抗体がプロゲステロンに対する抗体である（１）〜（４）いずれかに記載のベクター。（６）（１）〜（４）いずれかに記載のベクターを導入した細胞。（７）細胞がＣＯＳ−１である（６）に記載の細胞。（８）（６）又は（７）に記載の細胞を培養し、産生された抗体を回収することを特徴とする抗体の製造方法。（９）（８）に記載の方法により製造される抗体。 以下に本発明を更に詳細に説明する。 本発明に用いられるベクターには特に限定はなく、適応できるベクターは非常に幅広い。具体的には、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ（タカラバイオ社）・ｐＢＡｐｏ−ＥＦ１α（タカラバイオ社）・ｐＨＴＣ（プロメガ社）・ｐＳＩ（プロメガ社）・ｐＣＩ（プロメガ社）・ｐＦ５Ａ（プロメガ社）・ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ， Ｈ． Ｇｅｎｅ， １０８， １９３（１９９１））・ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社）・ｐＣＭＶ−ＨＡ（クロンテック社）・ｐＴＲＥ−Ｍｙｃ（クロンテック社）・ｐＣＥＰ４（ライフテクノロジーズ社）・ｐｃＤＮＡ５（ライフテクノロジーズ社）・ｐＥＦ１（ライフテクノロジーズ社）などにおいて適応可能である。またこれらのベクター以外でも、動物細胞や無細胞タンパク質翻訳系などにおいて抗体を発現させられるものであれば何でもよく、特にその種類が限定されるわけではない。 本発明において、コザック配列は配列番号１又は２で表わされるものであり、ウサギ由来の抗体遺伝子に隣接していることが好ましい。これはコザック配列がウサギ由来の抗体遺伝子と直接結合していることを意味し、特にコザック配列がウサギ由来の抗体遺伝子の上流に隣接していることが好ましい。 またコザック配列が配列番号１である場合には、高い効率で翻訳が行われ、抗体の生産性が向上するため好ましい。 抗体の態様には特に限定はなく、適応できるフォーマットは非常に幅広い。具体的には、通常のＩｇＧ等の抗体ばかりでなく、Ｈ鎖とＬ鎖をリンカーで繋ぎ合わせた一本鎖抗体・Ｈ鎖とＬ鎖のＦａｂ領域を入れ替えた抗体・ＧＦＰやアルカリホスファターゼなどのタンパク質と抗体とをリンカーで繋ぎ融合させたキメラ抗体・Ｈ鎖単独で抗原結合能を有する抗体・Ｌ鎖単独で抗原結合能を有する抗体・抗原結合能を有するＦａｂ領域を免疫動物と異なる生物種の抗体に移植した抗体などにおいて適応可能である。またこれらの態様以外でも、抗体分子に由来した抗原結合能を有するタンパク質であれば何でもよく、とくにその態様や形態・フォーマットが限定されるわけではない。 抗体がＨ鎖及びＬ鎖である場合、コザック配列は１つであってもよいが、Ｈ鎖とＬ鎖のそれぞれに対して１つずつの計２つあるほうが好ましい。このようにコザック配列が２つの場合、それらはＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子のそれぞれに隣接してることが好ましく、特に上流に隣接していることが好ましい。また２つのコザック配列は、いずれも配列番号１であることが好ましい。 なお抗体としては、何に対する抗体であってもよいが、例えばプロゲステロンに対する抗体を例示することができる。 本発明で使用できる細胞株の種類は非常に幅広い。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞・ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞・ＣＯＳ−１細胞・ＣＯＳ−７細胞・ＨＥＫ２９３細胞・ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などにおいて適応可能であるが、特にＣＯＳ−１細胞が好ましい。またこれらの細胞株以外でも、抗体を発現できる能力を有する細胞であれば何でもよく、特にその種類が限定されるわけではない。そして更にこの方法が適応できるのは、動物細胞のみではない。遺伝情報を基に抗体を作ることが可能なシステムであれば何でもよく、例えば細胞抽出液を利用した無細胞タンパク質翻訳系においても適応可能である。具体的には、ＴｎＴシステム（プロメガ社）・Ｔｒａｎｓｄｉｒｅｃｔシステム（島津製作所社）・ＰＵＲＥｆｌｅｘシステム（ジーンフロンティア社）などのシステムにおいて適応可能である。またこれらのシステム以外でも、抗体を作ることができるシステムであれば何でもよく、特にその種類が限定されるわけではない。 本発明によるベクターを導入した細胞を培養し、産生された抗体を回収する方法には特に限定なく、通常の方法により行うことができる。 本発明により、効率よく抗体を製造することが可能となった。特に、Ｈ鎖ｋｏｚａｋ ａ×Ｌ鎖ｋｏｚａｋ ａの組み合わせを用いた時に抗体の生産量が最も高くなることが明らかになった。すなわち本発明の組み合わせでコザック配列を付加することにより、効率よく抗体を製造することが可能になった。抗体の発現量を示す図である。 以下、ウサギ抗プロゲステロン抗体の実施例を用いて本発明について詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。 （１）ウサギモノクローナル抗体のクローニング以下の方法により抗プロゲステロンウサギモノクローナル抗体を取得した（特開２０１３−０８３４４８号公報、特開２０１３−１２４２２４号公報、特開２００９−２４０３００号公報参照）。まず、プロゲステロンにリンカーを生やしてＢＳＡと結合させた。そしてこのＢＳＡ−プロゲステロンを抗原としてウサギに免疫した。その後、免疫を行なったウサギから抗体産生細胞を単離した。そしてこの細胞から抗体遺伝子をクローニングしてモノクローナル抗体を取得した。尚このクローニングの際、Ｈ鎖遺伝子・Ｌ鎖遺伝子の上流に隣接してそれぞれコザック配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃａｕｇｇ（配列番号１）またはｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｕｇｇ（配列番号２））を付加し、それを用いて発現ベクターを構築した。このクローニングにより全部で４種類のベクターができるが、以下それぞれＨＡベクター（Ｈ鎖遺伝子にｇｃｃｇｃｃａｃｃａｕｇｇ配列（配列番号１）を付加）・ＨＧベクター（Ｈ鎖遺伝子にｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｕｇｇ配列（配列番号２）を付加）・ＬＡベクター（Ｌ鎖遺伝子にｇｃｃｇｃｃａｃｃａｕｇｇ配列（配列番号１）を付加）・ＬＧベクター（Ｌ鎖遺伝子にｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｕｇｇ配列（配列番号２）を付加）とする。またこれと同時にコザック配列を付加していないベクターも作製し、実験のコントロールとして用いた（Ｈ鎖遺伝子を含むものをＨベクター、Ｌ鎖遺伝子を含むものをＬベクターとする）。 （２）抗体発現ベクターの動物細胞への導入作製した抗体発現ベクターをＣＯＳ−１細胞へ導入した。実験手順は以下の通りである。 まず、１０％ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社製）にＣＯＳ−１細胞を懸濁して６ウェルプレート（グライナー社製）に１．６ｍｌ／ウェルずつ播いた。このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下に置き、プレート一面に細胞が増殖するまで培養を継続した。細胞がプレート一面に増殖したら、使用していた培地を一旦除去した。そしてここへ新たにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社製）を１．６ｍｌ／ウェルずつ加えた。その後このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下で３時間静置した。 この３時間の静置が終わる３０分前に、以下の溶液を作製した。まず８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に８０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ライフテクノロジーズ社製）を加えてよく混和した。そしてこの溶液にＨ鎖遺伝子を含むベクターとして１３３ｎｇのＨベクター、ＨＡベクターまたはＨＧベクターと、Ｌ鎖遺伝子を含むベクターとして２６６ｎｇのＬベクター、ＬＡベクターまたはＬＧベクターを加えてよく混和した。その後このベクターを含む溶液を３７℃の条件下で３０分間静置した。尚ここでは、Ｈベクター×Ｌベクター・ＨＡベクター×ＬＡベクター・ＨＧベクター×ＬＡベクター・ＨＡベクター×ＬＧベクター・ＨＧベクター×ＬＧベクターの５種類の組み合わせでＨ鎖遺伝子を含むベクターとＬ鎖遺伝子を含むベクターを加えた溶液を作製した。 Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地へ培地交換を行ってから３時間後、上述のＨ鎖遺伝子を含むベクターとＬ鎖遺伝子を含むベクターを混和した溶液をそれぞれ８００μｌ／ウェルずつプレートに添加した。その後このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下に置き、１週間培養して抗体を発現させた。 （３）抗体発現量の比較 抗体発現ベクターを導入した細胞の培養上清を回収し、その中にある抗体の発現量をＥＬＩＳＡで調べた。尚、ＥＬＩＳＡの実施手順は以下の通りである。 まずヤギ−抗ウサギ抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように固相化バッファ（１２ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ９．６）へ溶かした。そしてこれを１００μｌ／ウェルずつＥＬＩＳＡ用プレート（９６ウェル、グライナー社製）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、洗浄バッファ（１ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、７．５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４）で各ウェルを３回洗浄した。その後ブロッキングバッファ（８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１％ スキムミルク、ｐＨ７．５）を２００μｌ／ウェルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄バッファで各ウェルを１回洗浄した。このプレートにインキュベーションバッファ（８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、ｐＨ７．５）を７０μｌ／ウェルずつ加え、その後、培養上清を３０μｌ／ウェルずつ加えた。次にこのプレートを室温で１時間静置し、洗浄バッファで各ウェルを３回洗浄した。そしてこのプレートにアルカリホスファターゼで標識したヤギ−抗ウサギ抗体を含むインキュベーションバッファを１００μｌ／ウェルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄バッファで各ウェルを３回洗浄した。最後にこのプレートへ１００μｌ／ウェルずつアルカリホスファターゼバッファ（１Ｍ ジエタノールアミン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ リン酸４−メチルウンベリフェリル、ｐＨ９．８）を加えて３０分静置し、蛍光強度を測定して（励起光 ３６０ｎｍ／蛍光 ４６５ｎｍ）抗体の発現量を調べた。 実験の結果を図１に示す。図１からも明らかなように、抗体遺伝子にコザック配列を付加するとその生産量が大幅に向上することが確認できた。そしてその中でも特に、ＨＡベクターとＬＡベクターを掛け合わせた場合に抗体の生産量が最も高くなることが明らかになった。 以上の結果から、開始コドンの３塩基上流をａとしたコザック配列、即ち配列番号１のコザック配列を、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の両方の上流に隣接して付加すると、抗体の生産量が最も高くなることが明らかになった。このように本発明を用いることにより、効率よく抗体を製造することが可能になった。配列番号１又は２に記載のコザック配列と、ウサギ由来の抗体遺伝子とを含むことを特徴とするベクター。コザック配列がウサギ由来の抗体遺伝子に隣接している請求項１に記載のベクター。コザック配列が配列番号１である請求項１又は２に記載のベクター。抗体がＨ鎖及び／又はＬ鎖である請求項１〜３いずれかに記載のベクター。抗体がプロゲステロンに対する抗体である請求項１〜４いずれかに記載のベクター。請求項１〜４いずれかに記載のベクターを導入した細胞。細胞がＣＯＳ−１である請求項６に記載の細胞。請求項６又は７に記載の細胞を培養し、産生された抗体を回収することを特徴とする抗体の製造方法。請求項８に記載の方法により製造される抗体。 【課題】遺伝子組み換えを用いたタンパク質生産技術に関し、コザック配列の好適な組み合わせにより抗体の組み換え体を効率よく生産するＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の発現ベクターおよび細胞等を提供する。【解決手段】特定のコザック配列がウサギ由来の抗体Ｈ鎖遺伝子に隣接して含まれるベクターと、特定のコザック配列がウサギ由来の抗体Ｌ鎖遺伝子に隣接して含まれるベクターとをＣＯＳ−１細胞に導入し、それを培養し、産生された抗体を回収する。【選択図】図１配列表