生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公表特許公報(A)_最適の細胞培養培地組成の決定方法 |
| 出願番号： | 2013548927 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12N 1/00,C12N 1/16 |
特許情報キャッシュ
フレイタス・オリヴェイラ，フイ・マヌエル ロペス・ディアス，ジョアン・ミゲル サントス・フェレイラ，アナ・ラケル JP 2014503220 公表特許公報(A) 20140213 2013548927 20120113 最適の細胞培養培地組成の決定方法 ファクルダージ デ シエンシアス イ テクノロジア ダ ユニベルシダデ ノバ デ リスボア 510251604 ＦＡＣＵＬＤＡＤＥ ＤＥ ＣＩＥＮＣＩＡＳ Ｅ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ ＤＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＮＯＶＡ ＤＥ ＬＩＳＢＯＡ 特許業務法人創成国際特許事務所 110000800 フレイタス・オリヴェイラ，フイ・マヌエル ロペス・ディアス，ジョアン・ミゲル サントス・フェレイラ，アナ・ラケル PT 105484 20110114 C12N 1/00 20060101AFI20140117BHJP C12N 1/16 20060101ALI20140117BHJP JPC12N1/00 FC12N1/16 D AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN IB2012050178 20120113 WO2012095819 20120719 42 20130913 4B065 4B065AA77X 4B065BB02 4B065BB03 4B065BC03 4B065BC26 4B065CA44 本発明は、細胞培養培地の組成を最適化するための方法に関する。特に、培地因子の最適値を決定し、それによって、標的基本的細胞機能を、ユーザーのニーズにしたがって、高め、あるいは、抑制させる方法に関する。この方法は、細胞培養実験、好ましくは、エキソメタボローム（exometabolome）の高スループット解析方法を行うことによって、機能的なエンバイロミクス（enviromics）マップを構築するステップを含み、続いて、培地因子の前記機能に基づいて、培地因子の値が調整される。 細胞増殖処方は、水溶液中に、何百もの互いに異なった成分を含んでいる。それらは通常、ペプトン、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ミネラルおよびビタミン、抑制剤および凝固剤などの栄養素を含んでいる。これらの成分のいくつかは、細胞増殖あるいは生産性に対して臨界的なものであり得、これらの成分の他のものは、あるレベルで有毒であり、多くのものは、細胞内の同一経路あるいは競合する経路内での複雑な相互作用に関与し得る。哺乳類細胞成長に不可欠な成長因子を含む血清（ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））は動物細胞培養に効果がある添加培地として、広く用いられている。しかしながら、動物起源の材料を用いて、医薬品有効成分（ＡＰＩ）を生産するために、血清を用いることは、規制機関によって、きわめて厳しい制限が課せられるため、次第に、血清は用いられなくなりつつある。いくつかの文献（例えば、特許文献１〜３）は、動物細胞の体外培養をサポートすることができる血清を含まない細胞培養培地を開示している。 統計的実験計画法（ＤｏＥ）によってサポートされた集中的な実験が、細胞培養培地の最適組成を決定するための現在の標準的な方法である。しかしながら、この方法は、時間がかかり、高価である。培地成分は、個々に、あるいは、並列的な実験における少ない組合せで、スクリーンされ、有意に限定され、数多くの培地成分の間の複雑な相互作用を見出すことができる。リアクタによる実験あるいは振とうフラスコによる実験によってサポートされた細菌性細胞、真菌細胞、哺乳類細胞および幹細胞の培養のために、ＤｏＥを用いて、数多くの培地最適化についての研究結果が報告されている（［２］、［５］、［６］、［８］）。最も一般的なＤｏＥ法は、限られた数の実験で、５ないし１０の培地因子で、予備のスクリーニングを行うことを許容する２つの濃度レベルを用いた、いわゆる数の少ない要因計画である（［７］、［２］）。たとえば、特許文献４は、２−レベル要因計画を用いる方法と、血清を含まない真核性の細胞培養培地処方の最適濃度を決定するディーペスト・アセント法（deepest ascent method）とを開示している。ＤｏＥ法を用いて、いくつかの培地因子を同時に比較し、それらの効果を測定して、応答変数の測定値に基づいて、ランク付けがされる。応答変数は、典型的には、代謝体、細胞および生成物濃度である。一旦、応答変数が決定されると、分散分析（ＡＮＯＶＡ）などの統計的性能パラメータが、測定された効果の妥当性を評価するために用いられる。培地因子は、その影響に対してランク付けされ、次いで、最も効果の高い因子が選択され、さらなる実験においてテストされる［２］。最後に、回帰モデルが作り上げられ、培地因子の最適レベルが決定される［２］。 統計的ＤｏＥ法の大きな欠点は、その実験的性質のため、潜在的な相互作用を持った数多くの培地因子に適用したときに、費用がかかるということである。数多くの培地因子のスクリーニングをスピードアップするために、並列的に行われる数千もの栄養素のレベルまたはその組み合わせのスクリーニングを可能にすることを目的にするマイクロバイオリアクタ技術に基づいて、最近、高価でスループットが高い培地最適化装置が開発されている。作業量を少なくし、培地開発をスピードアップする他の方法は、特許文献５に開示されているように、培地成分を濃縮した相溶性のある処方にサブグループ化することである。実験数が少なくて済み、したがって、高速でかつ安価な方法も提案されている。特許文献６は、培地中のアミノ酸の濃度が、培養細胞のタンパク質含有量、発現組換型タンパク質のアミノ酸組成、及び細胞の維持ニーズに基づいて算出されることを特徴とする、細胞培養培地設計のための合理的な方法を開示している。 現在、より進んだシステム生物学的ツールが、実験の数が少なくて済み、テンデンシャリー（tendencially）に機械的培養培地設計に適用されている。Kellと共同研究者は、エキソメタボローム（すべての細胞外代謝体の濃度）と細胞内状態との間に密接なつながりがあることを示している［９］。彼らは、エキソメタボローム動力学によって、細胞の代謝活動および間接的にはゲノム・プロテオミック状態の有益で正確な「フットプリント（foot print）」が提供されることを示している。実際、培地は、本質的な栄養素だけでなく、遺伝子発現調節に関与する小さな分子やタンパク質を運んでいる（たとえば、［３］）。培養培地の組成を向上させるために、エキソメタボロミクスを使用することは、これまでに記載されてはいない。 特許文献７には、ゲノミクス及び／又はプロテミクスを用いて、細胞培養培地処方を開発する方法が記載されている。この文献は、細胞内の核酸配列（たとえば、ゲノムについての情報）あるいは発現アミノ酸配列（たとえば、プロテオームについての情報）を検出することと、検出された配列もしくはその発現を調節し、または、検出された配列もしくはその発現によって影響を受けた細胞過程を調節する分子を含む細胞培養培地を形成することとを備え、異なる細胞株または異なる培養条件に対する分子の効果を比較することなしに、細胞培養培地が形成されることを特徴とする。しかしながら、かかる方法は、以下の３つの大きな問題を有している。i）個々の分子間相互作用を探求することは、証明のに費用がかかり、困難である；ii）遺伝子発現、プロテオームおよび細胞表現型との間に既知のギャップがある；iii）遺伝子発現あるいはプロテオームデータの系統的な収集が困難であり、費用がかかる。したがって、系統的な培地設計のために、ゲノミクスおよび／またはプロテオミクスを用いることは、多くの場合に実用的でない。 特定の生化学的形質転換の調節に変わるものは、エンジニアリングに向けられた機能であり、本文献において探求されているアプローチである。細胞の代謝作用は、基本的フラックス・モード（flux mode）解析あるいは極値経路解析（extreme pathways analysis）を用いて、基本的な細胞機能に分解することができる［３５］。基本的フラックス・モードは、定常状態において、コヒーレントリー（coherently）に働く代謝反応の唯一の分解不可能なサブネットワークを表わしている。基本的モードの完全なセットは、その機能を実現するために、細胞のすべての動作可能なモードを表わしている。特に、そのフラクソーム（fluxome）vによって定義される細胞の表現型は、基本的フラックス・モードの寄与の加重和として表わすことができる。 ここに、λｉは、基本的なフラックス・モードeiの重み付け係数であり、Kは基本的フラックス・モードの数、dim(v)=dim(ei)=qは細胞の代謝反応の数である。基本的フラックス・モードの母集団（universe）は、主として細胞のゲノムによって決定される。遺伝子規模の再構築された代謝ネットワークからの基本的なモード決定方法の例は、［３６］〜［３８］から見出すことができる。細胞の代謝作用の基本的フラックス・モードへの分解は、遺伝子工学［３９］及び機能的ゲノム学［４０］をサポートするために、すでに用いられている。しかしながら、本文献に記載されている培地設計法に向けられた基本的な機能は、これまでに関心が向けられたことがない。したがって、以下に記載する方法は、環境変数（たとえば、培地因子）の効果の細胞機能に対する系統的特性評価に基づくものであるため、機能的エンバイロミクス（enviromics）と呼ばれている。機能的ゲノム学は、細胞生物学において、きわめて活発に研究がされている分野である一方で、その相補的な機能的エンバイロミクスは精神的健康障害［４１］との関連で言及されているにとどまり、これまでに、細胞生物学との関係で言及されたことはなく、培養培地設計にも適用されたこともない。国際公開第２００８／００９４６２号国際公開第２００９／１４９７１９号米国特許出願公開第２００９／０６１５１６号明細書米国特許出願公開第２００８／２４８５１５号明細書ニュージーランド国特許第２４３１６０号公報メキシコ国出願公開第２００９００４９７４号公報国際公開第２００４／１０１８０８号 これまでに報告されている細胞培養培地最適化方法は、過度に実験に基づくものである。細胞培養培地は、数多くの成分と、最適化する必要がある数多くの培地因子とを含んでいるため、実験数が指数関数的に増大するという結果を招く。たとえば、潜在的な相互作用を持った１０の培地因子を２つのレベルで要因設計をすると、２１０＝１０２４回のスクリーニング実験が必要になる。このように数多くの実験が必要になるのは、通常、培地因子の生化学的機能及びその相互作用が把握されていないという事実に起因している。 本発明は、主として、培地因子の機能の解明に焦点を合わせた細胞培養培地を開発する方法に関するものである。本発明の方法において採用された一般的な原理は、図１に図示されている。標的とする細胞のゲノムは基本的フラックス・モードの範囲を規定するが、それは、細胞の表現型をサポートする基本的フラックス・モードの相対的な強度を設定する細胞の周囲、すなわち、培地因子である。したがって、この方法の目的は、第一のステージでは、いかにして、培地因子によって、基本的なフラックス・モードの相対的な強度、すなわち、機能的エンバイロミクス解析を制御するかということである。このことは、実験プロトコールを実行することによって実現され、多くの細胞培養実験が実行され、基準培地因子に対する変動が取り込まれ、応答エキソメタボロミクスデータが取得され、解析される。こうして取得されたデータは、培地因子に対する基本的細胞機能の機能エンバイロミクスマップの形に処理される。第二のステージでは、機能エンバイロミクスマップから、望ましい表現型を実行するために、標的とする基本的細胞機能を増強させ、あるいは、抑制させて、最適化された培地の式が開発される。 かかる方法は、現在用いられている方法に対して、いくつかの利点を有している。−この方法によれば、いくつかの標的とする代謝の対象を同時に調整することによって、細胞の代謝作用を操作することが可能になる。−この方法は、実験が少なくて済むので、より容易に、与えられた遺伝子のグループを共有する異なった細胞種を、一般化し、または、外挿することができる。遺伝子の機能は、異なった種の間で、保存されやすいので、環境変数の機能もまた、異なった種の間で、保存されやすい。−従って、この培地設計は、過去に研究した条件を繰り返すことなく、時間とともに、増大する知識に基づくものである。−一旦、十分な知識のベースが構築されると、培地設計には、きわめて少ない実験が必要になるだけである。理論的には、知識の基礎が十分に正確なものであれば、標的とする細胞の代謝作用を最適化するのに、単一のステップの設計が必要なだけである。実施例４及び５に示されるように、単一の設計ステップで済むということは、タンパク質の生産性を６０〜１００％の範囲で向上させる結果となることがわかる。本発明の方法の概念的アプローチ、すなわち、培養培地エンジニアリングに指向された機能の概念的アプローチを表わす図。図１において、liは、培地因子によって制御される基本的機能重み付けファクターを表わし、eiは遺伝子によって与えられた基本的細胞機能を表わす。本発明の方法のメインステップの概略図。図２において、ステップ１Ａは、細胞培養物のセットを示し、ステップ１Ｂは、エキソメタボローム・アッセイの初期ポイントと最終ポイントを示し、ステップ２は、機能エンバイロミクスマップを示し、ｘｘ軸は、遺伝子の母集団によって設定された基本的細胞機能を、ｙｙ軸は培地因子を表わす。ステップ３は、最適化された培養培地の式を示し、ステップ４は、細胞培養における最終的検証を示し、最適化された培地の式の３倍であることが示されている。本発明の細胞培養プロトコールを組換型ピチア・パストリスＸ３３菌株への適用を例示する図表。図３は、２６の培養実験における培養時間が１１０時間を経過した後のバイオマス濃度と、生成物濃度と、アンモニア濃度とを与えている。組換型ピチア・パストリスＸ３３菌株のための低分解能の機能エンバイロミクスマップを示す図表。 以下に、本発明を実施するため形態を詳細に記載する。 本発明の方法の特有の特徴は、培地因子及び基本的細胞機能が共同してスクリーンされ、特定の実験的プロトコールを通じて、データを抽出し、得られたデータが機能エンバイロミクス（enviromics）マップの形に処理されることである。実験的プロトコールを実施する前に、培地が設計される生物学的構造を明らかにすることが必要であり、培地が設計されるべき生物学的構造を、ここでは、「標的生物学的構造」という。それは、全細胞であっても、細胞小器官であっても、また、与えられた細胞機能を表わす生化学的反応のコヒーレントな（coherent）セットであってもよい。かかる標的生物学的構造は、q個の生物学的反応によって表わされ、遺伝子とタンパク質が公知のときは、遺伝子とタンパク質とに関連している。一旦、この構造が明確に示されると、N個の培地因子と、K個の基本的細胞機能の基本的機能の組が確立される。 培養培地の式は、N個の培地因子の値によって次のように定義される。 培養培地製の式＝｛FACj｝ j=１，・・・，N ここで、FACjは培地因子jの値である。前記培地因子は、物理化学的な特性（例えば、温度、オスモル濃度あるいはイオン強度）であっても、既知又は未知の分子種の濃度又は放出率、あるいは、既知又は未知の組成物との混合物の濃度又は放出率であってもよい。 標的生物学的構造は、K個の基本的細胞機能に変換されるq個の生物学的反応によって定義される。 標的生物学的構造＝｛ei｝ i＝１，・・・，K q個の生物学的反応のK個の基本的細胞機能への変換は、基本的フラックス・モード解析、極値経路分析などの公知の生物情報アルゴリズムを適用することによって得られる［１７］。実施例１は、酵母「ピチア・パストリス（“Pichia Pastoris”）X33」に対して、いかにして基本的細胞機能が得られるかを示している。 一旦、この一般的構造が公知になると、４つのステップからなる方法が以下のように適用される（図２参照）。［ステップ１−細胞培養のアレイ］（ステップ１．１） 振とうフラスコ、Ｔ−フラスコ、あるいは反応器内で、培養培地の組成を変化させながら、少なくともN+1の細胞培養実験を行う。細胞培養実験は、好ましくは、マイクロプレート、マイクロバイオリアクタ、又は表現型のマイクロ・アレイなどの高スループットの培養装置内で行う。各実験においてスクリーンされた培地組成を、培養培地因子の値に対して、基本的細胞機能重み付け係数の線形回帰を行うために、適切な実験データが生成されるように決定する。実施例２は、この手順を示し、Ｄ−最適設計法を用いて、１１個の培地因子の線形関数同定を行う場合、培地因子の値の２つのレベルでの組み合わせから構成される２４の独立した実験を行う。さらに、このような培地処方は、基本的細胞機能のスクリーニングを促進するために、解析目的の13Ｃ-基質等の標識基質及び／又はタンパク質の抑制剤もしくは活性剤、又は干渉（interference）リボ核酸または基本的細胞機能を高め（knock up）もしくは低める（knock down）他の機能分子を含んでいてもよい。（ステップ１．２） 好ましくは、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲもしくはその他のＮＭＲ法などの高速かつ高スループットの解析方法を用い、または、ＧＣ−ＭＳもしくはＬＣ−ＭＳなどの質量分析法と結合されたクロマトグラフィー法を用い、または、質量分析法のみを用いて、実行された各細胞培養に対し、エキソメタボロームデータの初期ポイントと最終ポイント、すなわち、数多くの代謝体の濃度及び細胞濃度データを取得する。この解析は、酵素キットや高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの古典的な特定の代謝体解析方法を用いて行うこともできる。（ステップ１．３） 培地因子に対する基本的細胞機能重み付け係数の線形回帰によって、活性化している基本的細胞機能をプレ・スクリーニングする。これらの重み付け係数は、エキソメタボロームデータの初期ポイントと最終ポイントから得られる。まず、式（２）にしたがって、または、特性の時系列測定値から特性の変化率を算出する他の適当な方法にしたがって、代謝体の変化率を決定する。 ここで、CMiは代謝体iの濃度であり、CXは細胞内濃度、tは培養時間である。 次いで、K個のすべての基本的細胞機能に対して、次式にしたがって、潜在的最大eiの重み付け係数を決定する。 その後、培地因子の値に対し、式（４）にしたがって、λｉを線形回帰する。 ここで、Ij,iは、回帰パラメータであり、培養培地因子FACjによる細胞機能の活性化強度eiを表わしている。次いで、培地因子の値に対し、基本的細胞機能を相関係数λｉの低い値から高い値にランク付けをする。これに代えて、基本的細胞機能を速度データｖの説明分散の低い方から高い方にランク付けをする。次いで、ステップ１．４において、さらにスクリーニングするために、最大の相関係数及び速度データvの最大説明分散化を有するK’個（K’<<K）の細胞機能のサブセットを選択する。（ステップ１．４） ステップ１．１と同様に、培養培地の組成を変えながら、少なくともＫ’＋１回の細胞培養実験を行う。しかし、ここでは、基本的細胞機能重み付け係数の低い値と高い値の組み合わせをスクリーンする。理想的には、２Ｋの実験が行われ、すべての組み合わせがスクリーンされる。K個の基本的細胞機能のすべてをスクリーンすると、簡単に数百万になってしまうので、実際には、K個の基本的細胞機能のすべてをスクリーンするということはできない。しかしながら、前記ステップ１．３において、細胞表現型に対して最大の寄与をし、培地組成との相関が最大であるＫ’個の基本的細胞機能をあらかじめ選択しているときは、Ｋ’が２０になることはほとんどない。実験のこの２回目の実施のために、上述のステップで決定された強度値Ij,iを用いて、基本的処方になるように、細胞培養培地組成が変更される。これらの強度値は、式（５）にしたがって、基本的細胞機能を上方制御または下方制御するために、培地因子の値の変化方向を決定する。［ステップ２：機能エンバイロミクスマップ（Enviromics Map）］ ステップ１で実施された実験全体に対して、データ行列Ｘ＝｛Ｆａｃi,ｊ｝中の培地組成データ、Ｍ個の培地の式のＭ×Ｎ行列（Ｍ≧Ｎ＋Ｋ’＋２）、各測定フラックス（flux）データＲ＝｛ｖi｝、測定フラックスのＭ×ｑ行列を体系化する。次いで、培地因子に緊密にリンクされ、以下の基準を満足する培地組成データＸ＝｛Ｆａｃi,ｊ｝に対するＲ＝｛ｖi｝の回帰分析によって、観察された細胞表現型に対して重み付け係数Ｒ＝｛ｖi｝を決定する基本的細胞機能の全体のセットの中から、基本的細胞機能のサブセットを決定する。 ａ．エキソメタボロームデータの捕捉された変化及び／又はエキソメタボロームデータＲ＝｛ｖi｝の変化率、及び／又はエキソメタボロームデータから誘導された他の情報を最大化する； ｂ．基本的細胞機能重み付け係数と、培地因子又はこれらの値の変換との間の相関を最大化する； ｃ．エキソメタボロームデータの与えられた変化、及び／又はエキソメタボロームデータＲ＝｛ｖi｝の変化率、及び／又はエキソメタボロームデータから誘導された他の情報を収集するために要求される基本的細胞の数を最小化、すなわち、冗長性を最小化する。 これらの基準は、培地組成データＸ＝｛Ｆａｃi,ｊ｝と測定されたそれぞれのフラックスデータＲ＝｛ｖi｝との間の共分散を、次式にしたがって、最大化することによって満足させることができる。 ここで、ＥＭ（ＥＭ＝｛ｅi｝）はＫ個の基本的細胞機能のｑ×Ｋ行列であり、ｅiはｄｉｍ（ｅi）＝ｑであり、Λ（Λ＝λi）は基本的細胞機能（ｄｉｍ（λi）＝Ｍ）のウエイトベクトルλiのＭ×Ｋ行列であり、Ｉ（Ｉ＝｛Ｉｊ，i｝）は強度パラメータのＫ×Ｎ行列であり、これらは式（６）を解くための自由度である。式（６）を解くために、いくつかの方法を用いることができる。一つの効率的な方法は、式（７ａ）〜（７ｃ）の一つずつの、基本的細胞機能の分割から構成される。 ここで、ＥＦiは最小化された残差行列であり、Ｗは負荷係数の行列であり、Ｂは回帰係数の行列。最後に、強度行列Ｉは次式で与えられる。 このようなプロシージャーの結果、培地組成と緊密にリンクされた基本的細胞機能のサブセットが区別される。情報は最終的に、機能エンバイロミクスマップ（Enviromics map）（ＦＥＭ）と呼ばれるＮ×Ｋのデータアレイ内に整理される。 機能エンバイロミクスマップ＝ＩＴ＝｛Ｉｊ，i｝ j＝1，・・・，N i＝1，・・・，K 行は培地因子を表わし、列は基本的細胞機能の母集団を表わす。また、Ｉｊ，iは、培地因子jによって、上方制御または下方制御された基本的細胞機能iの相対的「強度」である。 これらのステップを実行することは、多くの培地処方をスクリーニングすることが必要であり、コストがかかる。しかしながら、一旦実行されると、環境機能特性の観点から、細胞の特有のパターンが確定される。さらに、機能エンバイロミクスマップが、遺伝子の機能が保存されたのと同様に保存される。異なる遺伝子型内で与えられた機能に対して特定されたパターンは、遺伝子と環境との間の決定論的なリンクをもたらす臨界的な類似性を示すことが見込まれる。実施例３は、酵母Ｐ．パストリス（pastoris）Ｘ３３に対する機能エンバイロミクスマップの構築方法を説明するものである。［ステップ３：最適化された培養培地の式］ 培養培地の設計において、理想的には、ユーザーのニーズにしたがって、細胞の機能性を細かく調整することができる。所望の機能性についての情報及び機能エンバイロミクスマップの情報を組み合わせれば、所望の機能性が実現するように、ある基礎式に対して、培地組成の調整方法に関する先験的ルールを推定することができる。これによって、培養培地設計のための実験数を大幅に減少させることができる。機能エンバイロミクスマップにおける情報が十分に正確なものである場合には、単一の設計ステップで、類似した最適培養培地の式を得ることができる。さらに詳細には、その手順は以下のとおりである。 ＦＥＭ行列の各列に、特定の基本的細胞機能を高め、あるいは、抑制するために、基礎的培地因子値をどのように調整するべきかという情報が保持されている。より詳細には、新たな培地因子の値は、次式にしたがって、変更される。 ここで、ＦＡＣｊ（０）は培地因子ｊの基準値であり、ＦＡＣｊＯＰＴは培地因子ｊの最適値、Ｉｊ，iは機能エンバイロミクスマップのｊ番目の行、i番目の列の強度値であり、ηiは基本的細胞機能i（設計パラメータ）の増大因子である。細胞機能特殊培地補充式は、機能エンバイロミクスマップの列から推定することができる。あるいは、増大因子を同時にいくつかの基本的細胞機能に適用することによって、グローバルに最適化された培地の式を得ることができる。［ステップ４：最終検証ステップ］ ステップ１のように、追加的培養実験において、新たに最適化された培養培地の式がスクリーンされる。しかしながら、実験数はかなり少なく、典型的には、与えられた最適化された培地の式の数の３倍である。 ステップ４の最後に、生産性及び／又は生産物の品質、又は全体的な培養性能が基礎的培地処方をはるかに超えることが期待される。生産性の向上が場合によって異なることは明らかである。実施例４、５及び６は、組み換え型P. Pastoris X33に対し、６０％〜１００％の範囲で生産性がどの位高まるかを示している。 本発明は、最適細胞培養培地組成を決定する方法であって、ａ）培地が設計される生物学的構造を選択するステップと；ｂ）Ｎ個の培地因子と、上述した生物学的構造のＫ個の基本的細胞機能のワーキング・セットを定めるステップと；ｃ）標的生物学的構造のＮ個の培地因子に対するＫ個の基本的細胞機能の機能エンバイロミクスマップを、−培地因子数＋１（Ｎ＋１）以上の培養の数を含む培養実験の第一のラン（ｒｕｎ）を実行し、各培養が異なる培養培地組成で実行され、低いレベルの培地因子と高いレベルの培地因子の組合わがスクリーンされ、−各培養実験が行われるごとに、初期及び最終のバイオマスと、生成物と、エキソメタボロームデータとを取得し、−培地組成データに対するエキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータの回帰解析によって、培地因子値と高い相関を示すＫ’個の活性化基本的細胞機能のサブセットを決定し、−活性化細胞機能の数＋１（Ｋ’＋１）以上の培養を含む培養実験の第二のラン（ｒｕｎ）を実行し、各培養が異なる培養培地組成で実行され、低い強度レベルの基本的細胞機能と高い強度レベルの基本的細胞機能を組合わがスクリーンされ、−培地組成データ、Ｘ＝｛ＦＡＣi，ｊ｝と、次式に従って測定された各フラックスデータＲ＝｛Ｖi｝との間の共分散を最大化することによって、前記ステップで収集されたデータから機能エンバイロミクスマップを構築し、−機能エンバイロミクスマップの形のデータを体系化し、強度データがＮ×Ｋデータアレイ、すなわち、機能エンバイロミクスマップ＝ＩＴ＝｛Ｉｊ，i｝の形に割り当て、前記機能エンバイロミクスマップを作るステップと；ｄ）機能エンバイロミクスマップを用いて、−機能エンバイロミクスデータ行列を用い、基本細胞機能特殊培地組成を形成し、培地値の変化値Δ（ＦＡＣｊ）により式（５）に従って基本的細胞機能の相対的重みの変化値Δλiを求め、−前記機能的エンバイロミックスマップのi番目の列に適用される式（５）を用いて、単一の基本的細胞機能iを高めるか、あるいは、抑制するように、培養培地組成を形成し、−培養培地組成を形成し、前記機能的エンバイロミックスデータアレイの複数の列に同時に適用される式（５）を用いて、基本的細胞機能の臨界的セットを高めるか、あるいは、抑制することにより、細胞代謝を操作することによって培養培地組成を最適化するステップと；を備える方法である。 好ましい実施態様において：−標的生物学的構造が、細胞組織、全細胞、細胞小器官、または与えられた細胞機能を表わす代謝反応のコヒーレントなセットであり；−培地因子が、物理化学的特性、必須の栄養素及び／又は微量栄養素及び／又は機能分子の濃度及び／又放出率であり、−前記物理化学的特性が、温度、圧力、ｐＨ、イオン強度、及び／又はオスモル濃度である。 他の好ましい実施態様において、培養培地の式が、培養培地の式＝｛ＦＡＣｊ｝（ｊ＝１，・・・，Ｎ）を用い、Ｎ個の培地因子によって決定される。ここで、｛ＦＡＣｊ｝は培地因子ｊの値であり、標的生物学的構造は、標的生物学的構造＝｛ｅi｝（i＝１，・・・，Ｋ）を用い、Ｋ個の基本的細胞機能によって決定される。 さらに他の好ましい実施態様において、基本的細胞機能が、前記標的生物学的構造の生化学的ネットワークから得られ、前記生化学的ネットワークが、生化学的形質転換のサブセットを含むＫ個の機能的なサブネットワークに分割され、かかるサブネットワークが、前記標的生物学的構造の代謝ネットワークの基本的なフラックス・モード（flux mode）アルゴリズム、または、極値経路アルゴリズム、または、他のゼロ空間解析アルゴリズム、または、他のゼロ空間凸解析アルゴリズムを適用することによって、マニュアルで、あるいは、自動的に得られる。 さらに他の好ましい実施態様において、基本的細胞機能が、前記標的生物学的構造の生化学的ネットワークの遺伝子スケールの再構成から得られ、Ｋ個の基本的細胞機能のワーキング・セットは、トランスクリプトーム（transcriptome）・データ、及び／又はプロテオーム（proteome）・データ、及び／又はエキソメタボローム・データ、及び／又は熱力学的データが利用可能である場合には、これらを用いて、あらかじめ縮小されてもよい。 さらに他の好ましい実施態様においては、機能的エンバイロミックスマップが、振とうフラスコ、Ｔフラスコ、リアクタ、マイクロプレート、マイクロバイオリアクタ、又は表現型マイクロ・アレイを用いて行われた連続的培養実験及び／又は並列的培養実験によって決定される。好ましくは、前記機能的エンバイロミックスマップが、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲなどのＮＭＲ法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）などのクロマトグラフィー法、質量分析法（ＭＳ）またはＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳなどの質量分析法にクロマトグラフィー法を組み合わせた方法によって、上清の解析を含むエキソメタボローム・アッセイ法によって決定される。 さらに他の好ましい実施態様において、活性化基本的細胞機能が減少されたセットが、線形回帰解析又は非線形回帰解析によって同定され、エキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータの分散もしくは共分散が最大化され、エキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータと培地因子の値との相関が最大最大化され、基本的細胞機能が、培地因子の値との相関又は培地因子の値に対する感度にしたがってランク付けされている。 さらに他の好ましい実施態様において、機能エンバイロミクスマップが、高スループットの自動化システムによって決定され、培養化デバイス、解析エキソメタボロームデバイス及びコンピュータ・アルゴリズムが、物理的デバイスに接続され、高スループットの機能的エンバイロミックスマップを得る。 本発明の方法によれば、プロダクト・エレメンタリー・フラックス・モード（product elementary flux mode）が６０％〜１００％の範囲に高められる。 本発明の他の態様は、植物細胞株または動物細胞株または酵母や菌類などの他の真核性単細胞もしくは多細胞の細胞培養培地の組成を最適化するための前記方法の使用、好ましくは、原核生物の細胞培養培地の組成を最適化するための前記方法の使用、及び幹細胞の細胞培養培地の組成を最適化するための前記方法の使用である。 本発明のさらに他の態様は、基本的細胞機能のバイオマーカーの同定である。細胞によって排泄され、または分泌され、エキソメタボロームにおいて検出された培地コンポーネントであって、本発明の方法を用いて単一の基本的細胞機能と強く相関していることが判明している培地コンポーネントは、基本的細胞機能のバイオマーカーとして機能することができる。 本発明のさらに他の態様は、前記方法を備えた基本的細胞機能を標的にした薬剤設計システムである。病状に関連する基本的細胞機能と強く相関していることが判明している化合物は、その病気を治療する薬剤候補になり得る。［実施例］ 以下、本発明をより詳細に説明し、特に実施例について説明を加えるが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。［実施例１：酵母ピチア・パストリスＸ３３のための基本的細胞機能］ ここでは、組み換え型酵母ピチア・パストリスＸ３３菌株のための基本的細胞機能のワーキング・セットを得るためのステップが記載されている。 第一に、代謝ネットワークを、情報源となる文献、すなわち、ＫＥＧＧデータベース［３０］、及びＣｈｕｎｇ等の論文［３１］、及びＣｅｌｉｋ等の論文［３２］から構築する。各反応に関わる遺伝子は、多くの場合、既知であり、Ｃｈｕｎｇなどの論文［３１］において見出すことができる。さらに、代謝ネットワークは、単一の反応にひとまとめにすることによって、同化経路に簡略化される。得られる代謝ネットワークは、９９の反応（したがって、９９のフラックス）と、８９の細胞内代謝体と、９の細胞外代謝体を有する。代謝反応の完全なセットを表１にリストする。 オープンソースのバイオインフォマティクス（生物情報学）ソフトウエアMETATOOL 5.0［３３］を用いて、表Ｉにおいて特定された代謝ネットワークの基本的フラックス・モードを算出した。基本的フラックス・モードの総数は３３６８であった。以下のようにして、METATOOL 5.0［３０］を用いて、５つのフラックス・モードを得た。各基本的フラックス・モード・ベクトルのディメンションは９９であり、その中の値が特定の基本的フラックス・モードに与えられた代謝反応のウェイト（weight）を示していることに注意する必要である。 基本的モード９および１０はバイオマス合成に対応し、基本的モード３および１２は生成物合成に、基本的モード５は異化作用に対応する。これらの基礎的フラックス・モードは、本発明の方法の後半のステップにおいて、最も重要であるということが判明している。［実施例２：酵母ピチア・パストリスＸ３３のためのＮ＝１１の培地因子をスクリーニングする２４の培養実験のアレイ］ ここでは、酵母ピチア・パストリスＸ３３に対して、スクリーニングを行う方法が記載される。 （表ＩＩに挙げられた）１１個（Ｎ＝１１）の培地因子を、スクリーニングのために選択した。各培地因子は、Invitrogen guidelines［３４］から採った基準値として、−１レベル（基準値の１０倍未満）と、基準値と一致する＋１レベルを用いた。 ２４（＝２×（Ｎ＋１））個の細胞培養に２つの制御実験をプラスしたアレイを、培地組成を変えながら、２５０ｍｌのＴ−フラスコを用いて行った。各実験において、テストされる培地因子値の組み合わせは表ＩＩＩに挙げられている。これらは、２４の独立した実験を用いて、線形関数同定のためのＤ−最適実験設計法によって得られた。 表ＩＩ及び表ＩＩＩにおいて特定されている組成の各培地を、以下の実験的手順で形成した。４０ｍｌの希釈ＢＳＭ溶液（表ＩＩ参照）に、グリセロール（濃度２０ｇ／Ｌ）を加え、１２１℃で、３０分間、加圧滅菌処理した。ＢＳＭのｐＨは約１．５であり、加圧滅菌処理後に、２５％の水酸化アンモニウムを加えて、ワーキングｐＨである５．０に調整しなければならない。水酸化アンモニウムは窒素源としても機能する。ＰＴＭ１微量塩貯蔵溶液は、まず、細孔径０．２２ｎｍのフィルタを用いた濾過によって滅菌され、次いで、加熱滅菌したＢＳＭ溶液に、ＰＴＭ１とＢＳＭとの容積比が１：２００（ｖ／ｖ）になるように加えた。 細胞を含んだ低温バイアルを−８０℃の温度下で保存した。貯蔵している１ｍｌの細胞と基準組成を有する培地（表ＩＩ）４０ｍｌによって、プレ接種材料（pre-inoculum）を調製し、Innova 4300インキュベータ・シェイカーを用いて、温度３０℃、回転数１５０ｒｐｍで培養した。約２６時間の培養時間が経過した後、プレ接種材料が指数増殖をしたとき、その２ｍｌを２６個のＴ−フラスコに同時に植菌した。 ２６個のＴ−フラスコのそれぞれは、Innova 4300インキュベータ・シェイカーを用いて、温度３０℃、回転数１５０ｒｐｍで、１１０時間、培養した。サンプルは２４時間間隔で採取された。各サンプルは、以下の化合物が分析された。−６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学濃度及びウェット・セル・ウェイト（wet cell weight）法（１５０００ｒｐｍの遠心分離後、乾燥することなく加重する）によって、バイオマスの濃度が決定された；−酸素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、生成物の濃度が決定された；−グリセロール及びいくつかの有機酸（リンゴ酸、コハク酸、乳酸、ギ酸、フマル酸）の上清内の濃度が、高性能液体クロマトグラフィーによって決定された；−アンモニウムの濃度が電極（Thermo Electron CorporationのOrion ９５１２）によって測定された。 図３ａ〜図３ｃは、２６回の実験の最後におけるバイオマスの濃度、生成物の濃度及びアンモニウムの濃度を示している。グリセロール及び有機酸の濃度は表ＩＶに示されている。有機酸化合物は残留濃度を示している。グリセロールはすべての場合で、完全に使用しつくされていた。［実施例３：ピチア・パストリスＸ３３の機能エンバイロミクスマップ］ ここでは、実施例２で収集した実験データがどのようにして、酵母ピチア・パストリスＸ３３の機能エンバイロミクスマップに処理することができるかが実証されている。 まず、各化合物の変化率が、次式によって算出される。ここで、ＣＭｉ（０）は初期濃度であり、ＣＭｉ（ｔｂａｔｃｈ）は終点濃度、Ｘａｖは平均細胞濃度、ｔｂａｔｃｈはバッチ実験の経過時間である。上付き文字は実験を示し、下付き文字は化合物を示していることに注意すべきである。 次いで、以下の線形モデルを用いて、培地因子の値に対するｖの統計的回帰分析を実行する。 最後に、機能エンバイロミクスマップ（機能エンバイロミクスマップ＝｛Ｉｊ、i｝）の形のデータを、Ｎ×Ｋアレイのフォーム（form）に強度値を体系化する。 この手順の最終結果は表Vに示され、図４に表されている。［実施例４：６０％の増大因子によって、生成物の基本的機能を増大させるために最適化された細胞培養培地処方］ ここでは、機能エンバイロミクスマップに含まれた情報を用いて、基準培地処方の生産性よりもかなり高い特定の生産性を有する生成物を用いて、どのようにして、最適化された培地処方を得ることができるかについて示されている。 まず、式（６）を用いて、基準実験に対して６０％向上することに対応する、標的となる特定の生産性Ｖｐｒｏｄｕｃｔ（＝０．１６μｇ／乾燥する細胞１ｇ／日）になるように、培地因子値の反復調整が行われる。 その結果、次の最適化された培地組成を得ることができた。（最適化された処方） ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ７．２５ｇ／Ｌ；ＮａＩ ０．１０６ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．１５２ｇ／Ｌ；ＮＡ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０３６ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３ ０．０１３ｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ２ ２５．２ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５．３４ｇ／Ｌ；ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎｅ） ０．０３８ｇ／Ｌ；Ｈ２ＳＯ４ １．９８９ｍｌ／Ｌ；ＢＳＭの０．８４：１（ｖ／ｖ）の希釈溶液 基準培地処方（表ＩＩに示された対照実験）又は最適化された培地処方を用いて、Ｔ−フラスコによる実験を行った。適用した手順は、実施例２において記載されたものの１つとした。最終的に測定された特定の生産性は以下のとおりであった。 基礎フォーミュレーション：０．１０μｇ／乾燥する細胞１ｇ／日 最適化フォーミュレーション：０．１７μｇ／乾燥する細胞１ｇ／日 基礎フォーミュレーションに対して、６２．３％の増大因子が得られた。［実施例５：１００％の増大因子によって、生成物の基本的機能を増大させるために最適化された細胞培養培地処方］ 実施例４と同様な手順を実行し、基準実験に対して１００％向上することに対応する、標的となる特定の生産性Ｖｐｒｏｄｕｃｔ（＝０．２０μｇ／乾燥する細胞１ｇ／日）になるように、培地因子値の反復調整が行った。その結果、得られた最適化された培地処方を得ることができた。（最適化された処方） ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １２．０ｇ／Ｌ；ＮａＩ ０．１６ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ６．００ｇ／Ｌ；ＮＡ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．４０ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３ ０．００１ｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ２ ４０．０ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３．２５ｇ／Ｌ；ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎｅ） ０．４ｇ／Ｌ；Ｈ２ＳＯ４ １０．０ｍｌ／Ｌ；ＢＳＭの０．２５：１（ｖ／ｖ）の希釈溶液 基準培地処方あるいは最適化された培地処方を用いて、実施例４と同様にして、Ｔ−フラスコによる実験を行った。最終的に測定された特定の生産性は以下のとおりであった。 基礎フォーミュレーション：０．１０μｇ／乾燥する細胞１ｇ／日 最適化フォーミュレーション：０．２２μｇ／乾燥する細胞１ｇ／日 基礎フォーミュレーションに対して、１０４．７％の増大因子が得られた。［実施例６：酵母ピチア・パストリスＸ３３を用いて、５０Ｌ（リットル）のパイロットプラント・バイオリアクターにおける組み換え型タンパク質の生成量の増大］ 前記実施例のピチア・パストリスＸ３３菌株を本実施例でも用いた。菌株は５０リットルのパイロットリアクタで培養した。２つの５０リットルのパイロット実験で、基礎培地処方（表ＩＩで特定されている。）あるいは実施例５の以下の組成を有する最適化された培地処方を用いて、実験を行った。 ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １２．０ｇ／Ｌ；ＮａＩ ０．１６ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ６．００ｇ／Ｌ；ＮＡ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．４０ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３ ０．００１ｇ／Ｌ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ２ ４０．０ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３．２５ｇ／Ｌ；ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎｅ） ０．４ｇ／Ｌ；Ｈ２ＳＯ４ １０．０ｍｌ／Ｌ；ＢＳＭの０．２５：１（ｖ／ｖ）の希釈溶液 最適化された培地処方については、ＢＳＭの０．２５：１（ｖ／ｖ）の希釈溶液を、１２１℃の温度下で、３０分間滅菌し、次いで、実施例５と同じ組成を有する、最適化されたＰＴＭ１微量塩貯蔵物溶液を添加した。 基礎培地フォーミュレーションについては、希釈していないＢＳＭの溶液を、１２１℃の温度下で、３０分間滅菌し、次いで、表２において特定されている組成の最適化されたＰＴＭ１微量塩貯蔵物溶液を添加した。 その後のステップは、以下のように、基礎培地処方に対しても、最適化された培地処方に対しても、同じである。 上述のように、４０ｍｌの滅菌培地を含む振とうフラスコを、貯蔵されているピチア・パストリス細胞からの一つのクリオバイアル（Cryovial）によって植菌し、１５０ｒｐｍの回転数及び３０℃の温度で、３日間培養した。１０ｍｌのプレ接種材料を用いて、振とうフラスコに収容された７５０ｍｌの最適化培地を植菌した。この接種材料を３０℃の温度および１５０ｒｐｍで、３日間成長させ（ＯＤ６００ｎｍ＝２−６）、バイオリアクタに植菌するのに用いた。リアクタを、滅菌培地１５ｍｌの初期容積で、植菌した。リアクタをバッチモードで、約３０分間作動させ、さらに、グリセロール・供給バッチを１００時間作動させた。培養温度は３０℃に制御し、ｐＨは５に水酸化アンモニウム２５％溶液を添加することによって制御した。グリセロール・供給バッチにおいては、溶解酸素を、グリセロールの供給率を閉ループ操作することによって、低いレベル（飽和濃度の５％）に保持した。９０時間培養をした最終製品の生産は、それぞれの実験に対し、以下のとおりである。−基礎培地処方を用いた５０リットルのパイロット実験： 最終タンパク質タイター（titer） ２１９．３２ｍｇ／Ｌ，最終的なタンパク質の収率 ０．２７ｍｇ／１ｇの湿潤した細胞−最適組成の培地処方を用いた５０リットルのパイロット実験： 最終タンパク質タイター ２５８．０４ｍｇ／Ｌ，最終的なタンパク質の収率 ０．３８ｍｇ／１ｇの湿潤した細胞 基礎培地処方に比し、最適組成の培地処方を用いた場合には、増大因子は、最終生産物のタイターにおいては１８％、最終的なタンパク質の収率においては３８％であった。［引用文献］ 1. 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Schizophrenia Bulletin 34, 1066-1082 (2008) 最適な細胞培養培地の組成を決定する方法であって、 ａ）標的生物学的構造を選択するステップと； ｂ）自律的機能及びモジュラー生物学的機能を設定し、２つの前記機能の組合せが前記標的生物学的構造の機能をもたらす、Ｋ個の基本的細胞機能を定めるステップと； ｃ）前記標的生物学的構造の環境を決定するＮ個の培地因子のセットを定めるステップと； ｄ）新規な培養培地サンプル及び／又は使用済みの培養培地サンプルの上清のエキソメタボロームの実験データを用いて、前記Ｎ個の培地因子の各々によって、前記Ｋ個の基本的細胞機能各々の活性化又は抑制化の強度を表わす機能的エンバイロミックスマップを構築するステップと； ｅ）前記機能的エンバイロミックスマップを用いて、一又は二以上の基本的細胞機能を活性化又は抑制化するように指向する前記細胞培養培地の組成を最適化するステップと；を備えることを特徴とする方法。 請求項１記載の方法であって、 前記ステップｄ）における前記機能的エンバイロミックスマップの構築は、 前記培地因子の数に１を加算した（Ｎ＋１）以上の数の培養を含む培養実験の第一のランを実行するステップであって、各培養が異なる培養培地組成で実行され、低いレベルの培地因子と高いレベルの培地因子の組合せがスクリーンされるステップと； 実行された培養実験各々に対して、初期及び最終のバイオマス、生成物、及びエキソメタボロームのデータ、又は、一部のエキソメタボロームのデータを取得するステップと； 相対的重み付け係数λｊがゼロよりも高い活性基礎的細胞機能のサブセットを、下記の線形モデルを用いて、前記エキソメタボロームのデータ、又は培地組成データに対して誘導されたエキソメタボロームのデータの回帰分析によって決定するステップと（ただし、ｖは要素が測定されたエキソメタボロームのコンポーネントの変化率を表すベクトルであり、Ｉi，ｊは回帰解析によって決定された培地因子iによる基本的細胞機能ｊの活性化強度パラメータである）； 活性化細胞機能の数に１を加算した数以上の数の培養を含む培養実験の第二のランを実行するステップであって、各培養が異なる培養培地組成で実行され、前記培地組成は、活性化基本的細胞機能の重み付き係数の低い値と高い値を、前記培地因子によって制御される活性化細胞機能のサブセットと特定するように予め決定された前記強度パラメータ値Ｉｉ，ｊを用いて、スクリーンするために設定されるステップと； すべての前記ステップにおいて、式（３ａ）及び（３ｂ）を用いた線形回帰解析によって収集されたデータから機能的エンバイロミックスマップを構築し、かつ、前記データを前記機能的エンバイロミックスマップの形に体系化するステップであって、実験の前記第一のランによって決定された前記強度値Ｉｉ，ｊが、実験の前記第二のランのデータによって補正され、Ｎ×Ｋのデータアレイ（機能的エンバイロミックスマップ＝｛Ｉｉ，ｊ｝）の形にするステップと；を備えることを特徴とする方法。 請求項１記載の方法であって、 前記ステップｅ）における前記培養培地組成の最適化は、 前記機能エンバイロミクスデータの行列を用いて、基本細胞機能特殊培地組成を形成するステップであって、前記培地因子の値の変化値Δ（ＦＡＣｊ）により、に従って基本的細胞機能の相対的重みの変化値Δλiを求めるステップと； 前記機能的エンバイロミックスデータアレイのｊ番目の列に適用される式（４）を用いて、単一の基本的細胞機能ｊを高める、あるいは、抑制するように培養培地組成を形成するステップと； 前記培養培地組成を形成し、前記機能的エンバイロミックスデータアレイの複数の列に同時に適用される式（４）を用いて、基本的細胞機能の臨界的セットを高める、あるいは、抑制することにより、細胞代謝を操作するステップと；を備えることを特徴とする方法。 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、 前記標的生物学的構造が、細胞組織、全細胞、細胞小器官、又は所定の細胞機能を示す生化学的形質転換のコヒーレントなセットであることを特徴とする方法。 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、 前記標的生物学的構造が、遺伝子学的に修飾され、前記基本的細胞機能の活性化又は抑制化に指向させる遺伝子修飾を含むことを特徴とする方法。 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、 前記培地因子が、必須の栄養素及び／又は微量栄養素及び／又は生物学的機能分子の、固体及び／又は液体及び／又は気体の混合物の物理化学的特性、前記化合物の放出率、あるいは、前記化合物の摂食率であることを特徴とする方法。 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の方法であって、 前記物理化学的特性が、温度、及び／又は圧力、及び／又はｐＨ、及び／又はイオン強度、及び／又は濃度、及び／又は活性、及び／又は容積モル浸透圧濃度、及び／又は重量モル浸透圧濃度、及び／又は関連する特性であることを特徴とする方法。 請求項１〜３、６のいずれか一項に記載の方法であって、 必須の栄養素及び／又は微量栄養素及び／又は生物学的機能分子は、 塩、及び／又はビタミン、及び／又は代謝の共同因子、及び／又は抗生物質、及び／又は炭水化物、及び／又は脂質物質、及び／又はタンパク性物質、及び／又はヌクレオチド物質、及び／又はシグナル伝達タンパク質、及び／又は酵素の活性を抑制する分子、及び／又はタンパク質の活性分子、及び／又は遺伝子形質転換モジュレータ、及び／又は干渉性リボ核酸、及び／又は、前記物質と、血清、純粋なヒドロシレイト、又は複合有機物質を含む既知又は未知の組成物との複合混合物を含む、無機物質及び／又は有機物質であることを特徴とする方法。 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、 前記培養培地の式は、培養培地の式＝｛ＦＡＣｊ｝，ｊ＝１，・・・，Ｎ（但し、ＦＡＣｊが前記培地因子ｊの値である。）を用いて、Ｎ個の培地因子の値によって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、 前記標的生物学的構造は、 標的生物学的構造＝｛ｅi｝，ｉ＝１，・・・，Ｋ（但し、ｅiは、ｑ個の要素のベクトルであり、前記要素の値は基本的細胞機能ｉにおける各生化学反応の重み付き係数を表す。）を用いて、ｑ個の生化学的反応と、Ｋ個の基本的細胞機能とによって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、 前記基本的細胞機能は、前記標的生物学的構造の生物学的ネットワークから得られ、 前記生物学的ネットワークは、生物学的形質変換のサブセットを含むＫ個の機能的サブネットワークに分割され、 前記サブネットワークがマニュアルで及び／又は自動的に得られることを特徴とする方法。 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、 前記基本的細胞機能は、前記標的生物学的構造の生物学的ネットワークのゲノム・スケール・リコンストラクションから得られ、 Ｋ個の基本的細胞機能のワーキング・セットは、トランスクリプトームデータ、及び／又はプロテオームデータ、及び／又はエンドメタボロームデータ、及び／又は熱力学的データが利用可能であるとき、前記データを用いて予め縮小されることを特徴とする方法。 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、 前記機能的エンバイロミックスマップは、振とうフラスコ、Ｔフラスコ、リアクタ、マイクロプレート、マイクロバイオリアクタ、又は表現型マイクロアレイの中で実行される、連続的培養実験及び／又は並列的培養実験によって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、 前記機能的エンバイロミックスマップは、 液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等のクロマトグラフィー法、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ等のＮＭＲ法、質量分析法（ＭＳ）、又は、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ等の質量分析法に組み合わせたクロマトグラフィー法によって、あるいは、前記測定方法を組み合わせた方法によって、新規な培養培地サンプル又は使用済みの培養培地サンプルの上清の解析を含むエキソメタボロームアッセイ法によって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、 前記活性化基本的細胞機能の縮小したセットは線形回帰解析又は非線形回帰解析によって同定され、 エキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータの分散又は共分散が最大化され、 エキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータと培地因子の値との相関が最大化され、 前記基本的細胞機能が、前記培地因子の値との相関又は前記培地因子の値に対する感度に従ってランク付けされることを特徴とする方法。 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法であって、 前記機能的エンバイロミックスマップが高スループットの自動化システムによって決定され、 培養化デバイス、解析エキソメタボロームデバイス、及びコンピュータ・アルゴリズムが物理的デバイスに接続され、高スループットの機能的エンバイロミックスマップが得られることを特徴とする方法。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法であって、 製品量及び／又は製品品質に関連付けられた前記標的基本的細胞機能ｉが、相対的重量Δ（λi）を６０％〜１００％増大させることを特徴とする方法。 異種のタンパク質発現機能を６０％〜１００％の範囲で高めることを特徴とし、酵母ピチア・パストリスの培養のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法によって得られた、化学的に定義された培養培地処方であって、 ａ）１２．０ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１６ｇ／ＬのＮａＩ、６．００ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４０ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４０．０ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、３．２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌのビオチン、１０．０ｇ／ＬのＨ２ＳＯ４によって構成された微量成分の水溶液と； ｂ）水溶液ａ）と、２６．７０ｍｌ／Ｌの８５％Ｈ３ＰＯ４、０．９３ｇ／ＬのＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、１８．２０ｇ／ＬのＫ２ＳＯ４、１４．９０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．１３ｇ／ＬのＫＯＨによって構成される相補的な基礎水溶液、又は他の相補的な基礎水溶液との混合物と；から構成されることを特徴とする培養培地処方。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 組織、及び／又は細胞、及び／又はウィルス、及び／又は細胞コンポーネント、及び／又はタンパク質に関係する物質、及び／又は炭水化物、及び／又はヌクレチド物質、及び／又は脂質物質、及び／又は一次代謝物質、及び／又は二次代謝物質、あるいは、バイオ燃料の製造、ワクチンの製造、薬の製造、バイオポリマーの製造、又はこれらの前躯体の製造等の生物学的製造プロセスにおける製造物の混合物の、数量及び／又は品質を増大させることを特徴とする使用。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 植物界又は動物界の細胞株の細胞培養培地の組成、あるいは酵母や菌類等の他の真核性単細胞又は多細胞有機体の組成を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 原核生物有機体の細胞培養培地の組成を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 幹細胞の細胞培養培地の組成を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 細胞機能のバイオマーカーを同定することを特徴とする使用。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 疾患状態に関連付けられた細胞機能を変更するように指向された薬を設計し、あるいは薬混合物を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法を備えたバイオマーカーのアイデンチファイア。 請求項１〜１７のいずれか一項に記載された方法を備えた薬の設計システム。 本発明は、細胞培養基の組成を最適化するための新規な方法に関する。この新規な方法は、２つの主要なステージを備えている。第一のステージにおいて、特定の細胞培養プロトコール及びエキソメタボローム・アッセイ・プロトコールを実行することによって、細胞機能及び培地因子のスクリーンを介して、機能エンバイロミクスマップが構築される。機能エンバイロミクスマップは、培地因子に対する基本的細胞機能の強度値のデータアレイから構成される。第二のステージにおいて、機能エンバイロミクスマップの列から、標的となる基本的な細胞機能を高め、あるいは、抑制するように、最適化された細胞培養基処方が開発される。本発明の主要な効果は、細胞培養培地組成の調整を介して代謝操作を可能にし、著しく経験的で、細胞機能に指向されておらず、極めて多数の実験が必要な従来の方法とは異なり、培地因子を介して、任意の多数の細胞機能を最適化することができる。さらに、この新規な方法は、費用対効果の高いエキソメタボロム・アッセイに基づくもので、費用のかかる細胞内ゲノムやプロテオミック・アッセイが必要ない。【選択図】図１ 20120703A16333全文3 最適な細胞培養培地の組成を決定する方法であって、 ａ）標的生物学的構造を選択するステップと； ｂ）ステップａ）の前記標的生物学的構造を規定する生化学的形質転換のセットを定めるステップと； ｃ）ステップａ）の選択された前記標的生物学的構造のＫ個の基本的細胞機能のセットを定めるステップであって、各基本的細胞機能は、ステップｂ）の細胞内生化学的形質転換のサブセットから構成され、及び／又は、自律的機能及び／又はモジュラー生物学的機能を設定し、Ｋ個の全ての基本的細胞機能の組合せがステップａ）の前記標的生物学的構造の機能をもたらすステップと； ｄ）ステップａ）の前記標的生物学的構造のステップｃ）の前記Ｋ個の基本的細胞機能の環境を決定するＮ個の培地因子のセットを定めるステップと； ｅ）前記培地因子の数に１を加算した（Ｎ＋１）以上の数の培養を含む培養実験の第一のランを実行するステップであって、各培養が異なる培養培地組成で実行され、低いレベルの培地因子と高いレベルの培地因子の組合せがスクリーンされるステップと； ｆ）実行された培養実験各々に対して、初期及び最終のバイオマス、生成物、及びエキソメタボロームのデータ、又は、一部のエキソメタボロームのデータを取得するステップと； ｇ）相対的重み付け係数λｊがゼロよりも高い活性基礎的細胞機能のサブセットを、下記の線形モデルを用いて、前記エキソメタボロームのデータ、又は培地組成データに対して誘導されたエキソメタボロームのデータの回帰分析によって決定するステップと（ただし、ｖは要素が測定されたエキソメタボロームのコンポーネントの変化率を表すベクトルであり、Ｉi，ｊは回帰解析によって決定された培地因子iによる基本的細胞機能ｊの活性化強度パラメータである）； ｈ）活性化細胞機能の数に１を加算した数以上の数の培養を含む培養実験の第二のランを実行するステップであって、各培養が異なる培養培地組成で実行され、前記培地組成は、活性化基本的細胞機能の重み付き係数の低い値と高い値を、前記培地因子によって制御される活性化細胞機能のサブセットと特定するように予め決定された前記強度パラメータＩｉ，ｊの値を用いて、スクリーンするために設定されるステップと； ｉ）すべての前記ステップにおいて、式（３ａ）及び（３ｂ）を用いた線形回帰解析によって収集されたデータから機能的エンバイロミックスマップを構築し、かつ、前記データを前記機能的エンバイロミックスマップの形に体系化するステップであって、実験の前記第一のランによって決定された前記強度パラメータＩｉ，ｊの値が、実験の前記第二のランのデータによって補正され、Ｎ×Ｋのデータアレイ（機能的エンバイロミックスマップ＝｛Ｉｉ，ｊ｝）の形にするステップと； ｊ）前記機能的エンバイロミックスマップを用いて、一又は複数の基本的細胞機能を活性化又は抑制化するように指向された細胞培養培地の組成を最適化するステップと；を備えることを特徴とする方法。 請求項１記載の方法であって、 前記ステップｅ）における前記培養培地組成の最適化は、 前記機能エンバイロミクスデータの行列を用いて、基本細胞機能特殊培地組成を形成するステップであって、前記培地因子の値の変化値Δ（ＦＡＣｊ）により、に従って基本的細胞機能の相対的重みの変化値Δλiを求めるステップと； 前記機能的エンバイロミックスデータアレイのｊ番目の列に適用される式（４）を用いて、単一の基本的細胞機能ｊを高める、あるいは、抑制するように培養培地組成を形成するステップと； 前記培養培地組成を形成し、前記機能的エンバイロミックスデータアレイの複数の列に同時に適用される式（４）を用いて、基本的細胞機能の臨界的セットを高める、あるいは、抑制することにより、細胞代謝を操作するステップと；を備えることを特徴とする方法。 請求項１又は２記載の方法であって、 前記標的生物学的構造が、細胞組織、全細胞、細胞小器官、又は所定の細胞機能を示す生化学的形質転換のコヒーレントなセットであることを特徴とする方法。 請求項１又は２記載の方法であって、 前記標的生物学的構造が、遺伝子学的に修飾され、前記基本的細胞機能の活性化又は抑制化に指向させる遺伝子修飾を含むことを特徴とする方法。 請求項１又は２記載の方法であって、 前記培地因子が、必須の栄養素及び／又は微量栄養素及び／又は生物学的機能分子の、固体及び／又は液体及び／又は気体の混合物の物理化学的特性、前記化合物の放出率、あるいは、前記化合物の摂食率であることを特徴とする方法。 請求項１〜２、５のいずれか一項に記載の方法であって、 前記物理化学的特性が、温度、及び／又は圧力、及び／又はｐＨ、及び／又はイオン強度、及び／又は濃度、及び／又は活性、及び／又は容積モル浸透圧濃度、及び／又は重量モル浸透圧濃度、及び／又は関連する特性であることを特徴とする方法。 請求項１〜２、５のいずれか一項に記載の方法であって、 必須の栄養素及び／又は微量栄養素及び／又は生物学的機能分子は、 塩、及び／又はビタミン、及び／又は代謝の共同因子、及び／又は抗生物質、及び／又は炭水化物、及び／又は脂質物質、及び／又はタンパク性物質、及び／又はヌクレオチド物質、及び／又はシグナル伝達タンパク質、及び／又は酵素の活性を抑制する分子、及び／又はタンパク質の活性分子、及び／又は遺伝子形質転換モジュレータ、及び／又は干渉性リボ核酸、及び／又は、前記物質と、血清、純粋なヒドロシレイト、又は複合有機物質を含む既知又は未知の組成物との複合混合物を含む、無機物質及び／又は有機物質であることを特徴とする方法。 請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、 前記培養培地の式は、培養培地の式＝｛ＦＡＣｊ｝，ｊ＝１，・・・，Ｎ（但し、ＦＡＣｊが前記培地因子ｊの値である。）を用いて、Ｎ個の培地因子の値によって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、 前記標的生物学的構造は、 標的生物学的構造＝｛ｅi｝，ｉ＝１，・・・，Ｋ（但し、ｅiは、ｑ個の要素のベクトルであり、前記要素の値は基本的細胞機能ｉにおける各生化学反応の重み付き係数を表す。）を用いて、ｑ個の生化学的反応と、Ｋ個の基本的細胞機能とによって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、 前記基本的細胞機能は、前記標的生物学的構造の生物学的ネットワークから得られ、 前記生物学的ネットワークは、生物学的形質変換のサブセットを含むＫ個の機能的サブネットワークに分割され、 前記サブネットワークがマニュアルで及び／又は自動的に得られることを特徴とする方法。 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、 前記基本的細胞機能は、前記標的生物学的構造の生物学的ネットワークのゲノム・スケール・リコンストラクションから得られ、 Ｋ個の基本的細胞機能のワーキング・セットは、トランスクリプトームデータ、及び／又はプロテオームデータ、及び／又はエンドメタボロームデータ、及び／又は熱力学的データが利用可能であるとき、前記データを用いて予め縮小されることを特徴とする方法。 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、 前記機能的エンバイロミックスマップは、振とうフラスコ、Ｔフラスコ、リアクタ、マイクロプレート、マイクロバイオリアクタ、又は表現型マイクロアレイの中で実行される、連続的培養実験及び／又は並列的培養実験によって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、 前記機能的エンバイロミックスマップは、 液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等のクロマトグラフィー法、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ等のＮＭＲ法、質量分析法（ＭＳ）、又は、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ等の質量分析法に組み合わせたクロマトグラフィー法によって、あるいは、これらを組み合わせた方法によって、新規な培養培地サンプル又は使用済みの培養培地サンプルの上清の解析を含むエキソメタボロームアッセイ法によって決定されることを特徴とする方法。 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、 前記活性化基本的細胞機能の縮小したセットは線形回帰解析又は非線形回帰解析によって同定され、 エキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータの分散又は共分散が最大化され、 エキソメタボロームデータ又は誘導されたエキソメタボロームデータと培地因子の値との相関が最大化され、 前記基本的細胞機能が、前記培地因子の値との相関又は前記培地因子の値に対する感度に従ってランク付けされることを特徴とする方法。 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、 前記機能的エンバイロミックスマップが高スループットの自動化システムによって決定され、 培養化デバイス、解析エキソメタボロームデバイス、及びコンピュータ・アルゴリズムが物理的デバイスに接続され、高スループットの機能的エンバイロミックスマップが得られることを特徴とする方法。 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法であって、 製品量及び／又は製品品質に関連付けられた前記標的基本的細胞機能ｉが、相対的重量Δ（λi）を６０％〜１００％増大させることを特徴とする方法。 異種のタンパク質発現機能を６０％〜１００％の範囲で高めることを特徴とし、酵母ピチア・パストリスの培養のための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法によって得られた、化学的に定義された培養培地処方であって、 ａ）１２．０ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１６ｇ／ＬのＮａＩ、６．００ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４０ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４０．０ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、３．２５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌのビオチン、１０．０ｇ／ＬのＨ２ＳＯ４によって構成された微量成分の水溶液と； ｂ）水溶液ａ）と、２６．７０ｍｌ／Ｌの８５％Ｈ３ＰＯ４、０．９３ｇ／ＬのＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、１８．２０ｇ／ＬのＫ２ＳＯ４、１４．９０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．１３ｇ／ＬのＫＯＨによって構成される相補的な基礎水溶液、又は他の相補的な基礎水溶液との混合物と；から構成されることを特徴とする培養培地処方。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 組織、及び／又は細胞、及び／又はウィルス、及び／又は細胞コンポーネント、及び／又はタンパク質に関係する物質、及び／又は炭水化物、及び／又はヌクレチド物質、及び／又は脂質物質、及び／又は一次代謝物質、及び／又は二次代謝物質、あるいは、バイオ燃料の製造、ワクチンの製造、薬の製造、バイオポリマーの製造、又はこれらの前躯体の製造等の生物学的製造プロセスにおける製造物の混合物の、数量及び／又は品質を増大させることを特徴とする使用。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 植物界又は動物界の細胞株の細胞培養培地の組成、あるいは酵母や菌類等の他の真核性単細胞又は多細胞有機体の組成を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 原核生物有機体の細胞培養培地の組成を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 幹細胞の細胞培養培地の組成を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 細胞機能のバイオマーカーを同定することを特徴とする使用。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法の使用であって、 疾患状態に関連付けられた細胞機能を変更するように指向された薬を設計し、あるいは薬混合物を最適化することを特徴とする使用。 請求項１〜１６のいずれか一項に記載された方法を備えた薬の設計システム。