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| タイトル： | 公開特許公報(A)_コラーゲンの分析方法、安定同位体標識コラーゲン等および前記安定同位体標識コラーゲンの製造方法 |
| 出願番号： | 2013238229 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | G01N 27/62,C07K 14/78,C12P 21/02,C07K 7/06,C07K 7/08 |
特許情報キャッシュ
多賀 祐喜 楠畑 雅 後藤 希代子 服部 俊治 JP 2014130134 公開特許公報(A) 20140710 2013238229 20131118 コラーゲンの分析方法、安定同位体標識コラーゲン等および前記安定同位体標識コラーゲンの製造方法 株式会社ニッピ 000135151 木村 満 100095407 齋藤 悦子 100111464 多賀 祐喜 楠畑 雅 後藤 希代子 服部 俊治 JP 2012260851 20121129 G01N 27/62 20060101AFI20140613BHJP C07K 14/78 20060101ALI20140613BHJP C12P 21/02 20060101ALI20140613BHJP C07K 7/06 20060101ALN20140613BHJP C07K 7/08 20060101ALN20140613BHJP JPG01N27/62 VC07K14/78C12P21/02 ZG01N27/62 DC07K7/06C07K7/08 4 ＯＬ 41 2G041 4B064 4H045 2G041CA01 2G041DA05 2G041EA04 2G041FA12 2G041FA22 2G041FA23 2G041FA24 2G041HA01 2G041JA02 2G041JA05 2G041LA08 4B064AG01 4B064CA10 4B064DA13 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA10 4H045CA40 4H045EA50 4H045FA71 本発明は、安定同位体標識コラーゲンを用いたコラーゲンの分析方法、前記分析方法で使用できる安定同位体標識コラーゲン等、および前記安定同位体標識コラーゲンの製造方法に関する。 コラーゲンは生体内のタンパク質の約３０％を占める重要な構成物質である。生体内には３０種類近いコラーゲンが各組織に特有の組成で分布し、年齢や生理的条件、疾患などによりその組成を変化させることが知られている（非特許文献１）。また、コラーゲンに特有の翻訳後修飾アミノ酸として、３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ（３Ｈｙｐ）、４−ｈｙｄｏｒｘｙｐｒｏｌｉｎｅ（４Ｈｙｐ）、ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ（Ｈｙｌ）、ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ（ＧＨＬ）、ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ（ＧＧＨＬ）が知られ、同じコラーゲン型でも組織や疾患、その他の条件でその量が増減することも報告されている（非特許文献１）。組織中のコラーゲン型組成の変動や、コラーゲン翻訳後修飾アミノ酸量の変化は、癌、線維症、骨粗しょう症、骨形成不全症など様々な疾患で報告されており、各種コラーゲン値の測定は疾患の診断の予知に有効と考えられ、コラーゲン測定の意義が高まっている。このため、ＨＩＬＩＣ系カラムを用いて非常に構造の類似した３Ｈｙｐと４Ｈｙｐを分離し、それを液体クロマトグラフ質量分析（以下、ＬＣ／ＭＳ分析と称する）で分析する方法や（非特許文献２）、Ｉ〜Ｖ型コラーゲンをトリプシン消化した後、それぞれに特有のペプチドを用いてＬＣ／ＭＳ分析により組織由来コラーゲンの型別の検出・定量を行う方法（非特許文献３）が開発されている。その他、このようなコラーゲンの測定方法として、コラーゲンに対するモノクローナル抗体を検体中のコラーゲンと結合させ、該検体中のコラーゲンを測定するコラーゲンの測定方法なども知られている（特許文献１）。 一方、安定同位体標識ペプチドを用いたタンパク質の定量方法も知られている（特許文献２）。定量対象タンパク質と、複数の評価ペプチドを含む人工標準タンパク質の既知量との混合液を消化酵素で分解するａ工程と、ａ工程で得られた試料に、既知量の安定同位体標識評価用ペプチドと、前記定量対象タンパク質の消化物であるペプチドと同一配列の安定同位体標識ペプチドとを添加して質量分析を行うｂ工程と、添加した人工標準タンパク質の量と各評価ペプチドの定量値から、前処理効率の評価値を計算するｃ工程とを含む、タンパク質の定量方法である。前記評価ペプチドは、天然に存在するタンパク質およびその変異体と一致せず、質量分析によって検出が可能であるアミノ酸配列からなり、かつタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有する。この評価ペプチドを使用することで、任意の測定試料の前処理の効率を評価することができ、タンパク質定量値の信頼性を確保しうるという。 また、標的タンパク質と、特定量の前記標識タンパク質に相当する安定同位体標識タンパク質との混合物にペプチド断片化処理を施し、得られるペプチド断片群に対して質量分析を行い、標的タンパク質由来ペプチド断片／安定同位体標識タンパク質由来ペプチド断片の比を定量し、全ての各標的タンパク質由来ペプチド断片の定量値の平均を求めて平均定量値とし、前記平均定量値と各標的タンパク質由来ペプチド断片との差を質量変化として検出する方法がある(特許文献３）。当該方法によれば、標的タンパク質の翻訳後修飾、遺伝子変異による標的タンパク質の配列異常、スプライシングバリアント、プロテアーゼによるタンパク質の切断や分解などによる質量変化を分析しうるという。特開平６−２４２１０９号公報特開２０１０−１９７１１０号公報国際公開第２０１２／１１１２４９号Ｔｈｅ ｃｏｌｌａｇｅｎｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ,１９９２Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｏｎ−ｌｉｎｅ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ:Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，３０（３）,ｐｐ２９１−２９７,２００６Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ＨＰＬＣ−ＭＳ/ＭＳ:Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ，３１（２０）,ｐｐ３４８３−３４８８,２００８Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｐａｒａｐ／ＥＮＤＯ１８０：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８６（３７），ｐｐ３２７３６−３２７４８、２０１１Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｙｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｔｅｎｄｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ． Ｍ．Ｓｔｏｌｔｚ， Ｈ．Ｆｕｒｔｈｍａｙｒ， Ｒ．Ｔｉｍｐｌ ：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ．:Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，３１０，ｐｐ４６１−４６８，１９７３Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｄｒｏｃｙｌｙｓｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎｅ． Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ． Ｓｐｉｒｏ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２４４，Ｎｏ．３,ｐｐ６０２−６１２，１９６９ しかしながら、前記特許文献１に示す抗体を使う方法では、コラーゲンの型特異的な分析を行うことが容易でない。コラーゲンはグリシンをＧｌｙ、アミノ酸をＸ、Ｙとした場合にＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される繰り返し配列を主要部分とするため、コラーゲン型間の交差反応が生じやすいからである。また、マイナー成分を含む型別のコラーゲン定量や、コラーゲン翻訳後修飾の分析としても、３Ｈｙｐと４Ｈｙｐを区別した解析、微量な３Ｈｙｐ、ＧＨＬ、ＧＧＨＬの分析などは困難である。 また、非特許文献２、非特許文献３に記載される質量分析による方法では、夾雑物の存在や、ＨＩＬＩＣ系カラムでの溶出時間の変動などにより、サンプル間でのイオン化効率の違いや、それに由来する定量値の測定誤差が生じる場合がある。特に、わずかに混在する他種型コラーゲンの定量や３Ｈｙｐ、ＧＨＬ、ＧＧＨＬ等の微量成分の定量ではこれらの誤差が測定値に大きく影響を及ぼし、微量コラーゲン型のタンパク質レベルでの定量やコラーゲン翻訳後修飾を網羅した正確な定量分析は困難である。 更に、前記特許文献２に記載される方法は、安定同位体標識評価用ペプチドの既知量を基準に、人工標準タンパク質の消化物であるペプチドの質量との比率を算出してタンパク質消化酵素による処理効率を加味するものである。消化効率を評価するため、人工標準タンパク質の消化物であるペプチドと同一配列であって安定同位体標識された４種の評価ペプチドを調製する必要がある。また、特許文献２では、１３Ｃで６個標識されたロイシンなどを使用してＦ−ｍｏｃ法で前記安定同位体標識ペプチドを合成しているが、複数種類を大量に生産することは容易でない。しかも、特許文献２記載の方法は、いずれの評価ペプチドで評価した場合でもその評価率が平均０．８以上、すなわち消化率が平均８０％以上の場合に前処理が十分に行われたと判断するに過ぎず、正確な定量を担保するものではない。従って、簡便な安定同位体標識タンパク質の調製方法、および正確な標的タンパク質の定量方法の開発が望まれる。 また、特許文献２および特許文献３記載の方法では、目的タンパク質のｃＤＮＡとタグ配列を挿入したベクターを大腸菌にトランスフォーメーションし人工標準タンパク質を合成しているが、その調製は容易でない。例えば特許文献３では内部標準物質として安定同位体標識タグタンパク質融合タンパク質を使用するが、実施例では、ＧＳＴとＨｉｓタグとを付加したネフリン（Ｎｅｐｈｒｉｎ）の全長アミノ酸配列を挿入したｐＥＴ−ｖｅｃｔｏｒを大腸菌にトランスフォーメーションし、硫酸マグネシウム七水和物を添加したＣ．Ｈ．Ｌ培地で３７度にてＯ．Ｄ．６００ｎｍが０．７になるまで培養し、安定同位体１５Ｎで標識したアミノ酸を０．５ｇ／Ｌになるように添加してネフリンの発現誘導を行った後、この発現誘導した大腸菌を超音波破砕し、コバルトカラムおよびグルタチオンカラムを用いて安定同位体標識ネフリンを精製している。このように、人工標準タンパク質の製造方法は煩雑であり、より簡便に標準タンパク質を調製しうる製造方法の開発が望まれる。 特許文献２および特許文献３記載の方法は、タンパク質の分解を酵素消化に限定しており、また特許文献３ではＬＣ／ＭＳ分析にて翻訳後修飾アミノ酸を含むペプチドを検出して翻訳後修飾アミノ酸を測定している。他方、翻訳後修飾アミノ酸の分析法としては、従来よりアミノ酸加水分解による各翻訳後修飾アミノ酸単体としての分析が行われている。安定同位体標識標準タンパク質を用いることにより、酵素分解時と同様に、加水分解効率や分析時のイオン化効率の影響等を吸収した高精度な分析が可能となるが、特許文献３記載の方法では、安定同位体標識標準タンパク質の製造方法が煩雑であるのと同時に、Ｈｉｓタグ等を用いて目的タンパク質の精製を行っても、他のタンパク質を全く含まず目的タンパク質を高純度に得ることは困難である。混入タンパク質がある場合、酵素処理によれば目的タンパク質由来のペプチドを用いた特異的な検出、定量が可能であるが、アミノ酸加水分解を行うと各翻訳後修飾がどのタンパク質由来であるかわからなくなるため、正確な定量分析が達成されない。よって、より高純度に安定同位体標識標準タンパク質を調製しうる製造方法の開発が望まれる。 また、特許文献２および特許文献３記載の方法は、測定対象タンパク質と内部標準物質との酵素による分解効率を問題とするため、タンパク質の分解を酵素消化に限定している。ペプチド以外を検出できないため、特許文献３ではＬＣ／ＭＳ分析にて翻訳後修飾アミノ酸を含むペプチドを検出して翻訳後修飾アミノ酸を測定している。このため、測定対象アミノ酸における翻訳後修飾を受けるアミノ酸の位置が不明である場合や位置が変動する場合は、翻訳後修飾アミノ酸を定量することができない。従って、アミノ酸単位で分析しうる安定同位体標識標準タンパク質を用いた高精度な分析方法の開発が望まれる。 上記現状に鑑み、本発明は、安定同位体標識タンパク質として安定同位体標識コラーゲンを用いた、定量性および感度に優れるコラーゲンの分析方法を提供することを目的とする。 また、本発明は、安定同位体標識アミノ酸による置換率が高い安定同位体標識コラーゲンおよびその製造方法を提供することを目的とする。 本発明者らは上記課題を解決すべくＬＣ／ＭＳ分析を用いたコラーゲンの分析方法について詳細に検討した結果、特定のアミノ酸が対応する安定同位体標識アミノ酸で９０モル％以上置換された高純度安定同位体標識コラーゲンを内部標準物質として用いることで、酵素分解によらず酸やアルカリによる加水分解物でも正確にアミノ酸を定量しうること、安定同位体標識アミノ酸として安定同位体標識Ｐｒｏや安定同位体標識Ｌｙｓを使用すると、これらアミノ酸およびこれらの翻訳後修飾アミノ酸の配合比を正確に定量しうること、更に安定同位体標識Ａｒｇを指標として換算することでコラーゲン当たりのアミノ酸の定量が可能となることを見出し、本発明を完成させた。また、培養細胞を使用することで、安定同位体標識コラーゲンを簡単に製造することができる。 すなわち本発明は、コラーゲンを構成するＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上のアミノ酸が対応する安定同位体標識アミノ酸（以下、標識アミノ酸とも称する。）で９０モル％以上置換された安定同位体標識コラーゲン前駆体（以下、標識コラーゲン前駆体とも称する。）を翻訳後修飾してなる安定同位体標識コラーゲン（以下、標識コラーゲンとも称する。）を使用するコラーゲンの分析方法であって、 前記標識コラーゲンと、測定対象コラーゲンまたはコラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチドとの混合物を測定試料とし、 前記コラーゲン由来ペプチド成分、または前記測定対象コラーゲンを分解して得たペプチドを測定対象ペプチドとし、前記測定対象ペプチドの質量と、前記標識コラーゲンを分解して得た、前記測定対象ペプチドに対応する前記標識コラーゲン由来ペプチドとの質量比（以下、測定対象ペプチド質量比とも称する。）を測定するペプチド質量比測定工程、および／または 前記コラーゲン由来アミノ酸、または前記測定対象コラーゲンを分解して得たアミノ酸を測定対象アミノ酸とし、前記測定対象アミノ酸の質量と、前記標識コラーゲンを分解して得た、前記測定対象アミノ酸に対応する前記標識コラーゲン由来のアミノ酸との質量比（以下、測定対象アミノ酸質量比とも称する。）を測定するアミノ酸質量比測定工程を含む、コラーゲンの分析方法を提供するものである。 また本発明は、下記（ｉ）〜(ｖ) （ｉ）前記測定対象アミノ酸質量比と前記測定試料に添加した標識コラーゲン量とから測定試料に含まれる測定対象コラーゲン量を定量する、 （ｉｉ）前記測定対象アミノ酸質量比と前記測定試料に添加した標識コラーゲンに由来するアミノ酸量とから測定対象コラーゲン構成アミノ酸量を定量する、 （ｉｉｉ）前記測定対象ペプチド質量比と前記測定試料に添加した標識コラーゲン量とから、測定対象コラーゲンの型別コラーゲン量を定量する、 （ｉｖ）前記測定対象ペプチド質量比と前記測定試料に添加した標識コラーゲン量とから、測定対象コラーゲン構成ペプチド量を定量する、 （ｖ）予め作成した前記測定対象アミノ酸質量比または前記測定対象ペプチド質量比の検量線を用いて測定対象コラーゲン由来成分を定量する、のいずれかの定量工程を含む、上記コラーゲンの分析方法を提供するものである。 また本発明は、コラーゲンを構成するＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上のアミノ酸が対応する標識アミノ酸で９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾してなる標識コラーゲンを提供するものである。 更に本発明は、コラーゲン産生細胞に、少なくとも安定同位体標識Ｐｒｏを添加して培養する標識コラーゲンの製造方法であって、Ｇｌｎを添加せずに前記コラーゲン産生細胞を培養し、 コラーゲンを構成するＰｒｏの安定同位体標識Ｐｒｏへの置換率が９０モル％以上である標識コラーゲンを取得することを特徴とする、標識コラーゲンの製造方法を提供するものである。 本発明によれば、標識コラーゲンを用いて、標識コラーゲンと測定対象コラーゲンとを分解し、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン由来の翻訳後修飾アミノ酸量、ペプチド量、全測定対象コラーゲン量の定量、および測定対象コラーゲンの型別定量をすることができる。 本発明では、コラーゲンを分解して得たアミノ酸やペプチドをＬＣ／ＭＳで分析できるため、ペプチドの質量比とアミノ酸の質量比とを並行して取り扱うことができる。 また、本発明によれば、標識アミノ酸によって高置換された標識コラーゲン、前記標識コラーゲン由来のアミノ酸組成物やペプチド組成物、および前記標識コラーゲンの製造方法が提供される。実施例１〜６の結果を示す図である。細胞に添加する安定同位体標識Ｐｒｏの添加量、およびＧｌｎ添加・非添加の条件を変化させた場合の、細胞から産生される標識コラーゲンを構成する安定同位体標識Ｐｒｏの置換率の変化を示す。実施例１〜６の結果を示す図である。細胞に添加する安定同位体標識Ｐｒｏの添加量、およびＧｌｎ添加・非添加の条件を変化させた場合の、細胞から産生される標識コラーゲンを構成する安定同位体標識４Ｈｙｐの置換率の変化を示す。実施例１で得た標識コラーゲンの電気泳動の結果を示す図である。コラーゲンＩ型とＩＩＩ型が混在している。実施例１２の結果を示す図である。実施例８で調製した標識コラーゲンを使用して、ラットの皮膚、骨、尻尾腱から分取したコラーゲンの型別コラーゲン量を定量したところ、皮膚由来のコラーゲンは２２．３％のコラーゲンＩＩＩ型が含まれていたが、骨および尻尾腱由来のコラーゲンは、約９９％がコラーゲンＩ型であった。実施例１４の結果を示す図である。実施例１３で調製した標識コラーゲンを使用してラットの皮膚、骨、尻尾腱から抽出したコラーゲンの翻訳後修飾を分析し、各組織間の相対比で評価したところ、既知報告と同様に尻尾腱での３Ｈｙｐの構成量が高い等の結果が得られた。実施例１５の結果を示す図である。折れ線グラフは、加水分解の経過時間による４Ｈｙｐ量の推移を示す。一方、棒グラフは、測定対象コラーゲンと添加した実施例１３で調製した標識コラーゲンとを同時に加水分解した際の、測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐと、標識コラーゲン由来の４Ｈｙｐとの比の変化を示す。実施例１６の結果を示す図である。折れ線グラフは、４Ｈｙｐ標品の検出値をＰＢＳ無添加時に対する百分率で示したものであり、棒グラフは、標識コラーゲン由来の標識４Ｈｙｐに対する４Ｈｙｐ標品の値を、ＰＢＳ無添加時に対する百分率で示したものである。実施例１７の結果を示す図であり、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ質量比を測定して血中遊離４Ｈｙｐ濃度、４Ｈｙｐ含有ペプチドなどの濃度を測定した結果を示す。実施例１７において、非標識４Ｈｙｐのピーク面積に基づいて血中遊離４Ｈｙｐ濃度、４Ｈｙｐ含有ペプチドなどの濃度を測定した結果を示す参考図である。実施例１７の結果を示す図であり、非標識オリゴペプチド／標識オリゴペプチド質量比を測定して血中オリゴペプチド濃度を測定した結果を示す。実施例１８の結果を示す図であり、実施例１３で調製した標識コラーゲンを使用して、細胞内取り込み量を評価したところ、Ｅ−６４ｄ投与により細胞内でのコラーゲンの分解が抑制された。実施例２０で得た標識コラーゲンのＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。 本発明の第一は、コラーゲンを構成するＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上のアミノ酸が対応する標識アミノ酸で９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾してなる標識コラーゲンを使用するコラーゲンの分析方法であって、前記標識コラーゲンと、測定対象コラーゲンまたはコラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチド成分との混合物を測定試料とし、前記ペプチド質量比測定工程、および／または前記アミノ酸質量比測定工程を含む、コラーゲンの分析方法である。測定試料に添加した標識コラーゲンを内部標準物質として使用するものであり、前記標識コラーゲンが酸等で分解された標識アミノ酸や、標識アミノ酸を含むペプチド（以下、標識ペプチドとも称する。）を内部標準物質として使用することができる。標識コラーゲンを分解すると、複数の標識アミノ酸や標識ペプチドが生成するため、標識コラーゲンはこれら内部標準物質の束として機能する。 標識アミノ酸を構成アミノ酸として含む標識コラーゲンの化学的性質は、標識アミノ酸を含まない非標識コラーゲンと同一であり、加水分解率や酵素分解率、操作過程での試料損失、ＬＣ／ＭＳ分析でのイオン化効率なども略同一である。一方、安定同位体標識原子の含有量により質量が異なり、これらの分解物であるペプチドやアミノ酸の質量分析を行うと標識体と非標識体とを質量差で区分することができる。よって、非標識体／標識体の質量比を検出し、前記質量比を試料に含まれる標識コラーゲン由来成分の質量で換算すれば、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン由来成分の質量を定量することができる。本発明で使用する標識コラーゲンは標識アミノ酸による置換率が高いため、コラーゲンを酸やアルカリで加水分解物し、例えば、コラーゲン中の翻訳後修飾アミノ酸量の定量等の高精度な分析を行うことができる。更に、酵素分解物に含まれる特定のペプチドのＬＣ／ＭＳ分析により、測定対象コラーゲンの型別定量などの高精度な分析を行うことができる。以下、本発明を詳細に説明する。 本分析方法で使用する「測定対象コラーゲン」としては、ブタ、ウシ、トリ、サカナ、ヒトなど、従来公知のいずれかのコラーゲンを対象とすることができる。コラーゲンは、生体内で３本鎖螺旋構造を形成するが「測定対象コラーゲン」としては、三本鎖螺旋構造を形成するものに限定されない。本発明において、測定試料に添加する測定対象コラーゲンは、これを予め酸、アルカリ、酵素その他で分解してなるアミノ酸組成物やペプチド組成物である場合を含むものとする。従って、コラーゲンを予め酸、アルカリ、酵素などによって分解されたゼラチンやコラーゲンペプチドであってもよい。 また、「コラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチド成分」とは、コラーゲンを起源とする測定対象のアミノ酸またはペプチド成分を意味する。コラーゲンはプロリンがヒドロキシル化されたヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）などを特有のアミノ酸として含有し、例えば３Ｈｙｐや４Ｈｙｐなどのアミノ酸や、ＰｒｏＨｙｐ、ＧｌｕＨｙｐ、ＬｅｕＨｙｐなどのＨｙｐ含有ペプチド、その他のコラーゲン代謝分解物がある。前記測定対象コラーゲンのアミノ酸組成物やペプチド組成物がコラーゲン分子を構成する全てのアミノ酸を含む組成物であるのに対し、「コラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチド成分」は、コラーゲン分子を構成する一部のアミノ酸や一部のペプチドでもよい点で相違する。 本発明で使用する「標識コラーゲン」とは、コラーゲンを構成するＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上のアミノ酸が対応する標識アミノ酸で９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾したものである。ここに、「標識コラーゲン前駆体」とはｍＲＮＡの情報に基づいてアミノ酸が結合して生成されたものを意味する。測定対象コラーゲンの構成アミノ酸には４Ｈｙｐ、３Ｈｙｐ、Ｈｙｌなどの翻訳後修飾アミノ酸が含まれるが、標識コラーゲン前駆体にはこれらは含まれない。このため本発明では、標識コラーゲン前駆体が翻訳後修飾された標識コラーゲンを使用することにした。 標識コラーゲン前駆体を構成する「標識アミノ酸」とは、アミノ酸を構成する少なくとも１以上の原子が、安定同位体標識原子で置換されたアミノ酸を意味する。従って、水素（Ｈ）に代えて重水素（Ｄ）で置換されたアミノ酸であってもよく、質量１３の炭素（１３Ｃ）で置換されたアミノ酸、質量１５の窒素（１５Ｎ）で置換されたアミノ酸などであってもよい。なお、当該安定同位体標識原子は、コラーゲンに組み込まれた際にコラーゲン中に含まれる位置に存在している必要がある。標識アミノ酸としては、炭素全てが１３Ｃで置換されたＬｙｓ（以下、１３Ｃ６−Ｌｙｓとも表記する。）、炭素全てが１３Ｃで置換され窒素全てが１５Ｎで置換されたＡｒｇ（以下、１３Ｃ６１５Ｎ４−Ａｒｇとも表記する。）、炭素全てが１３Ｃで置換され窒素全てが１５Ｎで置換されたＰｒｏ（以下、１３Ｃ５１５Ｎ１−Ｐｒｏとも表記する。）などを例示することができる。ただし、これらに限定されるものではない。 標識アミノ酸による置換率は、使用する標識アミノ酸のそれぞれ９０モル％以上、より好ましくは９５モル％以上、より好ましくは９７モル％以上である。使用する標識コラーゲンにおける置換率が低いと、ＬＣ／ＭＳ分析において標識コラーゲンに不純物として含まれる非標識コラーゲン由来のペプチドやアミノ酸のピークが測定対象コラーゲン由来のペプチドやアミノ酸のピークに含まれるため正確な定量ができない。本発明では、置換率が高い標識コラーゲンを使用することで測定誤差を低減させ、定量性を向上させることができる。なお、本発明における「置換率」は、後記する実施例に記載する方法で測定したものとする。 本発明で使用する標識コラーゲンは、いずれの方法で調製したものであってもよい。従って、標識アミノ酸を使用し、Ｆ−ｍｏｃ法で化学合成してもよく、標識アミノ酸を含む餌で飼育した動物の組織から、標識コラーゲンを抽出してもよい。しかしながらＦ−ｍｏｃ法によるコラーゲンの化学合成は容易でなく、動物組織から抽出したコラーゲンは、標識アミノ酸を含む餌のコストが高く、また年齢や疾患によって翻訳後修飾量が相異する場合がある。本発明では、コラーゲン産生細胞を使用することが好ましい。アミノ酸の翻訳後修飾が一定し、再現性に優れるからである。ここでコラーゲン産生細胞とは、実質的にコラーゲンを産生する細胞である。例えば皮膚線維芽細胞のように本来コラーゲン産生能を有する細胞であってもよく、例えばＣＨＯ細胞などのようにコラーゲン産生能を持たない細胞に、コラーゲン遺伝子を導入してコラーゲン産生能を付加したものであってもよい。 コラーゲン産生細胞に標識アミノ酸を添加して培養すれば、標識コラーゲン前駆体が産生され、ただちに翻訳後修飾される。細胞を破壊して細胞内に含まれるコラーゲンを抽出し、または培養上清または沈着コラーゲン層から翻訳後修飾された標識コラーゲンを抽出し、必要に応じて精製すればよい。これにより、置換率の高い標識コラーゲンを得ることができる。 使用するコラーゲン産生細胞は、その細胞が産生するコラーゲン型によって適宜選択することができる。例えば、Ｉ型の標識コラーゲンを得るには骨芽細胞や腱細胞などを、Ｉ型、ＩＩＩ型の標識コラーゲンを得るにはヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＥＬ細胞）、皮膚線維芽細胞、星細胞などを、ＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型の標識コラーゲンを得るにはラット軟骨肉腫細胞（ＲＣＳ細胞）や軟骨細胞などを例示することができる。その他、Ｉ〜ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのいずれも、当該コラーゲン産生細胞を使用することで標識コラーゲンを得ることができる。ＣＨＯ細胞のようにコラーゲン産生能を持たない細胞に目的のコラーゲン遺伝子を導入し、目的とするコラーゲン型の標識コラーゲンを得てもよい。好ましくは、産生するコラーゲンの翻訳後修飾前のアミノ酸配列が解明されているコラーゲン産生細胞である。 コラーゲン産生細胞に添加する標識アミノ酸量は、培地１リットル当り２０〜３００ｍｇであることが好ましく、より好ましくは４０〜２５０ｍｇ、特に好ましくは４０〜２００ｍｇである。Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓは必須アミノ酸であり、Ａｒｇは準必須アミノ酸であるため標識アミノ酸として供給することで高い置換率を確保することができる。 ただし、安定同位体標識Ｐｒｏで置換した標識コラーゲンを製造する場合は、培地１リットル当り安定同位体標識Ｐｒｏを５０〜５００ｍｇ添加し、より好ましくは１００〜４００ｍｇ、特に好ましくは１５０〜３５０ｍｇ添加する。Ｐｒｏは必須アミノ酸ではなく細胞内で他のアミノ酸が変換してＰｒｏとなりコラーゲンを構成するため、安定同位体標識Ｐｒｏの置換率が低下しやすい。しかしながら安定同位体標識Ｐｒｏの添加量を上記範囲に調整すると、安定同位体標識Ｐｒｏによる置換率を向上させることができる。 更に、後記する実施例に示すように、培地にＧｌｎを供給することなく培養することで、安定同位体標識Ｐｒｏの置換率をより向上させうることが判明した。なお、Ｇｌｎの供給がなくてもコラーゲン合成量は抑制されず、高収率で標識コラーゲンを製造することができる。 培養時間は２日以上、より好ましくは３日以上である。連続培養であってもよい。標識アミノ酸の供給量にもよるが、培養１日目は細胞に残存する非標識アミノ酸を使用してコラーゲンが産生されるため置換率が低いが、経時的に置換率が向上し、６日以降の置換率は略横ばいとなる。コラーゲン産生細胞により標識コラーゲン前駆体が産生され、順次翻訳後修飾が行われ標識コラーゲンが形成され細胞外に放出される。なお、培地には標識コラーゲンのほか、分泌タンパク質や血清由来タンパク質などが混在する場合がある。加水分解して測定する場合、これら不純物が標識コラーゲンに混入されると測定誤差となる。不純物が混在する場合には、培養後の培地に対しペプシンなどのタンパク分解酵素でコラーゲン以外のタンパク質を分解し、さらに塩析で標識コラーゲンを精製してもよい。この際、タンパク分解酵素を固定化酵素として分解反応を行うとこれらタンパク分解酵素の混入を回避することができる。 上記方法で得られる標識コラーゲンは溶液として分取される。当該溶液に含まれる標識コラーゲンの標識アミノ酸による置換率は、一般にアミノ酸毎に９０モル％以上である。 なお、コラーゲン産生細胞として骨芽細胞を使用すると主としてコラーゲンＩ型が生産されるため、コラーゲンＩ型の型別定量、全コラーゲン量の定量や、翻訳後修飾アミノ酸量の定量などを行うことができる。一方、皮膚線維芽細胞を培養すると、コラーゲンＩ型のほかにコラーゲンＩＩＩ型も混在する。このような標識コラーゲンＩ型とＩＩＩ型との混合物を使用し、全コラーゲンの定量や翻訳後修飾アミノ酸量の定量、試料に含まれるＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの型別定量を行うことができる。同様に、分析の用途に応じ、コラーゲンの特定の型のみが含まれるものであっても、異なる２種以上が含まれるものであっても、型別定量、全コラーゲン定量、翻訳後修飾定量を行う事ができる。 標識コラーゲンとしては、安定同位体標識Ｐｒｏおよび／または安定同位体標識Ｌｙｓを含む標識コラーゲン、更に、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓの少なくとも１以上の標識アミノ酸で置換した標識コラーゲンがある。測定対象コラーゲンの測定項目にあわせて適宜選択することができる。特に、Ａｒｇなどの翻訳後修飾を受けないアミノ酸（以下、不修飾アミノ酸とも称する場合がある。）を含めると、標識コラーゲン由来の不修飾アミノ酸と測定対象コラーゲン由来の不修飾アミノ酸との質量比を用いて、コラーゲン当りのアミノ酸量を定量することができる。このような標識アミノ酸としては、コラーゲンにおける含有量が高く、コラーゲンでの組成比も安定している点で安定同位体標識Ａｒｇ、安定同位体標識Ｖａｌ、安定同位体標識Ｌｅｕが好ましく、より好ましくは安定同位体標識Ａｒｇである。コラーゲンを、例えばトリプシンで消化するとＣ末端が安定同位体標識Ａｒｇや安定同位体標識Ｌｙｓとなるため、少なくともペプチド当たり１以上の標識アミノ酸を含有させることができる。 なお、本発明において、測定試料に添加する標識コラーゲンは、これを予め酸、アルカリ酵素、その他で分解してなるアミノ酸組成物やペプチド組成物である場合を含むものとする。なお、安定同位体標識Ｐｒｏや、安定同位体標識Ｌｙｓで置換した標識コラーゲンの分解物には、標識コラーゲンに由来する安定同位体標識Ｐｒｏや安定同位体標識Ｌｙｓの他、翻訳後修飾アミノ酸として、安定同位体標識４Ｈｙｐ、安定同位体標識３Ｈｙｐ、安定同位体標識Ｈｙｌ、安定同位体標識ＧＨＬ、安定同位体標識ＧＧＨＬ、およびこれらを含有するペプチドなどが含まれる。 上記標識コラーゲンのアミノ酸組成は、例えば、標識コラーゲンを酸やアルカリなどで分解してアミノ酸組成物を調製し、ＬＣ／ＭＳにより各アミノ酸の質量比を分析することで求めることができる。また、全アミノ酸量から、標識コラーゲンの全コラーゲン濃度を算出することができる。更に、既知量の精製コラーゲンＩ型と標識コラーゲンとを共に酵素分解し、ＬＣ／ＭＳにより、精製コラーゲンＩ型由来の所定ペプチドと標識コラーゲン由来の所定ペプチドとの質量比を求め、この質量比に精製コラーゲンＩ型の質量を乗じ、標識コラーゲンＩ型の濃度を求めることができる。コラーゲンＩＩ型などの濃度は上記に準じて定量することができる。 以下、上記標識コラーゲンを使用してコラーゲンを分析する方法を具体的に説明する。 本発明の分析方法で使用する測定試料には、標識コラーゲンと、測定対象コラーゲンまたはコラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチド成分とが含まれる。前記したように測定対象コラーゲンおよび標識コラーゲンは、未分解のコラーゲンであってもよく、予め分解されたアミノ酸組成物やペプチド組成物であってもよい。測定対象コラーゲンと標識コラーゲンとの混合物に分解処理を行えば、分解工程で生じる両者間の誤差を相殺することができる。なお、測定対象コラーゲンに代えて、コラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチド成分を分析する場合は、分析目的に応じて適宜加水分解や酵素分解を行い、更に分解した後に分析をすることができる。 コラーゲンをアミノ酸に加水分解する酸やアルカリとしては、従来タンパク質の分解に使用される各種の酸やアルカリを使用することができ、酵素分解によってアミノ酸を得てもよい。また、コラーゲンからペプチドを得る酵素としては、エンドペプチダーゼが好適である。例えば、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ、リシルエンドペプチダーゼ、Ａｒｇ−Ｃエンドペプチダーゼ、キモトリプシンなどを例示することができ、酸やアルカリ分解によってペプチドを得てもよい。酵素を使用する場合は、Ｃ末端がＡｒｇまたはＬｙｓとなるトリプシンが好適である。安定同位体標識Ａｒｇや安定同位体標識Ｌｙｓで置換された標識コラーゲンをトリプシンで分解すると、Ｃ末端が安定同位体標識Ａｒｇや安定同位体標識Ｌｙｓとなり、ＬＣ／ＭＳ分析に好適なアミノ酸長のペプチドを得ることができる。 本発明では、コラーゲン型に特有のペプチドを測定対象とすることで、コラーゲン型の分析および定量を行うことができる。このようなＬＣ／ＭＳ分析の際に指標となる型特有のペプチドとして、アミノ酸数が８〜２０であり、標識アミノ酸を1以上、より好ましくは２以上含み、コラーゲン型に特有のアミノ酸配列を有するペプチドがある。本発明では、このような指標ペプチドとして、たとえばＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲ（Ｏは４Ｈｙｐを示す）、ＧＶＶＧＬＯＧＱＲ、ＥＧＰＶＧＬＯＧＩＤＧＲ、ＧＰＳＧＰＱＧＩＲ、ＧＩＶＧＬＯＧＱＲ、ＧＳＯＧＡＱＧＬＱＧＰＲ、ＧＲＯＧＬＯＧＡＡＧＡＲ、ＧＬＡＧＰＯＧＭＯＧＰＲ、ＧＰＯＧＩＯＧＡＯＧＫ、ＧＰＴＧＥＬＧＤＯＧＰＲおよびＬＧＶＯＧＬＯＧＹＯＧＲからなる群から選択されるいずれかを好適に使用することができる。ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲ、ＧＶＶＧＬＯＧＱＲ、ＥＧＰＶＧＬＯＧＩＤＧＲおよびＧＰＳＧＰＱＧＩＲはコラーゲンＩ型に特有の配列である。従って、コラーゲンＩ型の定性および定量を行うことができる。なお、このアミノ酸配列は、ヒト、ウシ、ラット、マウスなどのコラーゲンＩ型にも共通する。従って、上記ペプチドを使用してこれら動物種由来のコラーゲンの型別定量を行うことができる。同様に、ＧＩＶＧＬＯＧＱＲおよびＧＳＯＧＡＱＧＬＱＧＰＲは、コラーゲンＩＩ型に特有の配列であり、ＧＲＯＧＬＯＧＡＡＧＡＲおよびＧＬＡＧＰＯＧＭＯＧＰＲはコラーゲンＩＩＩ型に特有の配列であり、ＧＰＯＧＩＯＧＡＯＧＫおよびＧＰＴＧＥＬＧＤＯＧＰＲは、コラーゲンＩＸ型に特有の配列であり、ＬＧＶＯＧＬＯＧＹＯＧＲはコラーゲンＶ型やＸＩ型に特有の配列である。いずれも、コラーゲンの型別定量に好適に使用することができる。このような型特有のペプチドは、コラーゲンをトリプシンで分解することで生成させることができる。 本発明では、前記測定試料アミノ酸質量比や測定試料ペプチド質量比をＬＣ／ＭＳ分析で定量する。なお、ＬＣ／ＭＳ分析は、従来公知の装置を使用し、従来公知の方法で行うことができる。測定試料アミノ酸質量比や測定試料ペプチド質量比は、質量分析の際の所定成分のピーク高さやピーク面積を測定することで定量することができる。 （１）コラーゲン構成アミノ酸量の定量方法 コラーゲンを構成するアミノ酸は、通常、コラーゲン１モルにおけるアミノ酸残基数を、コラーゲン１０００残基当たりのアミノ酸残基数に換算して表記される。本発明によれば、上記標識コラーゲンを使用し、測定対象コラーゲンを構成するアミノ酸の組成比を定量することができる。 使用する標識コラーゲンとしては、測定対象となるＰｒｏやＬｙｓが標識アミノ酸で９０モル％以上置換され、更に、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上の標識アミノ酸で９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾したものを使用する。便宜のため、安定同位体標識Ｐｒｏ、安定同位体標識Ｌｙｓおよび安定同位体標識Ａｒｇで置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾した標識コラーゲンを使用し、翻訳後修飾Ｐｒｏおよび翻訳後修飾Ｌｙｓを定量する場合で説明する。 まず、測定対象コラーゲンに既知量の標識コラーゲンを添加して測定試料とする。測定対象コラーゲンおよび標識コラーゲンは、予めアミノ酸に分解したものを合一して測定試料としたものであってもよく、両者の混合物を同時に分解して得たアミノ酸組成物を測定試料としてもよい。なお、コラーゲンを酸で加水分解するとＧＨＬやＧＧＨＬに含まれる糖鎖が切断される場合があり、目的に合わせて酸加水分解、アルカリ加水分解、酵素分解とを適宜選択し、組み合わせることが好ましい。例えば、酸加水分解物の分析により、Ｐｒｏが翻訳後修飾されてなる４Ｈｙｐや３Ｈｙｐ、Ｌｙｓが翻訳後修飾されてなるＨｙｌを定量し、アルカリ加水分解物を使用してＧＨＬ、ＧＧＨＬなどを定量することができる。 使用する標識コラーゲンの型は、測定対象コラーゲンと同じであることが好ましい。３Ｈｙｐ、ＧＧＨＬなどは、コラーゲンの型によって含有量が異なる場合があるからである。なお、４ＨｙｐやＡｒｇなどはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型等、多くの主要なコラーゲン型で含有量がほぼ共通するため、何れかのコラーゲン型の４Ｈｙｐを定量する際に標識コラーゲンＩ型を使用することができる。 測定対象コラーゲンを構成する４Ｈｙｐを定量する場合には、ＬＣ／ＭＳ分析により、標識コラーゲン由来の安定同位体標識４Ｈｙｐ（以下、標識４Ｈｙｐと称する場合がある。）と測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐ（以下、非標識４Ｈｙｐと称する場合がある。）との質量比、例えば、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを測定する。同様にして安定同位体標識Ａｒｇ（以下、標識Ａｒｇと称する場合がある。）と非標識Ａｒｇ（以下、非標識Ａｒｇと称する場合がある。）との質量比、例えば、非標識Ａｒｇ／標識Ａｒｇを測定する。 測定試料に添加した標識コラーゲン由来４Ｈｙｐの質量がＹ４Ｈｙｐの場合、Ｙ４Ｈｙｐ×非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ＝Ｚ４Ｈｙｐを算出すれば、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐの質量をＺ４Ｈｙｐとして求めることができる。 測定試料に含まれる測定対象コラーゲン１モル当たりの４Ｈｙｐ量を求めるには以下の換算を行えばよい。コラーゲンを構成するＡｒｇはコラーゲンでの組成比が安定しているため、測定試料の非標識Ａｒｇ／標識Ａｒｇは、測定試料に含まれる標識コラーゲンに対する測定対象コラーゲンのモル比に相当する。測定試料に添加した標識コラーゲン量をＭＳＩモルとすれば、ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ／標識Ａｒｇは、測定試料に含まれる測定対象コラーゲンのモル数ＭＳａｍに該当する。Ｚ４Ｈｙｐ／ＭＳａｍ＝Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））を算出することで、測定対象コラーゲン１モルあたりの４Ｈｙｐ量を求めることができる。 上記４Ｈｙｐの定量と同様にして、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＧＨＬ、ＧＧＨＬなどのアミノ酸も、測定試料に添加した標識コラーゲン構成アミノ酸の質量をＹＡとし、測定試料に添加した標識コラーゲン量をＭＳＩモルとした場合に、ＹA×（非標識アミノ酸／標識アミノ酸）×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））を算出し、測定対象コラーゲン１モルあたりのアミノ酸を定量することができる。なお、測定対象コラーゲンと標識コラーゲンとの配合比を示すものとして、上記したＡｒｇの他にＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓなどの、コラーゲンでの組成比が安定したアミノ酸を使用することができる。Ａｒｇに代えてＬｅｕを指標とする場合は、安定同位体標識Ａｒｇに代えて安定同位体標識Ｌｅｕで９０モル％以上置換された標識コラーゲンを使用する。本発明では、標識コラーゲンを分解してなる安定同位体標識されたアミノ酸をそれぞれ内部標準物質として扱うことができるため、複数のアミノ酸を同時に定量することができる。 なお、コラーゲン１０００残基当りのアミノ酸残基数を算出するには、予め測定した標識コラーゲンを構成するアミノ酸１０００残基当たりのアミノ酸残基数を使用すればよい。例えば、（非標識アミノ酸／標識アミノ酸）／（非標識Ａｒｇ／標識Ａｒｇ）は、コラーゲンあたりの標識コラーゲン構成アミノ酸に対する測定対象アミノ酸の質量比である。これに、標識コラーゲンを構成する前記アミノ酸の１０００残基あたりの残基数としてＭAを乗じ、ＭA×（非標識アミノ酸／標識アミノ酸）×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）を算出すれば、測定対象コラーゲンの前記アミノ酸の１０００残基あたりの残基数を算出することができる。 （２）コラーゲン量の定量方法 使用する標識コラーゲンは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上の標識アミノ酸で９０モル％以上が置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾したものである。好ましくは、Ｐｒｏが安定同位体標識Ｐｒｏで９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾したものである。Ｐｒｏが翻訳後修飾された４Ｈｙｐは、コラーゲンにのみ存在する翻訳後修飾アミノ酸である。４Ｈｙｐ量を指標にＬＣ／ＭＳ分析を行うと、測定対象コラーゲンがコラーゲン以外のタンパク質を含む場合であっても測定対象コラーゲン量を正確に定量することができる。便宜のため、安定同位体標識Ｐｒｏで置換された標識コラーゲンを使用する場合で説明する。 測定対象コラーゲンに既知量の標識コラーゲンを添加して測定試料とする。測定対象コラーゲンおよび標識コラーゲンは、予め別個にアミノ酸に分解したものを合一して測定試料としたものであってもよく、両者を混合した後に同時に分解処理したものを測定試料としてもよい。測定対象コラーゲンと標識コラーゲンとを同時に分解処理する場合には、分解工程による測定誤差を相殺することができる。 得られた分解物をＬＣ／ＭＳ分析により、例えば、標識コラーゲン由来の安定同位体標識４Ｈｙｐに対する測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐの質量比、例えば、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを測定する。測定試料に添加した標識コラーゲンの質量として例えばＹCを乗じると、ＹC×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）は、測定試料中の測定対象コラーゲンの質量となる。 なお、上記定量方法は４Ｈｙｐを指標とするものであるが、４Ｈｙｐがコラーゲンに特異に含まれるアミノ酸であり、コラーゲン組織間での変動が少なく、壊血病以外では疾患による大きな変化も報告がなく、かつコラーゲン中での構成量も安定しているからである。従って、測定対象コラーゲンに他のタンパク質などの不純物が含まれていない場合には、４Ｈｙｐに代えて、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸の上記質量比を定量し、全コラーゲン量を定量することができる。この場合には、測定対象のアミノ酸に対応して、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上の標識アミノ酸で９０モル％以上が置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾した標識コラーゲンを使用する。なお、４Ｈｙｐ以外のアミノ酸組成はコラーゲン型間で異なることが一般的である。従って、４Ｈｙｐ以外のアミノ酸を指標とする場合は、使用する標識コラーゲンの型は、測定対象コラーゲンと同じものを使用する。 上記した全コラーゲン量の定量は、４Ｈｙｐなどのアミノ酸の質量比を測定する際の感度が高いため、少量のサンプルでも測定できる。コラーゲンの特定配列のペプチドを測定してコラーゲン量を定量する場合は、このような特定配列ペプチドの含有量はタンパク質１モル当たり基本的に１モルであるが、４Ｈｙｐその他のアミノ酸はコラーゲン１モル当たりのモル数が多いため、ペプチドを測定対象とする場合と比較して１００倍以上も測定感度を向上させることができる。本発明で使用する標識コラーゲンは、標識アミノ酸による置換率が高く純度が高いため、このような高感度なアミノ酸の測定を行うことができる。 （３）型別コラーゲン量の定量方法 型別コラーゲンの分析に使用する標識コラーゲンとしては、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上の標識アミノ酸で９０モル％以上が置換された標識コラーゲンである。測定対象コラーゲンに含まれるコラーゲンＩ型の濃度を分析する場合には、コラーゲンＩ型の標識コラーゲンを使用する。便宜のため、安定同位体標識Ｐｒｏ、安定同位体標識Ｌｙｓ、および安定同位体標識Ａｒｇで置換された標識コラーゲンＩ型前駆体を翻訳後修飾した標識コラーゲンＩ型を使用し、測定試料に含まれる測定対象コラーゲンＩ型を定量する場合で説明する。 まず、測定対象コラーゲンに既知量の標識コラーゲンＩ型を添加して測定試料とする。測定対象コラーゲンおよび標識コラーゲンは、予め同じエンドペプチダーゼを使用して別個に酵素分解したものを合一して測定試料としたものであってもよく、エンドペプチダーゼを使用して同時に酵素分解したものを測定試料としてもよい。 次いで、ＬＣ／ＭＳ分析により、コラーゲンＩ型に特有のアミノ酸配列を含みかつ標識アミノ酸を含むペプチドを指標として、測定試料に含まれる標識コラーゲン由来のペプチド（以下、標識Ｉ型ペプチドと称する。）と前記標識Ｉ型ペプチドに対応する測定対象コラーゲン由来のペプチド（以下、非標識Ｉ型ペプチドと称する。）との質量比を測定する。安定同位体標識Ｐｒｏ、安定同位体標識Ｌｙｓ、および安定同位体標識Ａｒｇで置換された標識コラーゲンＩ型をトリプシンで酵素分解すると、Ｐｒｏ、４Ｈｙｐ、３Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、Ａｒｇなどが標識アミノ酸で構成されたペプチドが得られる。従って、コラーゲンＩ型に特有のアミノ酸配列を有するペプチドとして、例えば、ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲ、ＧＶＶＧＬＯＧＱＲ、ＥＧＰＶＧＬＯＧＩＤＧＲおよびＧＰＳＧＰＱＧＩＲなどを指標としてＬＣ／ＭＳ分析を行うことで、測定時のイオン化効率の誤差を吸収した高精度な定量分析を行うことができる。 ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲを指標として質量比を測定する場合、標識コラーゲン由来の前記ペプチド（以下、標識ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲと称する。）と測定対象コラーゲン由来のペプチド（以下、非標識ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲと称する。）との質量比として、例えば、非標識ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲ／標識ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲを算出し、測定試料に添加した標識コラーゲンＩ型の質量として、ＹＣＩを乗ずれば、測定試料に含まれる測定対象コラーゲンＩ型の質量をＹＣＩ×非標識ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲ／標識ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲから算出することができる。 なお、上記は既知量の標識コラーゲンＩ型を使用する場合で例示したが、更に標識コラーゲンとしてＩＩ型やＩＩＩ型、その他が混在してもよい。Ｉ型の添加量が既知であれば、他のコラーゲンが含まれても測定誤差は生じないからである。 一方、測定対象コラーゲンにＩ型とＩＩＩ型のコラーゲンが含まれる場合には、既知量の標識コラーゲンＩ型と既知量の標識コラーゲンＩＩＩ型とが混在する標識コラーゲンを使用すれば、一度の測定でＩ型とＩＩＩ型とを定量することができる。 測定試料の酵素分解液をＬＣ／ＭＳ分析し、コラーゲンＩ型に特有のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、Ｉ型指標ペプチドと称する。）とコラーゲンＩＩＩ型に特有のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、ＩＩＩ型指標ペプチドと称する。）とをＬＣ／ＭＳ分析で検出する。Ｉ型指標ペプチドとＩＩＩ型指標ペプチドとが検出された場合は、測定対象コラーゲンには、コラーゲンＩ型とＩＩＩ型とが含まれる。その各々について上記と同様に測定対象コラーゲンＩ型由来のペプチド（以下、非標識Ｉ型ペプチドと称する。）と、標識コラーゲンＩ型由来のペプチド（以下、標識Ｉ型ペプチドと称する。）との質量比、例えば、非標識Ｉ型ペプチド／標識Ｉ型ペプチドを測定し、測定試料に添加した標識コラーゲンＩ型の質量として、ＹＣIを乗じ、ＹＣI×非標識Ｉ型ペプチド／標識Ｉ型ペプチドを算出すれば測定試料に含まれるコラーゲンＩ型の質量を求めることができる。コラーゲンＩＩＩ型も同様であり、測定試料に添加した標識コラーゲンＩＩＩ型の質量として、ＹＣIIIを乗じ、ＹＣIII×非標識ＩＩＩ型ペプチド／標識ＩＩＩ型ペプチドを算出すれば測定対象コラーゲンに含まれるコラーゲンＩＩＩ型の質量を求めることができる。 コラーゲン型の定量方法では、標識コラーゲンとして予め既知量の複数種のコラーゲン型を含むものを使用してもよい。例えば、予め所定量のコラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型を含む標識コラーゲンを調製し、測定対象コラーゲンに含まれるそれぞれのコラーゲン型に特有のペプチドを検出することでコラーゲン型の定性分析および定量分析を行うことができる。 （４）ペプチド量の定量 コラーゲンを構成するペプチド量の測定方法は、前記した型別コラーゲン量の定量方法に準じて行うことができる。測定対象コラーゲンのＧｌｙＰｒｏＡｌａ量を標識ヒトコラーゲンＩ型を使いコラゲナーゼで分解して定量する場合で説明する。 測定対象コラーゲンに既知量の標識コラーゲンＩ型を添加して測定試料とする。測定対象コラーゲンおよび標識コラーゲンＩ型は、予め同じコラゲナーゼを使用して別個に酵素分解したものを合一して測定試料としたものであってもよく、コラゲナーゼを使用して同時に酵素分解したものを測定試料としてもよい。 次いで、ＬＣ／ＭＳ分析により、測定試料に含まれる標識ＧｌｙＰｒｏＡｌａ（以下、標識ＧＰＡと称する。）と前記標識ＧＰＡに対応する測定対象コラーゲン由来のＧｌｙＰｒｏＡｌａ（以下、非標識ＧＰＡと称する。）との質量比（非標識ＧＰＡ／標識ＧＰＡ）を測定する。 コラゲナーゼはコラーゲンをＧｌｙ-Ｘ-Ｙ単位で分解し、分解反応が完全に行われる場合には前記標識コラーゲンＩ型１モルからＧｌｙＰｒｏＡｌａが８８モル（α１鎖から３０×２＝６０モル、α２鎖から２８モル）生成される。ＧｌｙＰｒｏＡｌａの分子量は２４３、コラーゲンの分子量は約３×１０５であるから、測定試料に添加した標識コラーゲンの質量をＹＣＩとすれば、測定試料に含まれる標識ＧＰＡの質量ＹＧＰＡはＹＣＩ×８８×２４３／（３×１０５）で算出され、測定対象コラーゲンを構成するＧＰＡの質量は、ＹＧＰＡ×（非標識ＧＰＡ／標識ＧＰＡ）として求めることができる。 本発明では、標識コラーゲンをコラゲナーゼで分解して生成されるＧｌｙ-Ｘ-Ｙで示される数々のペプチドをそれぞれ内部標準物質として扱うことができるため、複数のペプチドを上記により同時に定量することができる。 （５）コラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチド成分の定量 本発明の分析方法によれば、例えば、血漿に既知量の標識コラーゲンを添加したものを測定試料とすることで、血漿中のコラーゲン由来アミノ酸やペプチド成分を定量することができる。 測定試料に含まれるコラーゲン由来ペプチド成分とこれに対応する前記標識コラーゲン由来ペプチドとの質量比や、コラーゲン由来アミノ酸とこれに対応する前記標識コラーゲン由来アミノ酸との質量比を測定し、予め測定成分の標品と標識コラーゲンを用いて作成した前記ペプチドの質量比やアミノ酸の質量比の検量線を使用して、測定試料に含まれるコラーゲン由来アミノ酸やペプチド成分を定量することができる。コラーゲン由来アミノ酸やペプチド成分を含む定量対象物として、コラーゲン代謝物を含む生体成分、例えば全血、血漿、血清、尿、組織抽出液などがある。これらの定量対象物に含まれるコラーゲン代謝物の測定に好適である。 （ｉ）コラーゲン由来アミノ酸の定量 血漿を定量対象物とし、コラーゲン代謝物として４Ｈｙｐを測定する場合で説明する。 使用する標識コラーゲンは、少なくともコラーゲンを構成するＰｒｏが標識アミノ酸で９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾してなる標識コラーゲンである。予め酸、アルカリまたは酵素でアミノ酸を含有するように分解した既知量の標識コラーゲン分解物を血漿に添加して測定試料とする。この測定試料をエタノールで沈殿して得た上清には遊離型４Ｈｙｐが含まれる。上清をＬＣ／ＭＳで分析し、上清に含まれる標識コラーゲン由来の４Ｈｙｐ（標識４Ｈｙｐ）に対する血漿由来の４Ｈｙｐ（非標識４Ｈｙｐ）の質量比（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）を測定する。別個に、市販の４Ｈｙｐと前記標識コラーゲン分解物とを所定質量比で混合して標準溶液列を調製し、ＬＣ／ＭＳによって非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ質量比を測定し、この値と４Ｈｙｐ濃度との関係を示す検量線を作成し、この検量線に基づいて上記測定した質量比から血漿中の遊離型４Ｈｙｐ量を定量する。 前記上清には遊離型４Ｈｙｐと共にペプチド型４Ｈｙｐが含まれている。従って、この上清を酸などで分解して血漿に含まれるペプチドを各アミノ酸に分解し、この分解物を使用し、上記と同様にして定量すれば、血漿に含まれる全４Ｈｙｐを定量することができる。全４Ｈｙｐ量と遊離型４Ｈｙｐ量との差は、血漿に含まれるペプチド型４Ｈｙｐ量となる。 本発明では、標識コラーゲンを分解してなる標識アミノ酸をそれぞれ内部標準物質として扱うことができるため、対応する標識アミノ酸を含有する標識コラーゲンを使用することで、測定試料に含まれる上記した４Ｈｙｐ以外の複数のアミノ酸を同時に定量することができる。 （ｉｉ）コラーゲン由来ペプチド成分の定量 血漿を定量対象物とし、コラーゲン代謝物としてＰｒｏＨｙｐを測定する場合で説明する。 使用する標識コラーゲンは、少なくともコラーゲンを構成するＰｒｏが標識アミノ酸で９０モル％以上置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾してなる標識コラーゲンである。予め酸、アルカリまたは酵素でペプチドを含有するように分解した既知量の標識コラーゲン分解物を血漿に添加して測定試料とする。この測定試料をエタノールで沈殿して得た上清をＬＣ／ＭＳで分析し、測定試料に含まれる標識コラーゲン由来のＰｒｏＨｙｐ（標識ＰｒｏＨｙｐ）に対する血漿由来のＰｒｏＨｙｐ（非標識ＰｒｏＨｙｐ）の質量比（非標識ＰｒｏＨｙｐ／標識ＰｒｏＨｙｐ）を測定する。別個に合成オリゴペプチドＰｒｏＨｙｐと前記標識コラーゲン分解物とを所定質量比で混合して標準溶液列を調製し、ＬＣ／ＭＳにて非標識ＰｒｏＨｙｐ／標識ＰｒｏＨｙｐ質量比を測定し、この値とＰｒｏＨｙｐ濃度との関係を示す検量線を作成し、この検量線に基づいて上記測定した質量比から血漿中のペプチド量を定量する。 本発明では、標識コラーゲンを分解してなる標識ペプチドをそれぞれ測定の際の内部標準物質として扱うことができるため、前記標識コラーゲンを使用することで、上記したＰｒｏＨｙｐ以外の複数のペプチドを同時に定量することができる。更に、標識コラーゲン分解物が、アミノ酸とペプチドとを同時に含有する場合する場合がある。このような標識コラーゲン分解物を使用し、内部標準物質として使用することで、アミノ酸とペプチドとを同時に測定することができる。 （６）相対比評価 本発明において、定量方法には「絶対定量」と「相対定量」とが含まれる。従って、複数の測定試料のコラーゲンを分析する際、いずれかの測定試料の値を基準として、本発明の分析方法で得た前記アミノ酸量やペプチド量、コラーゲン量、型別コラーゲン量を相対比で評価することができる。例えば、複数の測定試料間で各測定試料に含まれる標識コラーゲン量と測定対象コラーゲン量とが一定であれば、分析により得た測定試料ペプチド質量比や測定試料アミノ酸質量比のみを用いて測定試料間の相違を簡便に検出しうる利点がある。また、複数の測定試料間で測定試料に添加した標識コラーゲン量と測定対象コラーゲン量とが異なる場合でも、正確に各測定試料間の相違を相対比で評価することができる。 （ｉ）測定試料に含まれる標識コラーゲンと測定対象コラーゲンとがそれぞれ一定である複数の測定試料は以下の方法で評価することができる。このような試料としてプロリン水酸化酵素による変性コラーゲンの水酸化試料がある。コラーゲン試料の水酸化状態を所定時間毎にｎ回観察し、Ｐｒｏの水酸化状態を反応０時を基準として相対比を求める場合で説明する。 使用する標識コラーゲンとしては、測定対象となるＰｒｏが標識アミノ酸で９０モル％以上が置換され、更に、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上の標識アミノ酸で９０モル％以上が置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾したものがある。便宜のため、安定同位体標識Ｐｒｏおよび安定同位体標識Ａｒｇで置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾した標識コラーゲンを使用し、加水分解によって生ずる４Ｈｙｐの各測定試料間の相違を評価する場合で説明する。 測定対象コラーゲンから所定時間ごとにｎ回、その一部を等量ずつ取り出し、その測定対象コラーゲンに標識コラーゲンを等量ずつ添加して測定試料とする。これを例えば、酸またはアルカリで加水分解する。ＬＣ／ＭＳ分析により、安定同位体標識４Ｈｙｐと非標識４Ｈｙｐとの質量比、例えば、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを測定する。前記（１）に記載したように、測定試料に添加した標識コラーゲン由来の４Ｈｙｐ量が既知であり、例えばＹ４Ｈｙｐである場合には、Ｙ４Ｈｙｐ×非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを算出し、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐ量を算出することができる。また、測定試料に添加した標識コラーゲン量をＭＳＩモルとすれば、Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））を算出することで、測定対象コラーゲン１モルあたりの４Ｈｙｐ量を算出することもできる。 一方、反応０時の質量比を初期値として｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））０｝０で表し、各測定時の質量比を｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）１×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））１｝１,・・・,｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））ｎ｝ｎとすれば、｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））ｎ｝ｎ／｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））０｝０を算出することで、各経過時の４Ｈｙｐ量を初期値に対する相対比で評価することができる。上記式において「Ｙ４Ｈｙｐ」および「標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ）」は測定試料間で同一である。従って、各測定時の質量比として「非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ」を用い、（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ／（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０を算出することで、初期値に対する経過時ｎの相対比を求めることができる。この方法は、濃度未知の標識コラーゲンを使用して、測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐ量を算出することなく分析しうる点で優れる。 上記は４Ｈｙｐの経時変化を分析する場合で説明したが、測定試料に添加する酸やアルカリでの加水分解に代えて酵素分解によって発生するペプチド量を経時的にＬＣ／ＭＳ分析し、酵素反応の経時変化を分析することもできる。 （ｉｉ）測定試料に含まれる標識コラーゲン量は一定であるが、測定対象コラーゲン量が異なる複数の測定試料は以下の方法で評価することができる。異なる疾患に罹患した組織から抽出したコラーゲンの４Ｈｙｐ量を、健康時を基準として相対比を求める場合で説明する。 使用する標識コラーゲンは、測定対象となるＰｒｏやＬｙｓが標識アミノ酸で９０モル％以上が置換され、更に、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上の標識アミノ酸で９０モル％以上が置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾したものである。便宜のため、安定同位体標識Ｐｒｏおよび安定同位体標識Ａｒｇで置換された標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾した標識コラーゲンを使用し、各測定試料に含まれる４Ｈｙｐを評価する場合で説明する。 健康時および異なる疾患に罹患した組織から抽出した測定対象コラーゲンそれぞれに同量の標識コラーゲンを添加して測定試料とする。測定対象コラーゲンおよび標識コラーゲンは、予め別個に加水分解したものを合一して測定試料としたものであってもよく、両者を混合して同時に加水分解したものを測定試料としてもよい。 次いで、ＬＣ／ＭＳ分析により、加水分解物に含まれる安定同位体標識４Ｈｙｐと非標識４Ｈｙｐとの質量比、例えば、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを測定する。前記（１）に記載したように、測定試料に添加した標識コラーゲンに含まれる４Ｈｙｐ量をＹ４Ｈｙｐとすれば、Ｙ４Ｈｙｐ×非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを算出し、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン由来の４Ｈｙｐ量を算出することができる。また、「非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ」と「標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ」との２つの質量比からなる算術値に、測定試料に添加した標識コラーゲン量をＭＳＩモルとして加え、Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））を算出することで、測定対象コラーゲン１モルあたりの４Ｈｙｐ量を求めることができる。 一方、健常時の質量比を初期値として｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））０｝０で表し、各疾患の質量比を｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）１×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ１×非標識Ａｒｇ））１｝１,・・・,｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））ｎ｝ｎとする。健常時に対する各疾患時の質量比は、｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））ｎ｝ｎ／｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））０｝０となる。測定試料に添加した標識コラーゲンに含まれる４Ｈｙｐ量および標識コラーゲン量ＭＳＩは一定であるから、｛（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）ｎ｝ｎ／｛（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）０｝０を算出することで、健常時に対する各測定試料の相対比を評価することができる。 上記式より、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン量が異なる場合であっても、質量比測定工程で得た質量比のみを使用し、簡便に各測定試料間の相対比を求めることができる。なお、上記は、各測定試料の質量比である「非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ」と「標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ」とを組み合わせて評価した一例となる。 なお、ＬＣ／ＭＳ分析において、４Ｈｙｐ標品で作成した検量線を用いて測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積から４Ｈｙｐ量を求めることも可能であるが、後記する実施例に示すように、測定試料に塩などの夾雑成分が含まれる場合には試料間の測定誤差に由来する定量誤差が発生しやすい。このような場合であっても、標識コラーゲンを分解してなる標識４Ｈｙｐを測定試料、検量線用試料に添加して内部標準物質として使用し、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐを測定することで測定誤差を相殺し、正確な定量を行うことができる。 （ｉｉｉ）測定試料に含まれる標識コラーゲン量と測定対象コラーゲン量とが異なる複数の測定試料は以下の方法で相対比を評価することができる。上記（ｉｉ）の測定試料において標識コラーゲン量が異なる場合で説明する。 測定試料に添加した標識コラーゲン量をＭＳＩモルとすれば、健常時に対する疾患時の質量比は｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））ｎ｝ｎ／｛Ｙ４Ｈｙｐ×（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／（ＭＳＩ×非標識Ａｒｇ））０｝０である。測定試料に含まれる標識コラーゲン量が異なるため、各測定試料に添加した４Ｈｙｐ量と測定試料に添加した標識コラーゲン量ＭＳＩモルとは、測定試料毎に異なる。しかしながら、測定試料に添加した標識コラーゲン量と前記標識コラーゲンを構成する４Ｈｙｐ量との比は一定であるから、Ｙ４Ｈｙｐ／ＭＳＩはいずれの測定試料でも同一である。従って、相対比で評価する場合は、上記(ｉｉ)と同様に、｛（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）ｎ｝ｎ／｛（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）０｝０を算出し、健常時に対する各測定試料の相異を検出することができる。 以上、本発明のコラーゲン分析方法における相対比の評価を、測定試料に含まれる標識コラーゲン量および測定対象コラーゲン量の一定、不定に区分して説明したが、これに限定されるものではない。例えば、複数の測定試料間で標識コラーゲン量と測定対象コラーゲン量とが等しい上記（ｉ）の態様において、上記（ｉｉｉ）と同様に、｛（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）ｎ×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）ｎ｝ｎ／｛（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）０×（標識Ａｒｇ／非標識Ａｒｇ）０｝０を算出してもよい。 （７）細胞内取り込み量の分析 本発明の分析方法を応用して、細胞による標識コラーゲンの取り込み量を定量することができる。従来から、コラーゲンの細胞内取り込み量の測定には放射性同位体ヨウ素標識コラーゲンや蛍光標識コラーゲンが用いられてきた。しかしながら、これらの方法ではコラーゲン全体が均一に標識されず、また標識物の分子量が大きいため物性変化の可能性があり、正確な定量が妨げられる懸念があった。本発明で使用する標識コラーゲンは、標識アミノ酸がコラーゲン配列全体に均一に取り込まれ、かつ標識コラーゲンの物性変化もないことから、正確なコラーゲン細胞内取り込み量の測定を行うことができる。 具体的には、標識コラーゲンを培養系に添加し、取り込まれた標識コラーゲンを細胞ごと酸加水分解した後、標識コラーゲン由来の標識アミノ酸、例えば４Ｈｙｐを定量する。上記方法によれば、標識コラーゲン由来の標識アミノ酸を定量するため、細胞内で合成された内在性コラーゲンその他、非標識アミノ酸量の影響を排除することができる。 標識コラーゲンは、標識アミノ酸がコラーゲンに均一に取り込まれているため、標識コラーゲンの取り込みと同様にして酵素などで分解されたコラーゲンペプタイドの細胞内取り込み量も測定することができる。 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。 （実施例１） ＨＥＬ細胞１．５×１０６ｃｅｌｌｓを、１３Ｃ６−Ｌｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１００ｍｇ／Ｌ、１３Ｃ６１５Ｎ４−Ａｒｇ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１００ｍｇ／Ｌ、１３Ｃ５１５Ｎ１−Ｐｒｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２００ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸（Ｗａｋｏ社製、商品名「Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物」）２００μＭ、透析ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品名「Ｄｉａｌｙｚｅｄ ＦＢＳ」）０．５％を含有する安定同位体標識用ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品名「ＳＩＬＡＣ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉａ」）で培養した（１００ｍｍ ｄｉｓｈ）。３日ごとに培地を回収し、上記組成の培地で交換した。 培養開始後３日目および６日目に得られた培養上清に０．１ＮとなるようにＨＣｌを加えて酸性とし、０．１ｍｇ／ｍＬとなるようアガロース固定化ペプシン（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｐｅｐｓｉｎ−Ａｇａｒｏｓｅ」）を加え４℃で１６時間消化反応を行った。反応後に遠心分離してアガロース固定化ペプシンを分離し、上清を得た。この上清に１ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、氷上で３時間静置した後、遠心分離を行い、沈殿を分取した。 分取した沈殿を１Ｍ ＮａＣｌと９５％エタノールとで洗浄し、最後に５ｍＭ酢酸２５０μｌで溶解したものを標識コラーゲンとした。 培養１〜３日および４〜６日で産生された標識コラーゲンにおける安定同位体標識Ｐｒｏおよび４Ｈｙｐの置換率を後記する置換率の測定方法によって測定した。標識コラーゲンは、３個の培地を使用して生産した。安定同位体標識Ｐｒｏ置換率の結果を図１に安定同位体標識４Ｈｙｐ置換率の結果を図２に示す。なお、図１および図２において、横軸の数値は安定同位体標識Ｐｒｏ添加量（ｍｇ／Ｌ）を示す。また、培養４〜６日で産生された標識コラーゲンの安定同位体標識Ｐｒｏ、４Ｈｙｐ、３Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＧＨＬ、ＧＧＨＬおよびＡｒｇの置換率を同様に測定した。結果を表１に示す。表１に示すように、実施例１の標識コラーゲンは、コラーゲンを構成するＰｒｏ、４Ｈｙｐ、３Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＧＨＬ、ＧＧＨＬおよびＡｒｇの全てが、それぞれ標識アミノ酸で９０％以上置換されていた。 （実施例２） 実施例１の培地に、更に３００ｍｇ／ＬとなるようにＧｌｎを添加した以外は実施例１と同様にして標識コラーゲンを得たのち、安定同位体標識Ｐｒｏおよび４Ｈｙｐの置換率を測定した。結果を図１、図２に示す。 （実施例３） 培地に添加する１３Ｃ５１５Ｎ１−Ｐｒｏ量を２００ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌに変更した以外は実施例１と同様にして標識コラーゲンを得たのち、安定同位体標識Ｐｒｏおよび４Ｈｙｐの置換率を測定した。結果を図１、図２に示す。 （実施例４） 実施例３の培地に、更に３００ｍｇ／ＬとなるようにＧｌｎを添加した以外は実施例１と同様にして標識コラーゲンを得たのち、安定同位体標識Ｐｒｏおよび４Ｈｙｐの置換率を測定した。結果を図１、図２に示す。 （実施例５） 培地に添加する１３Ｃ５１５Ｎ１−Ｐｒｏ量を２００ｍｇ／Ｌから３５０ｍｇ／Ｌに変更した以外は実施例１と同様にして標識コラーゲンを得たのち、安定同位体標識Ｐｒｏおよび４Ｈｙｐの置換率を測定した。結果を図１、図２に示す。 （実施例６） 実施例５の培地に、更に３００ｍｇ／ＬとなるようにＧｌｎを添加した以外は実施例１と同様にして標識コラーゲンを得たのち、安定同位体標識Ｐｒｏおよび４Ｈｙｐの置換率を測定した。結果を図１、図２に示す。 （結果） 図１および図２に示すように、１３Ｃ５１５Ｎ１−Ｐｒｏを２００ｍｇ／Ｌ添加し、Ｇｌｎは非添加であるときＰｒｏ、４Ｈｙｐの標識アミノ酸による置換率に優れた。 （実施例７） 実施例１で得た標識コラーゲンについて、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。結果を図３に示す。コラーゲンＩ型とコラーゲンＩＩＩ型とが混在することが判明した。なお、参考のため、ヒトコラーゲンα１（Ｉ）およびヒトコラーゲンα２（Ｉ）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１２、配列番号１３に示す。これは米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）において配列番号ＮＰ＿００００７９．２、ＮＰ＿００００８０．２として登録されている。 （実施例８） 実施例１と同様の方法で培養４〜６日以上の培地から標識コラーゲンを調製し、その全コラーゲン量を定量した。標識コラーゲン８０μｌを遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ(ガス）、１１０℃、２０時間の条件で酸加水分解を行った。これを２０ｍＭ ＨＣｌに溶解して、半量を高速アミノ酸分析計Ｌ−８９００（日立）で、陽イオン交換カラム、ニンヒドリン−ポストカラム法を用いて分析を行い、各アミノ酸のピーク面積を測定した。前記ピーク面積と既知量の標品のピーク面積との比から各アミノ酸の含有量を定量し、その総和を標識コラーゲン量とした。標識コラーゲンに含まれるアミノ酸のモル濃度、含有量および前記モル濃度から換算した各アミノ酸の１０００残基当りの残基数を表２に示す。アミノ酸総量分析による上記標識コラーゲンのコラーゲン濃度は、２０９．３μｇ／ｍｌであった。 （実施例９） 実施例８で得た標識コラーゲンの型別定量を行った。 標識コラーゲン４０μｌに、ヒト胎盤由来Ｉ型コラーゲンを５μｇおよびＩＩＩ型コラーゲンを５μｇ添加し、これに１００ｍＭとなるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加し、６０℃、３０分間変性処理を行った。その後、タンパク質量の１／１００量のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、商品名「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｆｒｏｚｅｎ」）を加え、３７℃、１６時間、酵素分解を行った。得られた分解液にギ酸を１％となるように添加して分析液とした。 上記分析液について後記する置換率測定の項のペプチド分析のＬＣ／ＭＳ条件によりピーク面積を測定した。ペプチドは、コラーゲンＩ型α１鎖およびコラーゲンＩ型α２鎖に含まれる配列ＧＶＱＧＰＯＧＰＡＧＰＲ、ＧＶＶＧＬＯＧＱＲ、ＥＧＰＶＧＬＯＧＩＤＧＲおよびＧＰＳＧＰＱＧＩＲのペプチドを対象とした。ＬＣ／ＭＳ分析におけるこれらペプチドのＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）チャンネルを表３に示す。各ペプチドについて、ヒト胎盤由来Ｉ型コラーゲン構成ペプチドに対する標識コラーゲン構成ペプチドのピーク面積比を求めた。上記４ペプチド、各２チャンネル、合計８チャンネルのピーク面積比の平均を算出し、それにヒト胎盤由来Ｉ型コラーゲン量として５μｇを乗じ、１．３９４×（５（μｇ）／４０（μｌ））×１０００＝１７４．３（μｇ／ｍｌ）から、標識コラーゲンに含まれる標識コラーゲンＩ型の濃度を算出した。結果を表４に示す。 上記と同様にして、コラーゲンＩＩＩ型α１鎖に含まれるペプチド配列ＧＬＡＧＰＯＧＭＯＧＰＲおよびＧＲＯＧＬＯＧＡＡＧＡＲを指標としてヒト胎盤由来ＩＩＩ型コラーゲン構成ペプチドに対する標識コラーゲン由来標識ペプチドのピーク面積比を求めた。上記２ペプチド、各２チャンネル、合計４チャンネルで測定したピーク面積比の平均を算出し、それにヒト胎盤由来ＩＩＩ型コラーゲン量として５μｇを乗じ、０．１５３×（５（μｇ）／４０（μｌ））×１０００＝１９．１（μｇ／ｍｌ）から、標識コラーゲンに含まれる標識コラーゲンＩＩＩ型の濃度を算出した。結果を表４に示す。実施例８で得た標識コラーゲンは、標識コラーゲンＩ型を１７４．３μｇ／ｍｌ、標識コラーゲンＩＩＩ型を１９．１μｇ／ｍｌ含むものであった。 （実施例１０） 実施例８で調製した標識コラーゲンを用いてラット皮膚から抽出したコラーゲン（以下、ラット皮膚コラーゲンとも称する。）の全コラーゲン量定量（実施例１０）、型別コラーゲン定量（実施例１１）を行い、その定量精度を確認した。まず、測定対象物であるラット皮膚コラーゲンの濃度を全アミノ酸量から算出しておき、その理論量２０μｇに実施例８で調製した標識コラーゲン２０μｌを添加して測定試料とした。９／１０量を後述する型別コラーゲン定量用の試料とし、残りの測定試料を遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ（ガス）、１１０℃の条件で、２０時間、酸加水分解を行った。この酸加水分解物を、５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解し、後記する置換率の測定方法の項におけるアミノ酸分析のＬＣ／ＭＳ条件で分析を行った。 ラットは２個体を使用し、コラーゲンに特有の４Ｈｙｐを指標として、標識コラーゲン由来４Ｈｙｐに対するラット皮膚コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積比を測定した。平均ピーク面積比は５．１４であった。測定試料に使用した標識コラーゲンのコラーゲン含有量は実施例８より２０９．３（μｇ／ｍｌ）である。従って、測定試料に含まれる標識コラーゲンは２０９．３（μｇ／ｍｌ）×２０（μｌ）となる。前記測定試料に含まれるラット皮膚コラーゲン量は、これに先の質量比を乗じ、５．１４×０．２０９３（μｇ／μｌ）×２０（μｌ）＝２１．５（μｇ）と算出された。全アミノ酸量から算出したコラーゲン量２０μｇと非常に近似する値となり、その定量精度が確認された。ラット皮膚コラーゲンの全コラーゲン濃度定量の結果を表５に示す。 （実施例１１） 実施例８で調製した標識コラーゲンを用いて、実施例１０で分析したラット皮膚コラーゲンの型別コラーゲン濃度を測定した。実施例１０で使用したラット皮膚コラーゲン２０μｇに実施例８で調製した標識コラーゲン２０μｌを添加した測定試料の９／１０量に１００ｍＭとなるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭとなるようにＣａＣｌ２を添加し、６０℃、３０分間変性処理を行った。その後、タンパク質量の１／１００量のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、商品名「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｆｒｏｚｅｎ」）を加え、３７℃、１６時間、酵素分解を行った。得られた分解液にギ酸を１％となるように添加して分析液とした。 この分析液について後記する置換率測定の項のペプチド分析のＬＣ／ＭＳ条件により分析を行った。表３に示すコラーゲンＩ型α１鎖およびコラーゲンＩ型α２鎖に含まれる４ペプチド、各２チャンネル、合計８チャンネルについて、標識コラーゲンＩ型由来ペプチドのピーク面積に対するラット皮膚コラーゲンＩ型由来ペプチドのピーク面積比を測定した。ラットは２個体を使用し、測定値の平均ピーク面積比は４．９６であった。また、上記と同様にして、表３に示すコラーゲンＩＩＩ型α１鎖に含まれる２ペプチドについて、各２チャンネル、合計４チャンネルで、標識コラーゲンＩＩＩ型由来ペプチドのピーク面積に対するラット皮膚コラーゲンＩＩＩ型由来ペプチドのピーク面積比を測定した。ラットは２個体を使用し、平均ピーク面積比は１２．９８であった。 実施例９に示すように標識コラーゲンは、コラーゲンＩ型を１７４．３μｇ／ｍｌ、コラーゲンＩＩＩ型を１９．１μｇ／ｍｌ含むものである。標識コラーゲン由来Ｉ型ペプチドに対する測定対象コラーゲン由来Ｉ型ペプチドのピーク面積比は４．９６であるから、測定試料に含まれる測定対象コラーゲン量は、４．９６×０．１７４３（μｇ／μｌ）×２０（μｌ）＝１７．３（μｇ）と定量された。同様に、ＩＩＩ型は、１２．９８×０．０１９１（μｇ／μｌ）×２０（μｌ）＝５．０μｇと定量され、Ｉ型、ＩＩＩ型コラーゲンを合計すると、２２．３μｇとなった。全アミノ酸量から算出したコラーゲン量２０μｇと非常に近似する値となり、その定量精度が確認された。結果を表５に示す。 （実施例１２） ラット皮膚コラーゲンに代えてラット骨から抽出したコラーゲンおよびラット尻尾腱から抽出したコラーゲンについて実施例１０および実施例１１と同様に操作して、全コラーゲン量、型別コラーゲン量を定量した。結果を表５に示す。各組織由来コラーゲンにおける、全コラーゲン定量、型別コラーゲン定量全てで、その算出コラーゲン量は、全アミノ酸量で規定されたコラーゲン量２０μｇと非常に近似する結果となり、その定量精度が確認された。また、ラット皮膚、骨、尻尾腱由来コラーゲンのＩ型とＩＩＩ型との混合比を図４に示す。 （実施例１３） 実施例１で得た培養４〜６日の３培地由来の標識コラーゲンを等量ずつ合一して標識コラーゲンを調製した。これを用いて、ラット皮膚、骨、尻尾腱から抽出したコラーゲンを測定対象コラーゲンとし、翻訳後修飾アミノ酸濃度を定量し、および１０００アミノ酸残基当りの各アミノ酸残基数を定量した。 ラット皮膚、骨、尻尾腱からコラーゲンを分取した。それぞれの試料１０μｇに標識コラーゲン１０μｌを添加し、そのうち１／１０量を分取して測定試料とした。この測定試料を遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ(ガス）、１１０℃、２０時間の条件で酸加水分解を行った。酸加水分解物による乾固物に、５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解して、後記する置換率の測定方法におけるアミノ酸分析のＬＣ／ＭＳ条件により、ピーク面積を基準として、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、ＨｙｌおよびＡｒｇについて、標識コラーゲン構成アミノ酸に対する測定対象コラーゲン構成アミノ酸との質量比を測定した。 また、上記測定試料の残り９／１０量に２Ｎとなるように水酸化ナトリウム溶液を添加し、１１０℃、２０時間、アルカリ加水分解を行った。得られたアルカリ加水分解物を冷３０％酢酸で中和した後、陽イオン交換カラム（Ｗａｔｅｒｓ社、商品名「ＯＡＳＩＳ ＭＣＸ」）で脱塩し、その溶出液を遠心濃縮により乾固した。上記アルカリ加水分解による乾固物に５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解して、後記する置換率の測定方法におけるアミノ酸分析のＬＣ／ＭＳ条件で、Ｈｙｌ、ＧＨＬおよびＧＧＨＬについて、標識コラーゲン構成アミノ酸に対する測定対象コラーゲン構成アミノ酸との質量比を測定した。 ラット皮膚、骨、尻尾腱由来のコラーゲンは、３個体のラットからそれぞれ抽出したコラーゲンを使用し、前記質量比は３個体の平均値である。皮膚コラーゲンにおける標識コラーゲン由来Ｐｒｏに対する測定対象コラーゲン由来Ｐｒｏの質量比は７．４０２であり、Ａｒｇの同質量比は７．７６６であった。Ａｒｇの質量比は、標識コラーゲン量に対するラット皮膚コラーゲン量に相当する。よって、ラット皮膚コラーゲン１モル当りのＰｒｏ質量比は７．４０２／７．７６６となる。標識コラーゲンを構成する安定同位体標識Ｐｒｏの１０００アミノ酸残基当りの残基数は、表１より１０４．８であるから、ラット皮膚コラーゲンにおける１０００アミノ酸残基当りのＰｒｏ残基数は、（７．４０２／７．７６６）×１０４．８＝９９．９となる。同様にして、ラット皮膚、骨、尻尾腱から抽出したコラーゲンのＰｒｏ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＧＨＬおよびＧＧＨＬの１０００アミノ酸残基あたりの残基数を測定した。これらの結果および文献値を表６に示す。なお、表６において、Ｈｙｌはアルカリ加水分解試料のＨｙｌ測定値である。また、ｔｏｔａｌ Ｈｙｌは、ＨｙｌとＧＨＬおよびＧＧＨＬの糖鎖が外れたもの総和であり、塩酸加水分解試料のＨｙｌ測定値である。酸加水分解ではＧＨＬ、ＧＧＨＬの糖鎖が外れてＨｙｌとなるからである。 （実施例１４） 実施例１３で調製した標識コラーゲンを用いて、ラット皮膚、骨、尻尾腱から抽出したコラーゲンを構成するアミノ酸の相対比を分析した。 まず、ラット皮膚、骨、尻尾腱からコラーゲンを分取した。それぞれの試料１０μｇに実施例１３で調製した標識コラーゲン１０μｌを添加し、そのうち１／１０量を分取して測定試料とした。この測定試料を遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ(ガス）、１１０℃、２０時間の条件で酸加水分解を行った。また、上記測定試料の残り９／１０量に２Ｎとなるように水酸化ナトリウム溶液を添加し、１１０℃、２０時間、アルカリ加水分解を行った。得られたアルカリ加水分解物を冷３０％酢酸で中和した後、陽イオン交換カラム（Ｗａｔｅｒｓ社、商品「ＯＡＳＩＳ ＭＣＸ」）で脱塩し、その溶出液を遠心濃縮により乾固した。 上記酸加水分解物とアルカリ加水分解による乾固物とをそれぞれ、５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解して、後記する置換率の測定方法におけるアミノ酸分析のＬＣ／ＭＳ条件で、各測定試料のＰｒｏ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＧＨＬ、ＧＧＨＬおよびＡｒｇについて、標識コラーゲン由来成分に対する測定対象コラーゲン由来成分の質量比（測定対象コラーゲン構成アミノ酸／標識コラーゲン構成アミノ酸）（以下、ＡＭＩ質量比とも称する。）を測定した。次いで、各測定試料について、標識コラーゲン由来Ａｒｇに対する測定対象コラーゲン由来Ａｒｇの質量比（以下、Ａｒｇ質量比とも称する。）を求め、各アミノ酸についてＡｒｇ質量比に対するＡＭＩ質量比（ＡＭＩ質量比／Ａｒｇ質量比）を算出した。なお、ラット皮膚、骨、尻尾腱由来のコラーゲンは、３個体のラットからそれぞれ抽出したコラーゲンを使用し、上記質量比は３個体の平均値である。 ラット皮膚コラーゲン由来成分の（ＡＭＩ質量比／Ａｒｇ質量比）に対する骨コラーゲン由来成分および尻尾腱コラーゲン由来成分の（ＡＭＩ質量比／Ａｒｇ質量比）を百分率で求めた。結果を表７および図５に示す。なお、表７および図５において、Ｈｙｌはアルカリ加水分解試料のＨｙｌ測定値であり、ｔｏｔａｌ Ｈｙｌは、ＨｙｌとＧＨＬおよびＧＧＨＬの糖鎖が外れたものの総和であり、塩酸加水分解試料のＨｙｌ測定値である。 表７および図５に示すように、尻尾腱由来コラーゲンは３Ｈｙｐ量が皮膚由来の３Ｈｙｐと比較して４４１％と高く、一方ＧＨＬは３３．９％、ＧＧＨＬは２１．６％と低いという特徴が明瞭に検出された。表６に示すように、表７および図５に示される特徴は、３Ｈｙｐ値に関しては非特許文献５の値と、ＧＨＬおよびＧＧＨＬ値は非特許文献６の値と一致した。 （実施例１５） 実施例１３で調製した標識コラーゲンを用いて、ラット皮膚コラーゲンの酸加水分解による４Ｈｙｐ量の経時変化を測定した。 ラット皮膚コラーゲン１μｇに実施例１３で調製した標識コラーゲン１μｌを添加して測定試料とした。この測定試料を遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ（ガス）、１１０℃の条件で、１時間、酸加水分解を行った。この酸加水分解物を、５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解し、置換率の測定条件に記載したアミノ酸分析のＬＣ／ＭＳ条件で、標識コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積と、測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積、および標識コラーゲン由来４Ｈｙｐに対する測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積比をそれぞれ測定した。同様の操作を加水分解後２、４、８、１６、２４時間の測定試料について行った。 加水分解１時間後の標識コラーゲン由来４Ｈｙｐに対する測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積比（非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ）に対する、加水分解後２、４、８、１６、２４時間のピーク面積比の百分率を算出した。結果を図６の棒グラフに示す。 一方、加水分解１時間の測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積（非標識４Ｈｙｐ）に対する加水分解後２、４、８、１６、２４時間の測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積の百分率を算出した。結果を図６の折れ線グラフに示す。同様にして、Ｌｙｓの翻訳後修飾アミノ酸であるＨｙｌについても測定した。 図６の折れ線グラフに示すように、測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐは、加水分解の経過に伴い加水分解２時間以降、経時的に増加することが示された。なお、図６の棒グラフに示すように、標識コラーゲン由来標識４Ｈｙｐに対する測定対象コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積比は９４．８〜１００％の範囲にあり略均一であった。標識コラーゲンと測定対象コラーゲンとは同程度に加水分解されることが示された。各加水分解経過による測定対象コラーゲン由来Ｈｙｌの変化、および標識コラーゲン由来Ｈｙｌに対する測定対象コラーゲン由来Ｈｙｌのピーク面積比も上記した４Ｈｙｐと同様の傾向を示した（図示せず）。 図６に示すように、加水分解のいずれの時期においてもピーク面積比が略同一であるため、加水分解１時間後のピーク面積比に添加した標識コラーゲンの質量を乗ずることでコラーゲンを定量することができ、定量時間を短縮することができる。 （実施例１６） 測定試料に含まれるコラーゲン以外の成分が測定値に与える影響を評価した。 ＰＢＳ溶液（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ」）を希釈して、０×ＰＢＳ、０．１×ＰＢＳ、０．２×ＰＢＳ、０．５×ＰＢＳ、１×ＰＢＳ溶液を作製し、ここに４Ｈｙｐ標品（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「ｔｒａｎｓ−４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ」）を０．５ｎｍｏｌずつ添加し、さらに実施例１３で調製した標識コラーゲン４μｌをあらかじめ酸加水分解したもののうち１／５０量を各測定試料に添加した。これを下記条件によりＬＣ／ＭＳ分析を行い、標識コラーゲン由来標識４Ｈｙｐおよび４Ｈｙｐ標品のピーク面積を測定し、標識コラーゲン由来標識４Ｈｙｐに対する４Ｈｙｐ標品のピーク面積比を算出した。ＰＢＳ無添加時のピーク面積比を１００％とした場合のＰＢＳ添加試料のピーク面積比を図７の棒グラフに示した。 また、ＰＢＳ無添加系の４Ｈｙｐ標品ピーク面積を１００％とした場合のＰＢＳ添加試料の４Ｈｙｐ標品の各測定試料のピーク面積を図７の折れ線グラフに示す。 図７の棒グラフに示すように、標識コラーゲン由来標識４Ｈｙｐに対する４Ｈｙｐ標品のピーク面積比は、各測定試料間でいずれも９９．２〜１０５．９％と略一定していた。一方、いずれの系も、含まれる４Ｈｙｐ標品の濃度が同じであるにも関わらず、図７の折れ線グラフに示すように、夾雑物として含ませたＰＢＳの濃度が高くなるにつれ４Ｈｙｐピーク面積値が急激に低下した。すなわち、測定対象物質のピーク面積は測定試料に含まれる成分によって測定値が影響を受けやすいが、測定対象コラーゲン由来成分と標識コラーゲン由来成分との質量比は、このような影響を相殺しうることが示された。 ＬＣ／ＭＳ分析測定条件高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、 質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、 分析カラム：Discovery HS F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO)、 カラム温度：２５℃ 移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、 グラジエント条件： ０〜７．５分：Ａ液９８％；Ｂ液２％、 ７．５〜２０分：Ａ液９８〜１０％；Ｂ液２〜９０％、 ２０．１〜２５分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％、 ２５．１〜３０分：Ａ液９８％；Ｂ液２％、 流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、 質量分析条件： イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、 分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、 イオンスプレー電圧：３ｋＶ、 イオンソース温度：６００℃（実施例１７） コラーゲンペプチド摂取後の血中遊離型４Ｈｙｐ、ペプチド型４Ｈｙｐおよび全４Ｈｙｐの定量を行った。 （１）魚鱗由来コラーゲンペプチド粉末２５ｇを溶解した水１００ｍｌを健常者１名に空腹時に経口摂取させ、摂取前（０分）、摂取後３０分、６０分、１２０分、２４０分、３６０分に採血した。採取した血液はヘパリン処理して血漿を調製し、分析時まで−８０℃で保管した。 （２）実施例１３で調製した標識コラーゲン５０μｌを６Ｎ ＨＣｌ（ガス）、１１０℃、２０時間の条件で加水分解し、これを蒸留水１０００μｌに溶解して標識コラーゲン酸加水分解溶液を調製した。この溶液１０μｌを血漿２０μｌに添加し、更に９０μｌのエタノールを添加した。次いで混合液を遠心し上清を回収した。得られた上清１０μｌを、５０％アセトニトリルにギ酸を０．１％含有させた測定溶媒１９０μｌに加え、遊離型４Ｈｙｐ測定試料とした。一方、前記上清５０μｌを遠心濃縮して乾固させ、６Ｎ ＨＣｌ（ガス）、１１０℃、２０時間の条件で酸加水分解を行い、得られた加水分解物を前記測定溶媒２００μｌに溶解し、全４Ｈｙｐ測定用試料とした。更に、４Ｈｙｐ標品を０．０１、０．１、１および１０ｎｍｏｌ／ｍＬ含有する溶液１００μｌに前記標識コラーゲン酸加水分解溶液をそれぞれ１μｌ添加し、検量線用試料とした。これら各測定試料および検量線用試料について、後記する置換率の測定方法の項で記載するＬＣ／ＭＳ条件で測定対象血漿由来４Ｈｙｐ、標識コラーゲン由来標識４Ｈｙｐ、標品４Ｈｙｐの各ピーク面積を測定した。 検量線用試料に基づいて、４Ｈｙｐ標品ピーク面積／標識４Ｈｙｐピーク面積比と４Ｈｙｐ濃度との関係を示す検量線を作成した。遊離型４Ｈｙｐ測定試料の非標識４Ｈｙｐピーク面積／標識４Ｈｙｐピーク面積比を前記検量線で換算して、遊離型４Ｈｙｐ濃度を求めた。同様にして、全４Ｈｙｐ測定用試料に含まれる非標識４Ｈｙｐピーク面積／標識４Ｈｙｐピーク面積比から全４Ｈｙｐ濃度を求め、全４Ｈｙｐ濃度と遊離型４Ｈｙｐ濃度との差を４Ｈｙｐ含有ペプチド濃度とした。コラーゲンペプチド摂取後の血漿液量あたりの遊離型４Ｈｙｐ、全４Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ含有ペプチドの各濃度の経時変化を図８に示す。 一方、比較のため、検量線用試料に基づいて、４Ｈｙｐ標品ピーク面積と４Ｈｙｐ濃度との関係を示す検量線を作成した。遊離型４Ｈｙｐ測定試料の非標識４Ｈｙｐのピーク面積を前記検量線で換算して、遊離型４Ｈｙｐ濃度を求めた。同様にして、全４Ｈｙｐ測定用試料の非標識４Ｈｙｐのピーク面積から全４Ｈｙｐ濃度を求め、全４Ｈｙｐ濃度と遊離型４Ｈｙｐ濃度との差を４Ｈｙｐ含有ペプチド濃度とした。このように求めたコラーゲンペプチド摂取後の血漿液量あたりの遊離型４Ｈｙｐ、全４Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ含有ペプチドの各濃度の経時変化を図９に示す。 図９に示すように、標識コラーゲン由来の４Ｈｙｐと測定対象血漿由来の４Ｈｙｐとの質量比を用いない場合は、測定試料に含まれる４Ｈｙｐ量が０以下として算出される場合が存在した。血中に存在する種々のマトリックス成分が、ＬＣ／ＭＳ測定の際のイオン化に影響を与え、測定誤差を生ずるためである。しかしながら、図８に示すように、非標識４Ｈｙｐ／標識４Ｈｙｐ質量比に基づいて４Ｈｙｐを算出すると、マトリックス成分による測定誤差が相殺され、０以下の測定値が存在せず、かつ定量値が約２倍に増加され、顕著なイオン化抑制を補正しうることが示された。 （３）実施例１３で調製した標識コラーゲン１５０μｌに１００ｍＭとなるように重炭酸アンモニウムを添加し、タンパク質量の１／２０量のトリプシン（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ」）を加えて３７℃、１６時間、酵素分解を行った。１００℃で５分間加熱してトリプシンを失活させ遠心濃縮で乾固させた後、透析ＦＢＳ５０μｌを加え３７℃で２４時間反応させた。これに１５０μｌのエタノールを添加した後遠心し、上清を遠心濃縮で乾固させた後、蒸留水１００μｌに溶解し、これを安定同位体標識オリゴペプチド溶液とした。 上記（１）で得た各血漿１０μｌに安定同位体標識オリゴペプチド溶液１０μｌを添加し、６０μｌのエタノールを添加した後遠心し上清を得た。この上清６０μｌを遠心濃縮で乾固させた後、１％ギ酸５０μｌに溶解し、オリゴペプチド測定試料とした。 また、合成オリゴペプチドＰｒｏＨｙｐ、ＧｌｕＨｙｐ、ＬｅｕＨｙｐ、ＰｈｅＨｙｐ、ＧｌｙＰｒｏＨｙｐ、ＡｌａＨｙｐＧｌｙ、ＰｒｏＨｙｐＧｌｙおよびＳｅｒＨｙｐＧｌｙの０．１、０．２、０．５および１ｎｍｏｌ／ｍＬ溶液５０μｌに前記安定同位体標識オリゴペプチド溶液４μｌを添加し、検量線用試料とした。これら測定試料および検量線用試料について、下記ＬＣ／ＭＳ分析条件で測定対象血漿由来オリゴペプチド、安定同位体標識オリゴペプチド、合成オリゴペプチドの各ピーク面積を測定した。 検量線用試料に基づいて、合成オリゴペプチドピーク面積／標識オリゴペプチドピーク面積比とオリゴペプチド濃度との関係を示す検量線を作成した。測定試料の非標識オリゴペプチドピーク面積／標識オリゴペプチドピーク面積比を前記検量線で換算して、各オリゴペプチド濃度を求めた。コラーゲンペプチド摂取後の血漿液量あたりの各オリゴペプチド濃度の経時変化を図１０に示す。なお、４Ｈｙｐ含有ペプチド全量の値は前記（２）で算出し、図８で示したものを用いた。 実施例１３の標識コラーゲンの酵素分解物を内部標準として用いることで、含まれるマトリックス成分の影響を排除して正確な測定値を求めることができた。実際に、図１０に示すように、上記（３）で得た８ペプチドの合計量と上記（２）で得た４Ｈｙｐ含有ペプチド全量との値は非常に良く一致した。 （４）ＬＣ／ＭＳ分析測定条件 高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、 質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、 分析カラム：Synergi Hydro-RP 4μm, 2.0mmi.d.×250mm(Phenomenex)、 カラム温度：４０℃ 移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、 グラジエント条件： ０〜７．５分：Ａ液１００％；Ｂ液０％、 ７．５〜２０分：Ａ液１００〜５０％；Ｂ液０〜５０％、 ２０．１〜２５分：Ａ液２０％；Ｂ液８０％、 ２５．１〜３０分：Ａ液１００％；Ｂ液０％、 流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、 質量分析条件： イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、 分析モード：ＭＲＭモード、 イオンスプレー電圧：４ｋＶ、 イオンソース温度：７００℃ （実施例１８） 非特許文献４に従い、４８ウェルプレートの３ウェルに、それぞれ１０％ＦＢＳ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）含有ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）に分散したＨＥＬ細胞２×１０４ｃｅｌｌｓを播種し、一晩経過後に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＤＭＥＭからなるアッセイバッファー１５０μｌに置換し３０分間インキュベートした。第１のウェルには実施例１３で調製した標識コラーゲン０．７５μｇを添加してさらに５時間インキュベートした。 第２のウェルには以降に取り込まれたコラーゲンの分解を抑えるためリソソームシステインプロテアーゼ阻害剤（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製 Ｅ−６４ｄ）を１０μＭ添加して３０分間インキュベートした後、第１のウェルと同様に標識コラーゲン０．７５μｇを添加してさらに５時間インキュベートした。 第３のウェルはコントロールとして標識コラーゲンを添加しないで、上記と同様に５時間インキュベートした。 それぞれの細胞をトリプシン（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」）を使用して回収し、遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ（ガス）、１１０℃、２０時間の条件で酸加水分解を行った。得られた加水分解物を５０％アセトニトリルに０．１％となるように酢酸、５ｍＭとなるように酢酸アンモニウムを添加した溶解液に溶解し、置換率の測定方法に記載するＬＣ／ＭＳ分析のアミノ酸測定条件で標識コラーゲン由来４Ｈｙｐ量を測定した。０．７５μｇの標識コラーゲンを上記と同様に塩酸で加水分解して標識コラーゲン由来４Ｈｙｐのピーク面積を測定し、この値に対する上記測定値の百分率を算出し、取り込み率とした。結果を図１１に示す。培地にリソソームシステインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ−６４ｄ）を添加することで、細胞内の標識コラーゲン由来標識４Ｈｙｐ量が増加することが観察された。 （実施例１９） 以下の方法により、安定同位体標識Ｐｒｏで置換された標識コラーゲンＩＩを製造した。 ＲＣＳ細胞１．５×１０６ｃｅｌｌｓを、Ｌｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１００ｍｇ／Ｌ、Ａｒｇ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１００ｍｇ／Ｌ、１３Ｃ５１５Ｎ１−Ｐｒｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２００ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸（Ｗａｋｏ社製、商品名「Ｌ−アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物」）２００μＭ、透析ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品名「Ｄｉａｌｙｚｅｄ ＦＢＳ」）１０％を含有する安定同位体標識用ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、商品名「ＳＩＬＡＣ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉａ」）で培養した（１００ ｍｍ ｄｉｓｈ）。３日ごとに上記組成の培地で交換した。 培地上の細胞および沈着コラーゲンに、０．１ｍｇ／ｍＬペプシン（ＳＩＧＭＡ社製）（０．１Ｎ ＨＣｌ）を添加し、４℃で１６時間消化反応を行った。このペプシン消化溶液に２ＭとなるようにＮａＣｌを添加し、氷上で３時間静置してから遠心分離を行った。沈殿を２Ｍ ＮａＣｌと９５％エタノールで洗浄し、最後に５ｍＭ酢酸で溶解したものを標識コラーゲンＩＩとした。 （実施例２０） 実施例１９で得た標識コラーゲンＩＩについて、ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。結果を図１２に示す。コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＸ型およびコラーゲンＸＩ型とが混在することが判明した。 (標識アミノ酸・標識ペプチドの置換率の測定方法） 本発明において、標識コラーゲンにおける標識アミノ酸、標識ペプチドの置換率の測定は以下の方法に従った。なお、測定対象がペプチドである場合は、下記方法で、標識コラーゲン構成ペプチドと測定対象コラーゲン構成ペプチドの質量比を測定した。 （１）試料の調製 （ｉ）酸加水分解による安定同位体標識Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、ＨｙｌおよびＡｒｇの置換率の測定方法 ５ｍＭ酢酸に溶解した標識コラーゲン１０μｌを遠心濃縮で乾固させた後、６Ｎ ＨＣｌ(ガス）、温度１１０℃で２０時間加水分解した。この塩酸加水分解物を５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解し、下記ＬＣ／ＭＳ分析測定条件にて質量分析を行い、各アミノ酸のピーク面積を測定した。ピーク面積を基準として標識アミノ酸と非標識アミノ酸との総和に対する標識アミノ酸の百分率（標識アミノ酸×１００／（標識アミノ酸＋非標識アミノ酸））を算出し、標識アミノ酸の置換率（モル％）とした。上記酸加水分解試料により、Ｐｒｏ、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ、Ｌｙｓ、ＨｙｌおよびＡｒｇの置換率を算出した。なお、Ｈｙｌは、ＧＨＬおよびＧＧＨＬの糖鎖が外れてなるＨｙｌを含むため、これらを含む総Ｈｙｌの値となる。 （ｉｉ）アルカリ加水分解による安定同位体標識Ｈｙｌ、ＧＨＬおよびＧＧＨＬの置換率の測定方法 ５ｍＭ酢酸に溶解した標識コラーゲン５０μｌに６Ｎ ＨＣｌ（ガス）に代えて２Ｎとなるように水酸化ナトリウムを添加した後、上記と同様にして加水分解を行った。得られたアルカリ加水分解物を冷３０％酢酸で中和した後、陽イオン交換カラム（Ｗａｔｅｒｓ社、商品名「ＯＡＳＩＳ ＭＣＸ」）で脱塩し、その溶出液を遠心濃縮により乾固したのち、５０％アセトニトリルに酢酸を０．１％となるように、酢酸アンモニウムを５ｍＭとなるように添加した溶解液に溶解し、下記ＬＣ／ＭＳ分析測定条件にて質量分析を行い、各アミノ酸のピーク面積を基準として置換率（モル％）を算出した。上記アルカリ加水分解試料により、ＧＨＬおよびＧＧＨＬの置換率を算出した。 （ｉｉｉ）安定同位体標識ペプチドの置換率の測定方法 ５ｍＭ酢酸に溶解した標識コラーゲンと測定対象コラーゲンに、タンパク質量の１／１００量のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、商品名「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｒａｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ，Ｆｒｏｚｅｎ」）を加え、３７℃、１６時間、酵素分解を行った。得られた分解液にギ酸を１％となるように添加した後、下記ＬＣ／ＭＳ分析測定条件にてペプチドのピーク面積を測定した。 （２）ＬＣ／ＭＳ分析測定条件 （ｉ）アミノ酸分析 高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、 質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、 分析カラム：ZIC-HILIC 3.5μm, 2.1mmi.d.×150mm(Merck SeQuant)、 カラム温度：２５℃ 移動相：Ａ液；０．１％酢酸、5 mM酢酸アンモニウム、Ｂ液；１００％アセトニトリル、 グラジエント条件： ０〜５分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％、 ５〜２０分：Ａ液１０〜９５％；Ｂ液９０〜５％、 ２０〜２５分：Ａ液９５％；Ｂ液５％、 ２５．１〜３０分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％ 流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、 質量分析条件： イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、 分析モード：ＭＲＭモード、 イオンスプレー電圧：３ｋＶ、 イオンソース温度：６００℃ （ｉｉ）ペプチド分析 高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、 質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、 分析カラム：Ascentis Express C18 5μm, 2.1mmi.d.×150mm(SUPELCO)、 カラム温度：２５℃ 移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、 グラジエント条件： ０〜２分：Ａ液９８％；Ｂ液２％、 ２．１〜６分：Ａ液９８〜４０％；Ｂ液２〜６０％、 ６．１〜８分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％、 ８．１〜１０分：Ａ液９８％；Ｂ液２％ 流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、 質量分析条件： イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、 分析モード：（ＭＲＭ）モード、 イオンスプレー電圧：４ｋＶ、 イオンソース温度：７００℃ 本発明によれば、安定同位体標識コラーゲンを使用し、コラーゲンの翻訳後修飾アミノ酸量、全コラーゲン量、および型別コラーゲン量などを定量することができ、コラーゲン関連疾患に対する診断、薬効評価などに用いることができ有用である。 コラーゲンを構成するＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上のアミノ酸が対応する安定同位体標識アミノ酸で９０モル％以上置換された安定同位体標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾してなる安定同位体標識コラーゲンを使用するコラーゲンの分析方法であって、 前記安定同位体標識コラーゲンと、測定対象コラーゲンまたはコラーゲン由来アミノ酸もしくはペプチドとの混合物を測定試料とし、 前記コラーゲン由来ペプチド成分、または前記測定対象コラーゲンを分解して得たペプチドを測定対象ペプチドとし、前記測定対象ペプチドの質量と、前記安定同位体標識コラーゲンを分解して得た、前記測定対象ペプチドに対応する前記安定同位体標識コラーゲン由来ペプチドとの質量比を測定するペプチド質量比測定工程、および／または 前記コラーゲン由来アミノ酸、または前記測定対象コラーゲンを分解して得たアミノ酸を測定対象アミノ酸とし、前記測定対象アミノ酸の質量と、前記安定同位体標識コラーゲンを分解して得た、前記測定対象アミノ酸に対応する前記安定同位体標識コラーゲン由来のアミノ酸との質量比を測定するアミノ酸質量比測定工程を含む、コラーゲンの分析方法。 下記（ｉ）〜(ｖ) （ｉ）前記アミノ酸の質量比と前記測定試料に添加した安定同位体標識コラーゲン量とから測定試料に含まれる測定対象コラーゲン量を定量する、 （ｉｉ）前記アミノ酸の質量比と前記測定試料に添加した前記安定同位体標識コラーゲンに由来するアミノ酸量とから測定対象コラーゲン構成アミノ酸量を定量する、 （ｉｉｉ）前記ペプチドの質量比と前記測定試料に添加した安定同位体標識コラーゲン量とから、測定対象コラーゲンの型別コラーゲン量を定量する、 （ｉｖ）前記ペプチドの質量比と前記測定試料に添加した安定同位体標識コラーゲン量とから、測定対象コラーゲン構成ペプチド量を定量する、 （ｖ）予め作成した前記アミノ酸の質量比または前記ペプチドの質量比の検量線を用いて測定対象コラーゲン由来成分を定量する、のいずれかの定量工程を含む、請求項１記載のコラーゲンの分析方法。 コラーゲンを構成するＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＨｉｓからなる群から選択される少なくとも１以上のアミノ酸が対応する安定同位体標識アミノ酸で９０モル％以上置換された安定同位体標識コラーゲン前駆体を翻訳後修飾してなる安定同位体標識コラーゲン、前記安定同位体標識コラーゲンを分解してなるアミノ酸組成物、または前記安定同位体標識コラーゲンを分解してなるペプチド組成物。 コラーゲン産生細胞に、少なくとも安定同位体標識Ｐｒｏを添加して培養する安定同位体標識コラーゲンの製造方法であって、 Ｇｌｎを添加せずに前記コラーゲン産生細胞を培養し、 コラーゲンを構成するＰｒｏの安定同位体標識Ｐｒｏへの置換率が９０モル％以上である安定同位体標識コラーゲンを取得することを特徴とする、安定同位体標識コラーゲンの製造方法。 【課題】簡便に、また、正確に定量しうるコラーゲンの分析方法を提供する。【解決手段】安定同位体標識コラーゲンを使用するコラーゲンの分析方法であり、前記安定同位体標識コラーゲンと、測定対象コラーゲンまたはその由来アミノ酸もしくはペプチド成分との混合物を測定試料とし、測定対象コラーゲン由来ペプチドの質量と、安定同位体標識コラーゲン由来のペプチドとの質量比、または測定対象コラーゲン由来アミノ酸と安定同位体標識コラーゲン由来アミノ酸との質量比を質量分析により測定し、添加した安定同位体標識コラーゲンを基準に測定対象コラーゲン量や翻訳後修飾アミノ酸量を定量する。【選択図】なし配列表