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| タイトル： | 公開特許公報(A)_乳酸菌の培養方法及び食品材料 |
| 出願番号： | 2013171447 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | C12N 1/20,A23L 1/28 |
特許情報キャッシュ
片倉 啓雄 安田 智 越膳 浩 JP 2015039322 公開特許公報(A) 20150302 2013171447 20130821 乳酸菌の培養方法及び食品材料 株式会社明治 000006138 学校法人 関西大学 399030060 特許業務法人 小笠原特許事務所 110001276 片倉 啓雄 安田 智 越膳 浩 C12N 1/20 20060101AFI20150203BHJP A23L 1/28 20060101ALI20150203BHJP JPC12N1/20 AA23L1/28 Z 6 ＯＬ 10 4B018 4B065 4B018LB01 4B018MD86 4B018MF13 4B065AA30X 4B065BB24 4B065BB26 4B065BB40 4B065BC31 4B065CA42 本発明は、固形物を含む培地を用いて、乳酸菌を培養する培養方法及びこの培養方法によって得られる食品材料に関する。 乳酸菌を利用した食品として、発酵乳や乳酸菌飲料がある。発酵乳や乳酸菌飲料は、殺菌した液体原料に乳酸菌を接種して発酵させることによって製造されるが、これらの発酵乳や乳酸菌飲料における乳酸菌の培養方法は液体培養に該当する。特開２００４−０５７０２０号公報 液体培地を用いて、乳酸菌を純粋培養すると、乳酸菌が産生する乳酸によって、液体培地のｐＨが低下する。他の微生物と比べて、乳酸菌は比較的低いｐＨの条件下でも良好に増殖するが、その増殖に伴って生産物である乳酸が増加して、液体培地のｐＨが４近傍まで低下すると、乳酸菌自体の増殖も抑制される。したがって、液体培地を用いた一般的な乳酸菌の培養方法では、実際に得られる乳酸菌の生菌濃度（培地の単位量当たりの乳酸菌の生菌数）には限界がある。 それ故に、本発明は、液体培地を用いる場合と比べて高い乳酸菌の生菌濃度が得られる乳酸菌の培養方法及びこの培養方法によって得られる食品材料を提供することを目的とする。 本発明に係る乳酸菌の培養方法は、脱脂粉乳と小麦粉とを含む培地に乳酸菌を接種し、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を４０％より多く、かつ、６５％未満とし、乳酸菌の至適生育温度域で１２時間以上培養するものである。 また、本発明に係る乳酸菌の培養方法は、脱脂粉乳と小麦粉とを含む培地に乳酸菌を接種し、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を６５％未満とし、乳酸菌の至適生育温度域で４８時間以上培養するものである。 本発明に係る乳酸菌の培養方法によれば、液体培地（一般的に含有水分量は９０％程度である。なお、本発明において、特に指定しない限り、「％」は「重量％」を意味する。）を用いる場合と比べて高い乳酸菌の生菌濃度を得ることが可能となる。実施例１における乳酸菌の生菌濃度の経時変化を示すグラフ実施例１におけるｐＨの経時変化を示すグラフ実施例１における乳酸濃度の経時変化を示すグラフ実施例１における培養開始から２４時間後、４８時間後及び７２時間後の乳酸生成量を示すグラフ実施例２における乳酸菌の生菌濃度及びｐＨの経時変化を示すグラフ実施例２における乳酸菌の乳酸濃度の経時変化を示すグラフ実施例２における培養開始から２４時間後、４８時間後及び７２時間後の乳酸生成量を示すグラフ 本実施形態に係る乳酸菌の培養方法は、固形物を含む培地に乳酸菌を接種し、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を一定割合以下として、乳酸菌をその至適生育温度域で培養するものである。 本実施形態に係る培地に添加する固形物には、脱脂粉乳及び小麦粉の混合物を用いる。小麦粉の種類は、特に限定されず、薄力粉、中力粉、強力粉等のいずれを使用しても良い。培地として、小麦粉のみを使用した場合でも、乳酸菌を培養することは可能であるが、小麦粉と脱脂粉乳とを併用した場合の方が、乳酸菌による乳酸の生成が抑制され、この結果として、乳酸菌の生菌濃度がより高まる（乳酸菌の生菌数がより増加する）。脱脂粉乳と小麦粉との混合割合は、特に限定されないが、脱脂粉乳と小麦粉との重量比が例えば、１：０．１〜１０となるように混合すれば良く、好ましくは１：０．５〜５、より好ましくは１：０．５〜１．５、さらに好ましくは１：１である。 脱脂粉乳及び小麦粉を含む培地に、所定の培地で前培養した乳酸菌を接種すると共に、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量（培地の重量に対する水分の重量の割合）を調整する。乳酸菌の前培養には、液体培地を用いることができる。前培養で得られた培養液を培地に加えると共に、所定量の水を加えることによって、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を調節する。ここで、培地の含有水分量とは、脱脂粉乳及び小麦粉に当初含まれている水分の量と、水分量調整のために加えた水の量との和をいう。乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を６５％未満に調節するが、実際には３５％以上６５％未満に調節する。このとき、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量が３５％を下回ると、水分が培地に行き渡りにくくなり、培地と水分の均一化が困難となる。一方、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量が６５％以上となると、液体培地を用いた培養方法に対する乳酸菌の生菌数の増加量が小さくなる。 前記の培地の含有水分量の調整後、乳酸菌をその至適生育温度域または至適生育温度域の近傍の温度域で所定時間培養する。乳酸菌の至適生育温度域とは、実際に培養（使用）する乳酸菌が良好に生育する温度範囲をいう。そして、乳酸菌の至適生育温度域は、例えば、３０〜４５℃となるように設定すれば良く、好ましくは３０〜４３℃、より好ましくは３３〜４３℃、さらに好ましくは３５〜４０℃である。また、至適生育温度域の近傍の温度域とは、実際に使用する菌株にとって最適な生育温度ではないが、実用上で培養が可能な温度範囲をいい、具体的には、至適生育温度域の下限値−５℃以上、至適生育温度域の下限値未満の範囲、または、至適生育温度域の上限値より高く、至適生育温度域の上限値＋５℃以下の範囲である。なお、本実施形態に係る培養時間は、例えば、１２時間以上である。 本実施形態に係る含有水分量及び培養時間は、培養の目的に応じて、以下のように使い分けることができる。 まず、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を４５％以上６５％未満、好ましくは４５％超（４５％より多く）６３％未満とする場合、培養時間を１２時間以上４８時間以下とすることにより、液体培地で培養する場合に比べて、培地の単位重量当たりの乳酸菌の生菌数を増加させることができる。この条件の範囲において、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を５０％以上６０％以下とし、培養時間を１２時間以上３６時間以下とすることがより好ましく、５５％以上５８％以下とし、培養時間を１２時間以上３６時間以下とすることがさらに好ましい。この場合、前記の培地の含有水分量を５０％以上６０％以下、好ましくは５５％以上５８％以下とし、培養時間を２４時間程度とすることにより、本実施形態に係る培養方法で得られる、培地の単位重量当たりの乳酸菌の生菌数を、液体培地で培養した場合の１０倍程度まで増加させることができるため、より効率的に乳酸菌を増加させることができる。 次に、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量が３５％以上６５％未満、好ましくは３５％以上６３％未満とする場合、培養時間を４８時間以上とすることにより、液体培地で培養する場合に比べて、培地の単位重量当たりの乳酸菌の生菌数を増加させることができると共に、培地の単位重量当たりの乳酸菌の生菌数を可能な限りで多くすることができる。この条件の範囲において、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を３５％以上６０％以下とし、４８時間以上とすることがより好ましく、３７％以上５５％以下とし、培養時間を４８時間以上とすることがさらに好ましく、３７％以上５０％以下とし、培養時間を４８時間以上とすることが特に好ましい。この場合、前記の培地の含有水分量を３５％以上６０％以下、好ましくは３７％以上５５％以下、より好ましくは３７％以上５０％以下とし、培養時間を６０時間以上とすることにより、本実施形態に係る培養方法で得られる、培地の単位重量当たりの乳酸菌の生菌数を、液体培地で培養した場合の１０倍程度まで増加させることができるため、より効率的に乳酸菌を増加させることができる。そして、前記の培地の含有水分量を３７％以上４５％未満、好ましくは３７％以上４０％以下とし、培養時間を６０時間以上とすることにより、本実施形態に係る培養方法で得られる、培地の単位重量当たりの乳酸菌の生菌数を最大化することができる。 このように、本実施形態に係る乳酸菌の培養方法では、脱脂粉乳及び小麦粉を含み、含有水分量が液体培地と比べて大幅に低減された培地を使用する。培地の含有水分量を概ね６３％未満に低減することによって、乳酸菌による乳酸の産生が抑制される。乳酸の産生が抑制されることによって、培地のｐＨの低下速度が液体培地と比べて緩やかになる。この結果として、乳酸菌がある程度まで増殖した段階でも、乳酸菌の生育が抑制されにくくなり、液体培地と比べて、乳酸菌の生菌数を増加させることができる。このとき、乳酸菌には、ブルガリア菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ヘルベティカス菌（Lactobacillus helveticus）、サーモフィルス菌（Streptococcus thermophilus）、クレモリス菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ラクチス菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ガセリ菌（Lactobacillus gasseri）が好ましく、ブルガリア菌、サーモフィルス菌、ガセリ菌がより好ましく、ブルガリア菌、サーモフィルス菌がさらに好ましく、ブルガリア菌が特に好ましい。なお、本発明において、乳酸菌の概念には、ビフィズス菌、プロピオン酸菌などの発酵製品を調製できる微生物を含むものとする。 本実施形態に係る乳酸菌の培養方法で得られる培養物は、脱脂粉乳及び小麦粉の混合物を培地としたものであるので、そのまま食品材料（原料）としての利用が可能である。具体的には、小麦粉等を原料に用いた焼き菓子等の原料として利用できる。本実施形態に係る培養方法で得られた培養物を原料の全部又は一部として配合（添加）した場合、乳酸菌が産生した乳酸による酸味や、乳酸菌の発酵による特有の風味、さらには、乳酸菌（プロバイオティクス等）の作用による機能性等を、実際に製造した食品に付与することができる。 尚、液体培地を用いて、乳酸菌を前培養する代わりに、固形物を含む培地を用いて、本実施形態に係る培養方法により、乳酸菌を前培養しても良い。この場合、前培養で得られた固形物を含む培養物を、新たな培地に混合することによって、乳酸菌を接種すれば良い。ただし、上記の例のように、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量の調整が容易になるので、液体培地を用いて、乳酸菌を前培養する方が好ましい。 以下、本発明に係る乳酸菌の培養方法を具体的に実施した実施例を説明する。 ＜前培養の培地＞ 前培養の培地として、ＭＲＳ液体培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用した。ＭＲＳ培地の組成は、以下の表１の通りである。 ＜本培養の培地＞ 本培養の培地として、脱脂粉乳（株式会社 明治）の５ｇと、強力粉（今津株式会社）の５ｇとをプラスティックチューブに分取し、密栓した状態で１０ｋＧｙのγ線を照射することにより滅菌したものを使用した。 ＜前培養の方法＞ ＭＲＳ液体培地の５ｍｌにフローズンストックされた乳酸菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、明治ブルガリアヨーグルト プレーンから分離した）を植菌し、３７℃に一晩で静置培養した。この培養液を生理食塩水で１００倍に希釈したもの（希釈後の前培養液）を、本培養における乳酸菌の接種に使用した。 ＜本培養の方法＞ 滅菌後の本培養の培地に、希釈後の前培養液の０．１ｇと、所定量の滅菌水とを添加し、火炎滅菌したスパチュラで均一になるまで混合した後、３７℃に所定時間で静置培養した。滅菌水の添加量と、滅菌水で調整した後の培地の含有水分量との関係は、以下の表２の通りである。以下の表２において、含有水分量が９１％の培地は、従来の液体培地（脱脂粉乳培地、還元脱脂乳）に相当する。尚、含有水分量が３７〜６３％の培地を作製するに際し、滅菌水の添加量は、脱脂粉乳の５ｇと強力粉の５ｇとの混合物に対する、実際の滅菌水の添加量であり、含有水分量は、培地の全体量に対する、脱脂粉乳の５ｇと強力粉の５ｇとの混合物が元来含有している水分量の０．９ｇと滅菌水の添加量との合計量の割合を表す。 ＜サンプリング方法＞ クリーンベンチ内で電子天秤を用いて、培養後の培地を１ｇで秤量し、生理食塩水の９ｇと共にポリエチレン製の袋に入れ、ストマッカー（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ株式会社 ＭｉｎｉｍｉｘＣＣ）を用いて均一に懸濁させた（４ｓｔｒｏｋｅｓ／ｓｅｃで１０秒間）。この懸濁液を用いて、乳酸菌の生菌数、ｐＨ、乳酸濃度を測定した。 ＜生菌数の測定方法＞ サンプリングによって得られた懸濁液を所定量の生理食塩水で希釈し、この希釈液の１０μｌをＭＲＳ寒天培地にプレーティングし、コロニー数をカウントした。このカウントしたコロニー数と懸濁液の希釈倍率とから、培地の１ｇ当たりの乳酸菌の生菌数を求めた。 ＜乳酸濃度の測定方法＞ サンプリングによって得られた懸濁液について、バイオセンサー（王子計測機器株式会社、ＢＦ−５）を用いて、乳酸濃度を測定した。この測定にあたって、純水、１、２及び５ｍＭの乳酸標準液を用いて検量線を作製した。サンプリングによって得られた懸濁液について、乳酸濃度が検量線の範囲内に収まるように適宜希釈して、乳酸濃度を測定した。 （実施例１） 実施例１として、培地の含有水分量を３７％、４５％、５５％、５８％及び６３％に調整し、乳酸菌を培養した。また、本発明の培地と従来の液体培地との比較のために、対照（液体培地）として、培地の含有水分量を９１％に調整し、乳酸菌を培養した。乳酸菌の生菌濃度（培地の１ｇ当たりの乳酸菌の生菌数）、ｐＨ及び乳酸濃度の経時変化を図１〜３に示す。また、培養開始から２４時間後、４８時間後及び７２時間後の乳酸生成量を図４に示す。 図１に示すように、培地の含有水分量が４５％超（より多く）６３％未満のサンプル、すなわち、培地の含有水分量が５５％や５８％のサンプルでは、培養開始から１２時間後において、培地の含有水分量が９１％のサンプル（液体培地を用いて、乳酸菌を培養した場合）と比べて１０倍程度の高い乳酸菌の生菌濃度が得られた。また、図２〜４に示すように、培地の含有水分量が少なくなるにつれて、乳酸菌による乳酸の生産が抑制され、培地のｐＨの低下が緩やかになることが確認された。 また、培地の含有水分量が６３％未満のサンプルでは、培養時間が長くなるにつれて、乳酸菌の生菌濃度が増加することが確認された。特に、培地の含有水分量が最も少ない３７％のサンプルでは、乳酸菌の生菌濃度は単調に増加し、全てのサンプルのうちで最も高い乳酸菌の生菌濃度を得ることができた。 （実施例２） 実施例２として、培地に用いる固形物を、脱脂粉乳のみ、薄力粉のみ、中力粉のみ、強力粉のみ、脱脂粉乳と薄力粉の混合物、脱脂粉乳と中力粉の混合物、脱脂粉乳と強力粉の混合物とし、乳酸菌を培養した。本実施例では、培地の含有水分量を５５％に調整した。 乳酸菌の生菌濃度（培地の１ｇ当たりの乳酸菌の生菌数）及びｐＨの経時変化を図５Ａに、また、乳酸濃度の経時変化を図５Ｂに示す。また、培養開始から２４時間後、４８時間後及び７２時間後の乳酸生成量を図６に示す。 図５Ａ及び５Ｂに示すように、脱脂粉乳、薄力粉、中力粉のいずれかのみを培地に使用したサンプルと比べて、薄力粉、中力粉、強力粉のいずれかと、脱脂粉乳とを培地に併用したサンプルでは、高い乳酸菌の生菌濃度が得られた。また、図６に示すように、薄力粉、中力粉、強力粉のいずれかのみを培地に使用したサンプルと比べて、薄力粉、中力粉、強力粉のいずれかと、脱脂粉乳とを併用したサンプルでは、乳酸生成量が抑制されることが確認された。 （実施例３） 実施例３として、実施例２で得られた本実施形態に係る乳酸菌の培養物（培地に用いる固形物を、脱脂粉乳のみ、薄力粉のみ、脱脂粉乳と薄力粉の混合物としたもの）を所定量で配合し、従来公知の一般的な方法により、焼き菓子を作製した。これらの焼き菓子では、乳酸菌が産生した乳酸による酸味や、乳酸菌の発酵による特有の風味を有しており、独特な美味しさを感じられた。さらに、これらの焼き菓子では、乳酸菌の作用による機能性を期待できた。本実施形態に係る乳酸菌の培養物は、焼き菓子やパン等の食品材料として有用であることが確認された。 本発明は、乳酸菌の培養方法及び焼き菓子やパン等の食品材料の製造方法として利用できる。 乳酸菌の培養方法であって、 脱脂粉乳と小麦粉とを含む培地に乳酸菌を接種し、 乳酸菌の接種後における前記培地の含有水分量を４５％以上６５％未満とし、 前記乳酸菌の至適生育温度域で１２時間以上培養することを特徴とする、乳酸菌の培養方法。 乳酸菌の接種後における前記培地の含有水分量を５０％以上６０％以下とすることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌の培養方法。 乳酸菌の培養方法であって、 脱脂粉乳と小麦粉とを含む培地に乳酸菌を接種し、 乳酸菌の接種後における前記培地の含有水分量を６５％未満とし、 前記乳酸菌の至適生育温度域で４８時間以上培養することを特徴とする、乳酸菌の培養方法。 乳酸菌の接種後における前記培地の含有水分量を３５％以上６０％以下とすることを特徴とする、請求項３に記載の乳酸菌の培養方法。 乳酸菌の接種後における前記培地の含有水分量を３５％以上６０％以下とし、 前記乳酸菌の至適生育温度域で６０時間以上培養することを特徴とする、請求項３に記載の乳酸菌の培養方法。 請求項１〜５のいずれかに記載の乳酸菌の培養方法によって得られる、食品材料。 【課題】液体培地を用いる場合と比べて高い生菌濃度が得られる乳酸菌の培養方法及びこの培養方法によって得られる食品材料を提供する。【解決手段】脱脂粉乳及び小麦粉を含む培地を用いて、乳酸菌を培養する。より具体的には、脱脂粉乳及び小麦粉を含む培地に乳酸菌を接種し、乳酸菌の接種後における培地の含有水分量を６５％未満に調整して、乳酸菌をその至適生育温度域で１２時間以上培養する。【選択図】なし