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| タイトル： | 公開特許公報(A)_バイオチップ用基板及びその製造方法 |
| 出願番号： | 2013170981 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | G01N 33/543,G01N 33/553,G01N 37/00 |
特許情報キャッシュ
森下 亮 竹林 恭志 山口 圭 JP 2015040729 公開特許公報(A) 20150302 2013170981 20130821 バイオチップ用基板及びその製造方法 日本軽金属株式会社 000004743 特許業務法人谷川国際特許事務所 110001656 森下 亮 竹林 恭志 山口 圭 G01N 33/543 20060101AFI20150203BHJP G01N 33/553 20060101ALI20150203BHJP G01N 37/00 20060101ALI20150203BHJP JPG01N33/543 525UG01N33/543 525WG01N33/553G01N37/00 102 6 1 ＯＬ 9 本発明は、タンパク質、核酸、ペプチド誘導体、糖鎖とその誘導体、天然物、小分子化合物等の生体関連物質をプローブとして固定化するためのバイオチップ用基板に関する。 タンパク質チップ、ペプチドチップ、DNAチップ等のバイオチップは、各種疾患の診断や研究用として広く用いられている。従来より広く用いられているバイオチップは、通常、スライドガラス等のガラス基板上にタンパク質、ペプチド又はDNAのような生体関連物質を固定化したものである。 しかしながら、ガラス基板を用いた従来のバイオチップでは、非特異吸着が発生しやすく、測定の正確性に問題があった。また、ガラス基板は自家蛍光を発生するので、近年多く用いられるようになった蛍光標識を利用した測定においては正確性に問題があった。 これらの問題を解決すべく、金属製の基板上に活性基を有する炭素含有層を形成し、この活性基に生体関連物質を結合するバイオチップ用基板が提案されている（特許文献１）。このバイオチップ用基板は、自家蛍光を発生せず、生体関連物質の固定化が容易であり、基板の加工が容易で平坦性と表面精度が高いという優れた性質を有する。さらに、少なくとも表面が炭素から成る基板上に、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーを共有結合で結合して成るバイオチップ用基板も提案されている（特許文献２）。生体関連物質は、このアミノ基に共有結合される。このバイオチップ用基板も、特許文献１記載のバイオチップ用基板と同様、優れた性質を有する。特開2006-329686号公報特開2010-008378号公報 上記した公知のバイオチップ用基板は優れた性質を有しているが、固定化できるアミノ基の量をさらに増大させることができれば、生体関連物質をさらに高密度で固定化することが可能になる。 本発明の目的は、公知のバイオチップ用基板よりも、固定化できるアミノ基の量を増大させることが可能な新規なバイオチップ用基板及びその製造方法を提供することである。 本願発明者らは、鋭意研究の結果、金属基板上に直接又はNiP層を介してアミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーカルボキシル基含有ポリマーを固定化することにより、公知のバイオチップ用基板よりも、固定化できるアミノ基の量を増大させることが可能であることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、金属基板と、該金属基板上に直接又はNiP層を介して固定化されたアミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー層又はカルボキシル基含有ポリマー層とを含むバイオチップ用基板を提供する。また、本発明は、金属基板上に直接、又は該金属基板上に形成されたNiP層上に、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーを塗布し、紫外線照射することを含む、上記本発明のバイオチップ用基板の製造方法を提供する。 本発明のバイオチップ用基板では、基板表面上にアミノ基又はカルボキシル基が高密度に、均一に、かつ安定に結合され、このアミノ基又はカルボキシル基を利用してタンパク質や核酸等の生体関連物質から成るプローブを固定化することにより、プローブ固定化率が高く、且つ固定化密度が均一であり、さらに、タンパク質の非特異吸着を防止することにより検出感度が高く且つ再現性が高くなる。また、本発明のバイオチップ用基板では、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー層又はカルボキシル基含有ポリマー層が金属基板上に直接又はNiP層を介して固定化されており、公知の金属基板バイオチップのように、炭素含有層を含まないので、構造が単純であり、炭素含有層を形成するコストを削減することができる。下記実施例で作製した、ステンレス鋼基板上に直接ポリアリルアミン層を固定化したバイオチップ用基板の表面を全面TAMRA化し、蛍光を測定した結果を示す図である。下記実施例で作製した、ステンレス鋼基板上に直接ポリアクリル酸層を固定化したバイオチップ用基板の表面を全面TAMRA化し、蛍光を測定した結果を示す図である。 本発明のバイオチップ用基板（以下、単に「基板」と略すことがある）では、基板表面にアミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーが固定化されている点に特徴がある。ここで、「アミノ基」は、一級アミノ基、すなわち、-NH2を意味する。アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーとしては、好ましくは、基板表面に固定化される前の状態で、前記アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーを構成する構成単位の５０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９９％以上が、それぞれアミノ基を少なくとも１個有するものである。このようなアミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーは、１分子中に多数のアミノ基を有するので、基板表面上にアミノ基が均一かつ高密度に結合される。アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーは、アミノ基を有するビニル系モノマーが付加重合することにより形成されたものであることが好ましく、特にポリアリルアミン(PAA)が好ましい。また、カルボキシル基含有ポリマーとしては、好ましくは、基板表面に固定化される前の状態で、前記カルボキシル基含有ポリマーを構成する構成単位の５０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９９％以上が、それぞれカルボキシル基を少なくとも１個有するものである。このようなカルボキシル基含有ポリマーは、１分子中に多数のカルボキシル基を有するので、基板表面上にカルボキシル基が均一かつ高密度に結合される。カルボキシル基含有ポリマーは、カルボキシル基を有するビニル系モノマーが付加重合することにより形成されたものであることが好ましく、特にポリ（メタ）アクリル酸が好ましい（「ポリ（メタ）アクリル酸」は、ポリアクリル酸(PAc)とポリメタクリル酸の総称）。なお、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーが基板に「固定化」されている場合には、水中で１時間振とう洗浄してもポリマーが離脱しない。 アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーの平均分子量（重量平均分子量）は、本発明の効果をより良く達成する観点からPAA換算又はPAc換算で１０００以上が好ましく、さらに好ましくは２０００以上である。ここで、「PAA換算」及び「PAc換算」は、それぞれ、１分子中のアミノ基又はカルボキシル基の数を基準として換算することを意味する（以下同じ）。一方、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーの分子量の上限は、特に限定されず、溶解性及び塗布液の安定性等の取扱い性に問題がない範囲であればよく、６万以下が好ましく、さらには６０００以下が好ましい。 アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーのみを固定化した基板にプローブを固定化したものであってもタンパク質の非特異吸着はあまり起きないが、疎水結合等によるタンパク質等の非特異吸着をさらに防止することが望まれる場合には、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーに加え、親水性ポリマーを基板表面に共有結合で固定化することができる。親水性ポリマーとしては、アミノ基又はカルボキシル基との反応性の低いものを使用する。親水性ポリマーの例として、ポリエーテル類、ポリアクリルアミド、アガロース等を挙げることができる。特にポリエーテル類の中でもポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と略すことがある）は分子量分布を制御したものが使用可能であり、安定性も高く、生体物質を不活性化しないため好ましい。親水性ポリマーの平均分子量はアミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーのリンカーまたはプローブとの反応性を阻害しない分子量が好ましく、２００〜１０，０００であり、より好ましくは１，０００である。 親水性ポリマーを固定化する場合には、アミノ基の均一な分布を確保するために、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーと親水性ポリマーは均一に混合されていることが好ましい。すなわち、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーと親水性ポリマーの均一な混合物を後述する方法で基板表面上に固定化することが好ましい。 親水性ポリマーは、任意成分であるので、固定化しなくてもよいが、固定化する場合には、その固定化量は、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーの固定化量以下にすることが、十分な数のアミノ基又はカルボキシル基を基板表面上に結合する上で好ましい。また、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーと親水性ポリマーの両方を固定化する場合でも、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーの基板表面への固定化量は、上記の通りポリアリルアミン換算又はポリアクリル酸換算で４μｇ／ｃｍ２以上であることが好ましい。一方、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマーと親水性ポリマーの合計固定化量は、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー単独の場合と同様、４０μｇ／ｃｍ２以下であることが好ましい。親水性ポリマーの固定化量により、基板の親水性を調節することができる。 金属基板としては、特に限定されないが、アルミニウム、ステンレス鋼等の通常の金属から成る基板を好ましく用いることができる。 アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー層は、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー溶液を、金属基板表面に直接又はNiP層を介して（すなわち、金属基板上に形成されたNiP層上に塗布する）塗布し、紫外線照射することにより、金属基板に直接又はNiP層を介して固定化することができる。なお、NiP（ニッケル−リン）層は、好ましくは、無電解めっきにより形成することができ、この方法自体は公知であり、特許文献１及び特許文献２にも記載されている。 上記固定化方法は、ポリマー溶液を基板表面に塗布後、光照射によって生成するラジカルにより結合させるもので、照射する光としては、波長１５０ｎｍ〜２６０ｎｍ程度、例えば波長１８４ｎｍや２５４ｎｍ等の紫外線を使用することができる。この波長の光によりＣ−Ｃ、Ｃ−Ｏ、Ｃ−Ｈ結合が切断され、ラジカルが発生する。このとき空気中の酸素分子、水分子も分解されて酸素ラジカル、オゾンが発生し基板材料カーボンとポリマーの酸化分解も同時に起こり共有結合生成阻害の原因となる。これを防止するため本製造方法は減圧下または、不活性ガス雰囲気下で光照射を実施することが好ましい。減圧は大気圧を基準（０ＭＰａ）として−０．０５ＭＰａ以下、より好ましくは−０．０８ＭＰａ以下の真空度で実施する。不活性ガスはアルゴン、ヘリウム等の光照射を受けてもラジカル化しにくい希ガス元素を使用する。光の照射量は、ポリマーを共有結合するのに必要な量であればよく、エネルギー量として、基板表面１ｃｍ２当たり通常、約１〜６ジュール、好ましくは約２〜４ジュール程度である。例えば、基板表面１ｃｍ２当たり１８．５ｍＷの紫外線を通常１〜５分、好ましくは２〜４分照射する。また、ポリマーの塗布量は、上記したポリマーの固定化量を達成する量である。ポリマー溶液の濃度は、必要なポリマー塗布量を達成でき、均一に塗布できる濃度であればよく、0.5〜３(w/v)％程度が好ましい。 ポリマーの基板表面への塗布は、一般的な手法を用いることができ、ポリマーの塗布量を制御できる手法であれば、特にその方法を限定するものではない。例えば、ロールコート、スプレーコート、スピンコート、ディップコート等から選択し実施可能である。 上記のようにして得られる本発明の基板は、表面に均一かつ高密度にアミノ基を有する。このアミノ基を利用して、生体関連物質を共有結合により固定化することによりバイオチップを構成することができる。生体関連物質としては、バイオチップにおいてプローブとして用いられているいずれの物質であってもよく、任意のポリペプチド（天然又は合成のタンパク質、オリゴペプチドを包含）、核酸（DNA及びRNA並びに人工核酸を包含）、糖、脂質、これらの複合体（糖タンパク質等）並びに誘導体（修飾タンパク質や核酸等）が挙げられる。 生体関連物質は、アミノ基に直接共有結合することもできるし、所望のリンカーを介して結合することもできる。表面にアミノ基を有するバイオチップ用基板自体は広く市販されているので、生体関連物質のアミノ基への共有結合は、周知の常法により容易に行なうことができる。生体関連物質がタンパク質のように、アミノ基と結合するカルボキシル基等を有している場合には直接結合することができ、このような官能基を有していない場合、あるいは所望により、リンカーを介して結合することも可能である。リンカーも周知であり、例えば、一端にカルボキシル基、他端に例えばマレイミド基等を有するものが広く用いられている。 以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実施例１１． バイオチップ用基板の作製（その１） アルミニウム合金（5000系合金）の圧延板（７５×２５ｍｍ厚さ１ｍｍ）をＰＶＡ砥石で厚さ０．９８ｍｍまで研削し、表面粗さをＲａ３０ｎｍとした後、全面をアルカリ脱脂、硝酸デスマット、亜鉛ジンケート処理を行い、ニッケル−リン無電解めっきを片面あたり厚さ１３μｍつけた。さらに、両面をアルミナスラリーにより片面あたり３μｍ研磨し表面粗さＲａを１ｎｍとした。 ＰＡＡ（平均分子量3,000）をエタノールで1(w/v)％となるように濃度調整したものをコーティング液とした。ＰＡＡコーティング液を適量ピペットで分取し、基板材料表面に滴下した後、ＰＡＡ塗布量が２０μｇ／ｃｍ２になるように塗工厚さを３ｍｉｌ(約0.076mm)に設定したベーカー式アプリケーターにより基板材料表面全体にコーティング液を塗り広げた。溶媒が揮発してからさらに1時間真空乾燥した（真空度-0.098ＭＰａ）のち、そのまま真空下で3分間紫外線を照射（18.5ｍＷ／ｃｍ２，254ｎｍ）しＰＡＡを固定化した。さらに超純水で1時間振とう洗浄して未反応のＰＡＡを除去してからスピン乾燥させ本発明のバイオチップ用基板を得た。２． 評価 実施例１で得られたバイオチップ用基板の表面を３つの領域に分け、各領域の全面に市販の蛍光標識であるTAMRA（テトラメチルローダミン）を結合した。この全面TAMRA化は、具体的に次のようにして行った。0mM N,N,N',N'-テトラメチル-(5又は6）-カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、10ｍＭ ＨＢＴＵ（２−１H［ベンゾトリアゾルー１−イル］―１，１，３，３，テトラメチルウロニウムーヘキサフルオロホスフェート）、20ｍＭ ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液に基板を浸漬し室温で1時間振とうさせてアミノ基にＴＡＭＲＡを結合させた。続いてメタノール洗浄で過剰なＴＡＭＲＡを洗い流した後、基板を乾燥した。この方法から明らかなように、基板に結合されたTAMRAの量は、基板表面上のアミノ基の量が多くなるほど多くなる。従って、基板に結合されたTAMRAの量を測定することにより、基板表面上のアミノ基の相対量を測定することができる。 水洗後、蛍光スキャナーを用い以下の条件で測定した。 励起波長：532 nm（フィルター570nm）、635nm(フィルター670nm)、 レーザー出力：固定 、PMT：50 ％、解像度：10 mm各励起波長で測定された蛍光値を下記表１に示す。 表１に示す結果から、基板上にアミノ基が固定化されていることが確認された。 比較のため、特許文献２に記載されている、アルミニウム板／NiPめっき層／カーボン層／PAA層を持つバイオチップ用基板に上記と同様に全面TAMRA化を行い、蛍光値を測定したところ、TAMRA化前の蛍光値では上記実施例１と同程度であったが、TAMRA化後の蛍光値は約3000程度であり、本発明の基板の方がアミノ基の量が約４倍多かった。実施例２１． バイオチップ用基板の作製（その２） スライドガラスサイズのSUS板（板厚2mm)に、2(w/v)%のPAAを含むPAA溶液を実施例１と同様に塗布し、実施例１と同様にしてPAAを固定化した。２． 評価 実施例１と同様にして全面TAMRA化を行い、水洗後、FLA-8000で蛍光強度を測定した。測定条件は以下の通りであった。 PMT 50%，励起波長532nm，蛍光フィルター570nm，解像度10μm 結果を図１に示す。図１から、基板の表面にアミノ基が固定化されていることが明らかになった。このことから、NiP無電解メッキ層を介することなく、ステンレス鋼基板上に直接PAAを固定化することが可能であることが明らかになった。実施例３１． バイオチップ用基板の作製（その２） スライドガラスサイズのSUS板（板厚2mm)に、2(w/v)%のPAcを含むPAc溶液を実施例１と同様に塗布し、実施例１と同様にしてPAcを固定化した。２． 評価 実施例１と同様にして全面TAMRA化を行い、水洗後、実施例２と同様に蛍光強度を測定した。 結果を図２に示す。図２から、基板の表面にカルボキシル基が固定化されていることが明らかになった。このことから、NiP無電解メッキ層を介することなく、ステンレス鋼基板上に直接PAcを固定化することが可能であることが明らかになった。 金属基板と、該金属基板上に直接又はNiP層を介して固定化されたアミノ基含有ポリマー層又はカルボキシル基含有ポリマー層とを含むバイオチップ用基板。 前記アミノ基含有ポリマーが、ポリアリルアミンである請求項１記載のバイオチップ用基板。 前記カルボキシル基含有ポリマーが、ポリ（メタ）アクリル酸である請求項１記載のバイオチップ用基板。 前記アミノ基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマー層が、前記金属基板又はNiP層上に前記アミノ基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーの溶液を塗布した後、紫外線照射することにより固定化されたものである請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板。 前記金属基板がアルミニウム製であり、前記アミノ基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーが前記NiP層を介して前記金属基板上に固定化されている請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板。 前記金属基板がステンレス鋼製であり、前記アミノ基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーが前記金属基板上に直接固定化されている請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオチップ用基板。 【課題】公知のバイオチップ用基板よりも、固定化できるアミノ基の量を増大させることが可能な新規なバイオチップ用基板及びその製造方法を提供すること。【解決手段】バイオチップ用基板は、金属基板と、該金属基板上に直接又はNiP層を介して固定化されたアミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー層又はカルボキシル基含有ポリマー層とを含む。バイオチップ用基板の製造方法は、金属基板上に直接、又は該金属基板上に形成されたNiP層上に、アミノ基又はカルボキシル基含有ポリマー又はカルボキシル基含有ポリマーを塗布し、紫外線照射することを含む。【選択図】図１