生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_セリシンの抽出・精製方法 |
| 出願番号： | 2013082512 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C07K 1/14,A61K 8/64,D01B 7/00,C07K 14/435 |
特許情報キャッシュ
鈴木 幸一 瓜田 章二 苅間澤 真弓 JP 2014205621 公開特許公報(A) 20141030 2013082512 20130410 セリシンの抽出・精製方法 国立大学法人岩手大学 504165591 西澤 利夫 100093230 鈴木 幸一 瓜田 章二 苅間澤 真弓 C07K 1/14 20060101AFI20141003BHJP A61K 8/64 20060101ALI20141003BHJP D01B 7/00 20060101ALI20141003BHJP C07K 14/435 20060101ALN20141003BHJP JPC07K1/14A61K8/64D01B7/00 302ZC07K14/435 6 1 ＯＬ 10 4C083 4H045 4C083AD41 4C083AD411 4C083FF01 4H045AA20 4H045CA51 4H045EA01 4H045EA20 4H045EA60 4H045FA71 4H045GA01 本発明は、カイコ（家蚕）の繭糸または繭層からセリシンを抽出・精製する方法に関する。 従来より、カイコ（家蚕）のみならず野蚕を含めた絹糸昆虫が産生する絹糸から絹タンパク質を抽出して、例えば、健康増進のための飲食品やサプリメント、化粧料、医薬品材料などへ応用する試みがなされており、なかでも、近年、カイコ（家蚕）の絹タンパク質であるセリシンの機能性への関心が高まっている。 セリシンは、繊維状硬タンパク質フィブロインを被った膠質の状態で存在し、フィブロインに比べてその取得と利用が必ずしも容易ではないことが知られているが、カイコ（家蚕）からのセリシンの抽出方法としては、例えば、特許文献１、２の方法などが提案されている。 特許文献１では、マルセル石鹸などの界面活性剤を含むｐＨ11.5以上の強アルカリ水溶液（1.5％珪素ソーダ）で、カイコ（家蚕）の繭を温度95℃以上で3〜4時間に亘って精練処理してセリシンを抽出する方法が記載されている。 特許文献２では、絹糸昆虫からの繭糸などを、2〜8モル/l濃度の尿素水溶液に浸漬し、100℃〜130℃以下の温度で数分〜数時間かけてセリシンの抽出を行う方法が記載されている。特開平４−２０２４３５号公報 しかしながら、特許文献１、２の方法のように、カイコ（家蚕）の繭を高温のアルカリ水溶液で長時間処理した場合には、絹タンパク質への加水分解による変質、分解などの影響が大きい。このため、従来の方法の場合には、取得すべきセリシン由来成分の損失や、フィブロイン由来成分の混入などに起因して、組成（アミノ酸組成）や分子量が不安定となり、抽出されたセリシンの特異的機能を特定することは必ずしも容易でないという問題があった。 本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、セリシン由来成分の損失やフィブロイン由来成分の混入を抑制し、カイコ由来の繭糸または繭層から安定かつ効率的にセリシンを抽出・精製する方法を提供することを課題としている。 上記の課題を解決するために、本発明のセリシンの抽出・精製方法は、以下の工程：（１）カイコ由来の繭糸または繭層を、90℃〜98℃かつ0.05〜0.07Ｍのアルカリ溶液に浸漬して、セリシンを含む精練液を得る工程、および（２）前記精練液を透析してセリシン溶液を得る工程を含むことを特徴としている。 このセリシンの抽出・精製方法では、精練工程において、繭糸または繭層をアルカリ溶液へ浸漬する時間は、1〜3分間であることが好ましい。 このセリシンの抽出・精製方法では、精練工程における繭糸または繭層と、アルカリ溶液との浴比は、1：25〜1：100であることがより好ましい。 このセリシンの抽出・精製方法では、精練工程におけるアルカリ溶液は、NaOHまたはKOHであることがより好ましい。 本発明のセリシンは、前記セリシンの抽出・精製方法によって得られることを特徴としている。 本発明の化粧料は、前記セリシンを含むことを特徴としている。 本発明の方法によれば、セリシン由来成分の損失やフィブロイン由来成分の混入を抑制することができ、カイコ由来の絹繊維から安定かつ効率的にセリシンを抽出・精製する。本発明のセリシン抽出・精製方法の一実施形態を例示したフローチャートである。実施例１で得られたセリシンのSDS−PAGE電気泳動（銀染色）の結果を示す図である。セリシンパウダー溶液の吸光度を示す図である。 本発明のセリシン抽出・精製方法の原料として使用される繭糸または繭層には、カイコガ科（Bombycidae）に属するカイコ（家蚕B.mori）が吐糸したものが使用される。カイコは、桑葉育ないし人工飼料育されたものを問わない。また、カイコが吐糸した繭糸は、例えば、カイコが蛹化の前に形成した俵形および楕円球状の繭層を切開し、この繭層を適宜に細切したものを使用することができる。 以下、本発明のセリシン抽出・精製方法の一実施形態について説明する。 本発明のセリシン抽出・精製方法は、（１）カイコ由来の繭糸または繭層を、90℃〜98℃かつ0.05〜0.07Ｍのアルカリ溶液に浸漬して、セリシンを含む精練液を得る精練工程、および（２）前記精練液を透析する工程を含む。 本発明のセリシン抽出・精製方法では、好ましくは、精練工程の前にカイコ由来の繭糸または繭層を洗浄する工程を含むことができる。 繭糸または繭層の洗浄は、例えば、取得したカイコ由来の繭糸または繭層を、40℃〜80℃程度の温水（純水）に2〜10分間程度浸漬して行うことができる。この際、繭糸または繭層と温水との浴比は、1：50〜1：200程度の範囲を好ましく例示することができる。なお、本発明において、「浴比」とは、繭糸または繭層の重量と、液体（水、アルカリ溶液）の重量（液量）との比をいう。 洗浄工程によって、繭糸または繭層に付着していた夾雑物や細菌類などを除去することができる。洗浄工程によって予め夾雑物などを除去することで、セリシン抽出物に不純物が混入することが抑制される。 次に、精練工程では、適宜洗浄した絹繊維を、90℃〜98℃かつ0.05〜0.07Ｍのアルカリ溶液に浸漬してセリシンを抽出する。 アルカリ溶液としては、例えば、強アルカリのNaOH、KOHおよびLiOHなどを好ましく例示することができるが、なかでもNaOH、KOHが好ましく、特に好ましくはNaOHである。高価な溶剤を使用する必要がないことから、コストを低く抑えることができる。 アルカリ溶液の濃度が0.05〜0.07Ｍの範囲であると、セリシン由来成分の損失やフィブロイン由来成分の混入を抑制することができ、安定かつ効率的にセリシンを抽出することができる。アルカリ溶液の濃度が0.05Ｍより小さい場合には、セリシンの抽出が不十分であったり、セリシンが溶液中で溶解しない状態になったりする。一方、例えば、アルカリ溶液の濃度が0.07Ｍより大きい場合には、過度にセリシンが分解されて特異的機能の解析が難しくなるとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する恐れがある。 さらに、アルカリ溶液の温度が90℃以下の場合には効率的にセリシンを抽出することが難しく、一方、アルカリ溶液の温度が98℃以上の場合には、過度にセリシンが分解されて特異的機能の解析が難しくなるとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する恐れがある。 また、繭糸または繭層とアルカリ溶液の好ましい浴比は、1：25〜1：100程度の範囲であり、より好ましくは、浴比1：50程度である。浴比がこの範囲であると、効果的にセリシンを抽出することができる。 そして、精練工程において、絹繊維をアルカリ溶液へ浸漬する時間は、およそ1〜10分程度とすることができる。精練の時間が1分未満であるとセリシンの抽出が不十分になる恐れがあり、10分を超えて精練を行うと過度にセリシンが分解されて、セリシンの特異的機能を解析することが難しくなるとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する恐れがある。 本発明の方法では、精練工程において、従来全く検討されてこなかった強アルカリ剤による低濃度（0.05〜0.07Ｍ）のアルカリ溶液が使用されており、これによって、高温での精練時間が大幅に短縮されるため、セリシン由来の成分が損なわれる恐れがない。 さらに、絹繊維をアルカリ溶液へ浸漬する時間は、1〜3分であることがより好ましい。浴比やアルカリ溶液の濃度にもよるが、通常、3分を超えて精練した場合にもセリシンの収量は増加することはなく、セリシンの分解が進むとともに、精練液にフィブロイン由来の成分が混入する可能性を高めてしまう。 次に、抽出残渣が残存する精練液を、例えばガラスフィルターなどを用いて濾過し、抽出残渣と精練液とに分別する。この精練液には高分子量のセリシンが含まれ、一方、抽出残渣にはフィブロインが含まれている。 そして、この精練液を透析してセリシン溶液を得る（透析工程）。なお、この透析工程の前に、精練液を濾紙によって濾過するなどの処理を行ってもよい。 精練液の透析の方法は特に限定されないが、簡便かつ確実な方法として、例えば水による透析を例示することができる。具体的には、例えば、精練液を市販の透析用セルロースチューブに充填し、5〜25℃程度の流水あるいは純水による透析を所定の時間行うことができる。また、透析は、各種の有機酸でｐＨを調整して行うこともできる。さらに、市販の装置を用いた電気透析を採用することもできる。なお、透析後には、適宜、濾過処理を行うことも考慮される。透析によってセリシン由来の成分が流出することはなく、例えば、繭糸または繭層に含まれる色素、脂肪酸および無機成分などの低分子が取り除かれたセリシン溶液を得ることができる。このセリシン溶液中に含まれるセリシンは、32〜44kDa程度の分子量を有している。 本発明の方法では、特に精練工程において、繭糸または繭層が90℃〜98℃かつ0.05〜0.07Ｍのアルカリ溶液によって極めて短時間で精練処理されている。このため、精練液を透析したセリシン溶液には、フィブロイン由来の成分が含まれず、セリシンが分解され過ぎることなく、そのアミノ酸組成や分子量が安定している。このため、抽出されたセリシンは、特異的機能を解析するための試料として優れている。 そして、このセリシン溶液を凍結乾燥することで、精製されたセリシンの可溶性パウダーを得ることもでき、飲食品、サプリメント、化粧料、医薬品材料などに利用することができる。また、例えば、セリシン溶液からの可溶性パウダーは、セリシンの各種の機能解析などに好適に利用することができる。 具体的には、例えば、本発明の方法で得られたセリシン（セリシンパウダー）を含む化粧料の場合には、水（精製水、温泉水、深層水等）、油剤、界面活性剤、金属セッケン、保湿剤、ゲル化剤、アルコール類、水溶性高分子、粉体、pH調整剤、皮膜形成剤、樹脂、紫外線防御剤、包接化合物、抗菌剤、香料、消臭剤、塩類、清涼剤、動物・微生物由来抽出物、植物抽出物、血行促進剤、収歛剤、抗脂漏剤、活性酸素消去剤、細胞賦活剤、角質溶解剤、酵素、ホルモン類、ビタミン類などを配合することができる。 本発明のセリシン抽出・精製方法は、以上の形態に限定されるものではない。 以下、実施例により本発明のセリシン抽出・精製方法をさらに詳しく説明するが、本発明のセリシン抽出・精製方法は、以下の実施例に限定されるものではない。 ＜実施例１＞カイコ由来セリシンの抽出、精製 カイコ由来セリシンの抽出、精製の工程を図１に沿って説明する。図１は、本発明のセリシン抽出・精製方法の一実施形態を例示したフローチャートである。 材料は、カイコの生繭を切開して得た繭層を使用した。この繭層を、65℃の純水（浴比1：100）で3分間洗浄して、夾雑物や細菌類を除去した。 次に、洗浄した繭層を、98℃、0.06ＭのNaOH（浴比1：50）に3分間浸漬してセリシンを抽出し、精練液を得た。 さらに、この精練液を17Ｇガラスフィルターで沈殿物が混入しないように濾過し、抽出残渣（フィブロイン）と精練液とに分別し、さらに、この精練液を常温（25℃）で濾紙による濾過を行った。 そして、得られた精練液を透析用セルロースチューブ（SPECTRUM Laboratories社製）に充填し、20℃で流水透析2〜3日、純水透析1日行った後、再度、濾紙による濾過を行ってカイコ由来のセリシン溶液を得た。 このセリシン溶液を凍結乾燥して、セリシンの可溶性パウダー（セリシンパウダー）とし、以下の分析に供した。 ＜実施例２＞カイコ由来セリシンの分析（１）SDS−PAGE電気泳動解析 実施例１で得たセリシンの可溶性パウダーを試料として、tricine-SDSポリアクリルアミド電気泳動を行った。具体的には、セリシンの可溶性パウダーを16％（T）、3％（C）の分離ゲル上に濃縮ゲルを重層した垂直型スラブゲルを用いて分離した。陰極槽は、0.2M Tris, 0.1M Tricine, 0.1%(W/V) SDSで、陽極槽は、0.2M Tris-HCl buffer(pH8.9)で、泳動用試料（10μl）は、等量のTricine SDS−PAGE用sample buffer[50ｍM trice HCl(pH6.8), 4%(w/v)SDS, 12%(w/v)glycerol, 2%(v/v)β-mercaptethanol, 0.01%(w/v)Serva blue G] を加え、3分間熱処理したものを用いた。分子量マーカーには、Proctin Marker Kit(M.W.Range 97,000-14,400 GEヘルスケアバイオサイエンス社)を使用した。泳動は、分離ゲルに入るまでは30V、その後分離ゲルの下端に達するまでは、80Vの低電圧で通電した。泳動後のゲルは、銀染色による染色でタンパク質の検出を行った。銀染色は、Oakleyの方法を改良した銀染色法に従って行った（井上ら1986）。 結果を図２に示す。左レーンは、分子量マーカーであり、右レーンが実施例１で得たセリシンのバンドである。実施例１で得たセリシンでは、3ないし4成分の複数の高分子成分が確認され、セリシンが分解され過ぎることなく、セリシン由来成分の損失が抑制されていることが分かる。具体的には、44kDa、37kDaおよび32kDaに成分のバンドを認めることができる。したがって、実施例１で得たセリシンの可溶性パウダーは主に32kDa〜44kDaの分子量を有するセリシンパウダーであると特定できる。（２）アミノ酸組成分析 実施例１で得たセリシンの可溶性パウダーを6Nの塩酸1mlに溶解し、減圧封管した。封管したものを加水分解（110℃/24時間）を経て真空乾燥処理した後、Lithium citrate サンプルバッファー（pH2.2）で溶解し、孔径0.45μｍのフィルター（直径4mm, Millipore社）で濾過し、分析試料とした。分析試料は、アミノ酸アナライザー（JLC-500/v, 日本電子社）に注入してアミノ酸組成を測定した。 結果を表１に示す。 表１に示したように、実施例１で得たセリシンのアミノ酸組成は、セリンが最も多く30.8%、次いでアスパラギン酸の17.7%、グリシンの17.2%であり、カイコ(家蚕)セリシンである特徴をよく示している。一般的にセリシンのアミノ酸組成中最も多いアミノ酸はセリンの30〜35％で、次いでアスパラギン酸の13〜18％、さらにグリシンの12〜17％であることが知られているが（例えば、小松計一（1980）北条舒正編 続絹糸の構造,セリシンの化学と構造,pp379〜415,信州大学繊維学部）、その組成傾向は本発明の方法（実施例１）で得たセリシンの組成でも維持されている。厳密には、品種や産地、年度および蚕期によってその組成は異なり、また当然に繭糸および繭層の練減率も異なるが、組成アミノ酸が多い数値傾向が同傾向または近い数値が認められることから、測定されたアミノ酸はセリシン由来のものであると判断できる。 したがって、本発明の方法（実施例１）によれば、セリシン由来成分の損失やフィブロイン由来成分の混入を抑制し、カイコ由来の繭糸または繭層から安定かつ効率的にセリシンを抽出・精製できることが確認された。＜実施例３＞精練時間の検討 精練時間を変更した場合のセリシン溶液への影響について検討した。 具体的には、実施例１と同様の抽出・精製方法において、精練処理の時間（98℃、0.06ＭのNaOHに浸漬する時間）を1分、3分（実施例１と同じ）、5分、10分と変えた場合におけるセリシンの収率と練減率の変化を調べた。 練減率は、以下の式、練減率（％）＝（繭層重量−精練後の残渣重量）／繭層重量×１００で算出した。また、セリシンの収率は、以下の式、収率（％）＝回収セリシン量／練減量×１００で算出した。 結果を表２に示す。 表２に示したように、処理の精練時間が進むにつれて練減率は増加しているが、収率が低下している。このことについては、その処理時間が進むにつれて、十分精練されてセリシンは溶液中に分散するが、同時に加水分解や低分子化も進み、このため透析中に透析膜から流亡し収率は低下したものと推量される。 したがって、例えば、セリシンの特異的機能を解析することを目的とする場合、精練時間は、好ましくは1〜3分程度、より好ましくは3分程度であることが確認された。＜実施例４＞吸光度の測定 実施例１で得たセリシンパウダー0.1mgを純水1mlに溶解し、この水溶液を吸光度計(日本分光株式会社)により吸収量を波長スペクトルとして求めた。 結果を図３に示す。 図３に示したように、セリシンの構成アミノ酸であるチロシンとフェニルアラニンの存在から波長280nmに吸収のピークを与え、310nm付近まで急峻に低下するが、それ以降の500nm付近まではなだらかに低下していることが確認された。すなわち、実施例１の抽出・精製方法によって得られたセリシンパウダーは、紫外部の短波長（UV CおよびUV B）領 域での吸収は高く、UV Aの領域では低くはなるが、その吸収は500nm付近まで達し、その吸収波長領域がかなり広いことが確認された。 したがって、実施例１の抽出・精製方法によって得られたセリシンパウダーは、例えば化粧料の成分として利用することで、化粧料にUV吸収性を付与することができる。 以下の工程：（１）カイコ由来の繭糸または繭層を、90℃〜98℃かつ0.05〜0.07Ｍのアルカリ溶液に浸漬して、セリシンを含む精練液を得る工程、および（２）前記精練液を透析してセリシン溶液を得る工程、を含むことを特徴とするセリシンの抽出・精製方法。 精練工程において、繭糸または繭層をアルカリ溶液へ浸漬する時間は、1〜3分間であることを特徴とする請求項１のセリシンの抽出・精製方法。 精練工程における繭糸または繭層と、アルカリ溶液との浴比は、1：25〜1：100であることを特徴とする請求項１または２のセリシンの抽出・精製方法。 精練工程におけるアルカリ溶液は、NaOHまたはKOHであることを特徴とする請求項１から３のいずれかのセリシンの抽出・精製方法。 請求項１から４のいずれかのセリシンの抽出・精製方法によって得られたセリシン。 請求項５のセリシンを含む化粧料。 【課題】セリシン由来成分の損失やフィブロイン由来成分の混入を抑制し、カイコ由来の繭糸または繭層から安定かつ効率的にセリシンを抽出・精製する方法を提供すること。【解決手段】（１）カイコ由来の繭糸または繭層を、90℃〜98℃かつ0.05〜0.07Ｍのアルカリ溶液に浸漬して、セリシンを含む精練液を得る工程、および（２）前記精練液を透析してセリシン溶液を得る工程を含む抽出・精製方法とする。【選択図】図１