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| タイトル： | 特許公報(B2)_架橋ヒアルロン酸組成物及び自己架橋ヒアルロン酸粒子 |
| 出願番号： | 2012530678 |
| 年次： | 2015 |
| IPC分類： | A61K 31/728,A61K 9/08,A61P 19/02,C08B 37/08 |
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橋本 正道 守川 忠志 宮田 喜明 大野 昭男 高橋 啓 小笠原 大輔 藤井 健治 架間 晃明 竹田 茉利子 JP 5824455 特許公報(B2) 20151016 2012530678 20110823 架橋ヒアルロン酸組成物及び自己架橋ヒアルロン酸粒子 デンカ株式会社 000003296 長谷川 芳樹 100088155 清水 義憲 100128381 橋本 正道 守川 忠志 宮田 喜明 大野 昭男 高橋 啓 小笠原 大輔 藤井 健治 架間 晃明 竹田 茉利子 JP 2010186491 20100823 JP 2010186487 20100823 20151125 A61K 31/728 20060101AFI20151105BHJP A61K 9/08 20060101ALI20151105BHJP A61P 19/02 20060101ALI20151105BHJP C08B 37/08 20060101ALI20151105BHJP JPA61K31/728A61K9/08A61P19/02C08B37/08 Z Ａ６１Ｋ ３１／００− ３１／８０ Ｃ０８Ｂ １／００− ３７／１８ ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） 特開２００４−１４９５９９（ＪＰ，Ａ） 国際公開第２００４／０１６２７５（ＷＯ，Ａ１） 特開２００４−１８１１２１（ＪＰ，Ａ） 8 JP2011068978 20110823 WO2012026468 20120301 42 20140603 牧野 晃久 本発明は、架橋ヒアルロン酸組成物及びそれに用いられる自己架橋ヒアルロン酸粒子並びに当該架橋ヒアルロン酸組成物を含有する注射剤及びそれを収容するプレフィルドシリンジ製剤に関する。 ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は、優れた生体適合性及び粘弾性を示すことから、医用分野への展開が進んでいる。その一つとして、変形性膝関節症のための粘性補充剤として架橋されたヒアルロン酸を用いることが特許文献１に開示されている。特表２００８−５２６７４７号公報 しかし、変形性膝関節症の疾患関節部位にヒアルロン酸を注入する場合には、有効な治療効果を得るために数回〜１０回もの投与回数が必要となり、患者に大きな負担となっていた。 そこで、本発明の目的は、従来よりも投与回数を少なくした場合であっても、変形性膝関節症に対して充分な治療効果の得られる架橋ヒアルロン酸組成物及びそれに用いる自己架橋ヒアルロン酸粒子を提供することにある。 本発明は、平衡膨潤倍率が３〜１０倍の自己架橋ヒアルロン酸の粒子と、水系溶媒とを含有する架橋ヒアルロン酸組成物であって、架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸の粒子の乾燥重量は３〜８ｗ／ｖ％である、架橋ヒアルロン酸組成物を提供する。 従来より知られているヒアルロン酸又は架橋ヒアルロン酸を用いて、変形性膝関節症の注射剤を製造するに当たり、投与回数を低減しようとして高濃度（例えば乾燥重量で３〜８ｗ／ｖ％）にすると、粘度が急激に上昇し、注射器（シリンジ）から患部へ注入することが非常に困難であった。一方で、注射器からの注入を容易にしようとすれば、ヒアルロン酸又は架橋ヒアルロン酸の分子量や濃度を低下させざるを得ず、少ない投与回数では充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができなかった。 本発明では、平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である自己架橋ヒアルロン酸の粒子を用いることにより、高濃度にしても粘度が急激に上昇しないことから、架橋ヒアルロン酸組成物を注射剤に適用した場合に、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 本発明の架橋ヒアルロン酸組成物において、自己架橋ヒアルロン酸の粒子は、平均体積粒径が１０〜１００μｍであることが好ましい。平均体積粒径と平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である自己架橋ヒアルロン酸の粒子を用いることにより、高濃度にしても粘度が急激に上昇しないことから、架橋ヒアルロン酸組成物を注射剤に適用した場合に、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 平均体積粒径と平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である本発明の架橋ヒアルロン酸組成物においては、自己架橋ヒアルロン酸の粒子は、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％であることが好ましい。また、自己架橋ヒアルロン酸粒子は生体内の条件で容易に加水分解するエステル結合によって架橋した自己架橋ヒアルロン酸から成っている。エステル結合が加水分解されると分子状のヒアルロン酸が生成する。加水分解されて生成するヒアルロン酸の分子量（一次分子量と定義し、粘度平均分子量で表される）は、その治療効果から８０万以上であることが好ましい。 また、本発明の架橋ヒアルロン酸組成物においては、自己架橋ヒアルロン酸の粒子は、エチルエステル量が０．０５ｍｏｌ％以下であり、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％であることが好ましい。エチルエステル量、自己架橋エステル化度及び平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である自己架橋ヒアルロン酸の粒子を用いることにより、高濃度にしても粘度が急激に上昇しないことから、架橋ヒアルロン酸組成物を注射剤に適用した場合に、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 エチルエステル量、自己架橋エステル化度及び平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である本発明の架橋ヒアルロン酸組成物において、自己架橋ヒアルロン酸粒子は生体内の条件で容易に加水分解するエステル結合によって架橋した自己架橋ヒアルロン酸から成っている。エステル結合が加水分解されると分子状のヒアルロン酸が生成する。加水分解されて生成するヒアルロン酸の分子量（一次分子量と定義し、粘度平均分子量で表される）は、その治療効果から８０万以上であることが好ましい。 自己架橋ヒアルロン酸の粒子として、平均体積粒径１０〜１００μｍ、平衡膨潤倍率３〜１０倍、一次分子量８０万以上、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％のものを用いること、又は、自己架橋ヒアルロン酸の粒子として、エチルエステル量０．０５ｍｏｌ％以下、自己架橋エステル化度０．０５〜０．５０ｍｏｌ％、平衡膨潤倍率３〜１０倍、一次分子量が８０万以上のものを用いることにより、投与回数の低減及び変形性膝関節症の治療効果がより顕著になる。例えば、ｐＨ７．０±０．５、温度３６．０±２．０℃の１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水中に浸漬することにより、３０日以内で架橋ヒアルロン酸が全量溶解でき、この時充分に高分子量のヒアルロン酸が生成させることができ、これにより高い治療効果を得ることができる。また、コーンプレートを使う回転粘度測定法により、２５±２℃、せん断速度５０Ｓ−１において測定した粘度が、３００ｍＰａ・ｓ以下にすることができるため、注射剤としての注入が容易となる。 本発明は、上記の架橋ヒアルロン酸組成物を含有する注射剤を提供する。従来のヒアルロン酸ベースの注射剤では、上述のとおり、ヒアルロン酸を３〜８ｗ／ｖ％といった高濃度にすると、粘度が急激に上昇し、注射器（シリンジ）から患部へ注入することが非常に困難であった。しかし、本発明に係る注射剤は、上記所定の物性を備えた自己架橋ヒアルロン酸の粒子を含む架橋ヒアルロン酸組成物を用いるため、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 本発明は、１回あたり１．２５ｍｇ／ｋｇ体重以上の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられる注射剤、又は、１回あたり７５ｍｇ以上の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられる注射剤を提供する。従来のヒアルロン酸ベースの注射剤では、上述のとおり、ヒアルロン酸が高濃度では粘度が上昇しシリンジから患部への注入が困難であった。そのため、充分な治療効果を生じる量のヒアルロン酸を１回で投与することができなかった。しかし、本発明に係る注射剤は、上記の物性を備えた自己架橋ヒアルロン酸の粒子を含む架橋ヒアルロン酸組成物を用いるため、１回あたり１．２５ｍｇ／ｋｇ体重以上又は１回あたり７５ｍｇ以上の自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられることができ、単回投与であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 本発明は上記注射剤を収容した、プレフィルドシリンジ製剤を提供する。従来のヒアルロン酸ベースの注射剤を収容したプレフィルドシリンジ製剤は、上述のとおりヒアルロン酸を高濃度（例えば３〜８ｗ／ｖ％）にすると、粘度が非常に高くなるため、シリンジから注射剤を患部へ注入することが困難であった。しかし、本発明に係るプレフィルドシリンジ製剤は、上記所定の物性を備えた自己架橋ヒアルロン酸の粒子を含む架橋ヒアルロン酸組成物を注射剤として注射筒内部に収容しているため、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 また、本発明は、平均体積粒径が１０〜１００μｍであり、平衡膨潤倍率が３〜１０倍である自己架橋ヒアルロン酸粒子を提供する。上記所定の物性を備えた自己架橋ヒアルロン酸粒子は、それを含有する架橋ヒアルロン酸組成物が注射剤に適用された場合に、３〜８ｗ／ｖ％といった高濃度にしても粘度が急激に上昇しないため、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 平均体積粒径と平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である本発明の自己架橋ヒアルロン酸粒子は、一次分子量が８０万以上であり、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％であることが好ましい。このような自己架橋ヒアルロン酸粒子を用いることにより、投与回数の低減及び変形性膝関節症の治療効果がより顕著になる。 また、本発明は、エチルエステル量０．０５ｍｏｌ％以下、自己架橋エステル化度０．０５〜０．５０ｍｏｌ％、平衡膨潤倍率３〜１０倍である自己架橋ヒアルロン酸粒子を提供する。上記所定の物性を備えた自己架橋ヒアルロン酸粒子は、それを含有する架橋ヒアルロン酸組成物が注射剤に適用された場合に、３〜８ｗ／ｖ％といった高濃度にしても粘度が急激に上昇しないため、少ない投与回数であっても、充分な変形性膝関節症の治療効果を得ることができる。 エチルエステル量、自己架橋エステル化度及び平衡膨潤倍率が上記所定範囲内である本発明の自己架橋ヒアルロン酸粒子は、一次分子量が８０万以上であることが好ましい。このような自己架橋ヒアルロン酸粒子を用いることにより、投与回数の低減及び変形性膝関節症の治療効果がより顕著になる。 本発明によれば、従来よりも投与回数を少なくした場合であっても、変形性膝関節症に対して充分な治療効果の得られる架橋ヒアルロン酸組成物及びそれに用いる自己架橋ヒアルロン酸粒子を提供することができる。本発明に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の製造に用いられる高速回転装置の概略構成図である。本発明の第１実施形態に係る架橋ヒアルロン酸組成物と、参考例であるヒアルロン酸製剤の注射針をつけたシリンジからの吐出圧を比較して示すグラフである。本発明の第１実施形態に係る架橋ヒアルロン酸組成物と、参考例であるヒアルロン酸製剤の疼痛抑制効果を比較して示すグラフである。第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の加熱時間に対する半減期、一次分子量の変化を示すグラフである。第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の加熱時間に対する平衡膨潤倍率の変化を示すグラフである。第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の加熱時間に対する架橋度の変化を示すグラフである。第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の架橋度に対する平衡膨潤倍率、半減期の変化を示すグラフである。第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の半減期に対するゲル分率到達日数の変化を示すグラフである。第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の架橋度に対するゲル分率到達日数の変化を示すグラフである。本発明の第２実施形態に係る架橋ヒアルロン酸組成物と、参考例であるヒアルロン酸製剤の注射針をつけたシリンジからの吐出圧を比較して示すグラフである。本発明の第２実施形態に係る架橋ヒアルロン酸組成物と、参考例であるヒアルロン酸製剤の疼痛抑制効果を比較して示すグラフである。第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の加熱時間に対する半減期、一次分子量の変化を示すグラフである。第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の加熱時間に対する平衡膨潤倍率の変化を示すグラフである。第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の加熱時間に対する架橋度の変化を示すグラフである。第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の架橋度に対する平衡膨潤倍率、半減期の変化を示すグラフである。第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の半減期に対するゲル分率到達日数の変化を示すグラフである。第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の架橋度に対するゲル分率到達日数の変化を示すグラフである。 以下、本発明の好適な実施の形態について説明する。 本発明の第１実施形態に係る架橋ヒアルロン酸組成物は、平均体積粒径が１０〜１００μｍであり、平衡膨潤倍率が３〜１０倍の自己架橋ヒアルロン酸粒子を含有する。 また、本発明の第２実施形態に係る架橋ヒアルロン酸組成物は、エチルエステル量が０．０５ｍｏｌ％以下であり、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％であって、平衡膨潤倍率が３〜１０倍の自己架橋ヒアルロン酸粒子を含有する。 本発明において自己架橋ヒアルロン酸粒子とは、自己架橋ヒアルロン酸が粒子化されたものである。ここで、自己架橋ヒアルロン酸とは、架橋構造を有するヒアルロン酸をいい、ヒアルロン酸分子中の一部のカルボキシル基が同一及び／又は別のヒアルロン酸分子の水酸基と自己エステル結合することによって、三次元網目構造を形成したものであり、化学的架橋剤や化学的修飾剤等を使用したものは含まない。 自己架橋ヒアルロン酸粒子における自己架橋エステル化度は、ヒアルロン酸の主鎖構造に由来する化学シフトのピークの積分値に対する、架橋エステルに由来する化学シフトのピークの積分値の割合をモル％で表したものである。 本発明の第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子における自己架橋エステル化度は、０．０５〜０．５０ｍｏｌ％が好ましい。より好ましくは０．０８〜０．３０ｍｏｌ％である。また、本発明の第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子における自己架橋エステル化度は、０．０５〜０．５０ｍｏｌ％である。好ましくは０．０８〜０．３０ｍｏｌ％である。 自己架橋エステル化度の測定は、あらかじめヒアルロン酸の主鎖構造を加水分解し、低分子量化する必要がある。ここで、自己架橋エステル結合の加水分解を抑制する必要があるため、自己架橋ヒアルロン酸の主鎖構造のみを選択的に加水分解するヒアルロン酸加水分解酵素による加水分解処理を行い、プロトン核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により化学シフトのピークの積分値を測定する。具体的には、アセチルメチル基（２．０５ｐｐｍ）相当のピークに対するエステル架橋部分（４．１８ｐｐｍ）相当のピークとの面積割合を自己架橋エステル化度として算出する。 本発明の第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子におけるエチルエステル量は、０．０５ｍｏｌ％以下であることが好ましい。また、本発明の第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子におけるエチルエステル量は、０．０５ｍｏｌ％以下である。エチルエステル量は、自己架橋ヒアルロン酸粒子に含まれるエチルエステルの含有量であり、残留溶媒としてヒアルロン酸原料に含まれるエタノールがエチルエステル化したものと考えられる。 しかし、エチルエステルは、自己エステル化を阻害すると考えられることから、ヒアルロン酸原料に含まれるエタノールを、凍結真空乾燥、８０℃通風、アセトン洗浄又は室温通風を２〜３日行い除去することによって、自己架橋ヒアルロン酸粒子におけるエチルエステル量を０．０５ｍｏｌ％以下にすることができる。ヒアルロン酸原料に含まれるエタノールの含有率は、ガスクロマトグラフィ／質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）を用いアセトニトリルにより抽出し測定できる。 自己架橋ヒアルロン酸粒子におけるエチルエステル量は、０．０３ｍｏｌ％以下がより好ましい。エチルエステル量は、自己架橋エステル化度と同様にＮＭＲにより測定することができる。 本発明において、ヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。 発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号)、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号)のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。 また、ヒアルロン酸は、そのアルカリ塩、例えばナトリウムやカリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。 自己架橋ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸濃度５質量％以上にする水、及びヒアルロン酸のカルボキシル基と等モル以上の酸成分とを共存させ、該共存状態を低温で保持することにより得られる。 ヒアルロン酸と共存させる酸は特に限定はされず、公知のいずれの酸も使用できるが、ヒアルロン酸よりも強い酸であることが好ましく、無機酸であることがより好ましい。さらに好ましくは、塩酸、硝酸、硫酸であり、その中でもハンドリング等に優れた硝酸が特に好ましい。 共存させる酸の量は特に限定されないが、ヒアルロン酸のカルボキシル基と等モル以上の酸成分の量とすることができる。 ヒアルロン酸と共存させる酸とは、ヒアルロン酸が全体の１５質量％以上、好ましくは、２０質量％以上、４０質量％以下で含まれるような量で保持することが好ましい。この保持は、−３０℃から２５℃の間の温度で、1時間から２０日間の間のいずれの期間でも行い得る。特に好ましくは、−２５℃から−５℃の間の温度にて、１日から１５日の間で、行うことができる。ヒアルロン酸と共存させる酸との混合は、共存させる酸にヒアルロン酸を全体の１５質量％以上、好ましくは２０質量％以上になるよう混練りし、共存させる酸を均一な状態にすることができる。さらにヒアルロン酸に共存させる酸を全体の１５質量％以上、好ましくは２０質量％以上になるよう含浸することができる。また低濃度で調整したヒアルロン酸の酸性水溶液を、ヒアルロン酸が、全体の１５質量％以上、好ましくは、２０質量％以上で含まれるように濃縮することができる。 本発明の第１実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は、１０〜１００μｍであり、好ましくは２０〜８０μｍであり、より好ましくは４０〜７０μｍである。また、本発明の第２実施形態に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は、１０〜１００μｍであることが好ましく、より好ましくは２０〜８０μｍであり、さらに好ましくは４０〜７０μｍである。自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径が膨潤時に上記範囲にあり、平衡膨潤倍率が３〜１０倍であると、架橋ヒアルロン酸組成物を高濃度にしても粘度が急激に上昇せず、ヒアルロン酸をより多く生体内に注入することが可能となる。 自己架橋ヒアルロン酸粒子は、さまざまな形状や大きさの粒子の集合体であることから、平均体積粒径は例えば、粒子の撮影時に投影される粒子像と等しい面積を持つ円の直径を円相当径として求める。例えば、約１０，０００個の粒子像を解析し、円相当径を直径とする球形粒子の体積を算出し、体積の小さいものから加算していった際に、１０，０００個の粒子体積総和の５０％に到達した点の粒子の円相当径を、平均体積粒径として採用することができる。具体的な測定は、例えば、粒度・形状分布測定器ＰＩＴＡ−１（商品名、セイシン企業製）を用いることができる。 自己架橋ヒアルロン酸粒子は、自己架橋ヒアルロン酸と水系溶媒との混合液を、５０℃未満で、せん断力を与えながらスリットを通過させて微粒子化させることによって、製造することができる。例えば、せん断力を与えながらスリットを通過させて微粒子化させる高速回転装置を用いて自己架橋ヒアルロン酸を破砕することによって、平均体積粒径が１０〜１００μｍとなるように微粒化することができる。また、破砕時に５０℃未満に冷却温度制御することは、製造される自己架橋ヒアルロン酸及び自己架橋ヒアルロン酸から溶出するヒアルロン酸の分子量を高く保つことができることから好ましい。 図１は、本発明に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子の製造に用いられる高速回転装置の概略構成図である。高速回転装置１０は、ローター１とスクリーン２を備え、ローター１とスクリーン２が逆方向に回転し、スクリーン２のスリット３を自己架橋ヒアルロン酸が通過することによって、自己架橋ヒアルロン酸粒子として微粒化する。このように、ローター１とスクリーン２が逆方向に回転することによって、大きなせん断力が得られ、微粒化された自己架橋ヒアルロン酸粒子を得ることができる。また、上記高速回転装置１０で自己架橋ヒアルロン酸を微粒化する際に、微粒子を構成するヒアルロン酸の主鎖をランダムに切断することがなく、効率よく破砕することができるため、高分子量でありながら低粘性を有する自己架橋ヒアルロン酸粒子を得ることができると推定される。 このような高速回転装置としては、例えば、クレアミクスダブルモーション（商品名、エムテクニック（株）製））が好ましい。本装置は、高速回転するローターとそれを囲むように配置されたスクリーンから構成され、高速回転するローター表面近傍における大きな速度勾配により、スクリーンの通液孔（スリット）を通過する自己架橋ヒアルロン酸の大きな粒子はせん断力を受け、微粒化される。 高速回転装置による微粒化の度合いは、ローターとスクリーンの回転速度と、処理時間によって表１のとおり規定される。ローターの回転速度に対するスクリーンの回転速度の割合は、５〜１０割が好ましく、特に９割が好ましい。 高圧型破砕装置としては、例えば、ナノマイザー（商品名、ナノマイザー（株）製）があるが、高圧・高速化された試料が高温になりやすく、自己架橋ヒアルロン酸の物性劣化度合いが大きいことから、本発明に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子のための微粒化処理に用いることは好ましくない。また、高速回転装置であっても、例えばＴ．Ｋ．ホモミック（商品名、プライミクス（株）製）のように、粒子の平均体積粒径を２００μｍ以下に微粒化できない装置は、本発明に係る自己架橋ヒアルロン酸粒子のための微粒化処理に用いることは好ましくない。 ここで、物性劣化とは、破砕前の自己架橋ヒアルロン酸の６０℃溶解性半減期や一次分子量などの物性が、破砕等の粒子化（微粒化）によって、破砕前の初期値よりも劣ることをいう。微粒化処理による自己架橋ヒアルロン酸粒子の物性は、できるだけ劣化しないことが好ましい。 なお、６０℃溶解性半減期とは、６０℃、ｐＨ７．４の条件下で自己架橋ヒアルロン酸の加熱を行った際に、開始時１００％としたゲル分率が５０％となるまでの時間をいう。例えば、６０℃溶解性半減期が、粒子化前の初期値は２５時間であるのに対し、粒子化後の半減期が２０時間である場合には、初期値の保持率は８０％となり、粒子化により２０％の物性劣化が生じたことになる。 ゲル分率とは、架橋ヒアルロン酸組成物中の全ヒアルロン酸量のうち、自己架橋ヒアルロン酸粒子として沈澱するヒアルロン酸量の割合を百分率で表した値であり、下記式（１）のとおり、エステル架橋が加水分解されヒアルロン酸として溶媒中に遊離・溶解したヒアルロン酸量を全ヒアルロン酸量から差し引いて算出することができる。 ゲル分率（％）＝（１−（溶解ヒアルロン酸量／全ヒアルロン酸量））×１００・・・（１） 本発明の自己架橋ヒアルロン酸粒子の一次分子量は、自己架橋ヒアルロン酸粒子のエステル結合が加水分解されて生成するヒアルロン酸の分子量であり、８０万以上であることが好ましく、８０万以上３００万までの範囲内であることがより好ましい。上記範囲内の一次分子量のものであれば、高分子量のものから加水分解処理等をして得た低分子量のものまで同様に好ましく使用できる。 上記一次分子量は、粘度平均分子量として表され、自己架橋ヒアルロン酸の架橋点を切断し溶解させヒアルロン酸とした後、ＧＰＣに検出器として示差屈折率計を使い、分子量分布のピークトップのリテンションタイムから算出することができる。リテンションタイムからの粘度平均分子量の算出には、粘度平均分子量が既知のヒアルロン酸の分子量分布のピークトップのリテンションタイムを用いて作成した検量線を用いる。検量線作成に用いるヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ヒアルロン酸を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解し、ウベローデ型粘度計を使用し３０℃に於ける流下時間を測定し、得られた還元粘度から極限粘度を算出し、Ｌａｕｒｅｎｔの式［η］＝０．０００３６×Ｍ０．７８（［η］：極限粘度、Ｍ：粘度平均分子量）を用いて算出する。 自己架橋ヒアルロン酸粒子の平衡膨潤倍率は、架橋ヒアルロン酸組成物の水系溶媒（緩衝液）を濾過によって除去した際の自己架橋ヒアルロン酸粒子の体積と、該自己架橋ヒアルロン酸粒子をさらに乾燥させた際の倍率により表される。 上記平衡膨潤倍率は、濾過によって架橋ヒアルロン酸組成物の水系溶媒（緩衝液）を除去した際の自己架橋ヒアルロン酸粒子の湿潤重量と、さらに乾燥させた際の自己架橋ヒアルロン酸粒子の重量の比（Ｑｗ）と密度を用いて、下記式（２）により算出することができる。 平衡膨潤倍率＝１＋（ρ／ρ０）×（Ｑｗ−１）・・・（２）（ρ：自己架橋ヒアルロン酸粒子の密度、ρ０：水系溶媒（緩衝液）の密度） 平衡膨潤倍率は、溶媒の塩濃度やｐＨ，温度、膨潤時間等に影響を受けるが、本発明においては、例えば、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）で、ＮａＣｌ濃度は０．９ｗｔ％のものを用いることができ、５℃で１日間膨潤させ、平衡膨潤状態に到達した後に、測定することができる。 濾過によって架橋ヒアルロン酸組成物の溶媒を除去する方法は特に限定されないが、例えば遠心式フィルターユニットを用いた遠心濾過方法、メンブランフィルターを用いた減圧濾過方法などを適宜用いることができる。 本発明の自己架橋ヒアルロン酸粒子の平衡膨潤倍率は、３〜１０倍であり、好ましくは４〜８倍である。自己架橋ヒアルロン酸粒子の平衡膨潤倍率が上記範囲であることによって、架橋ヒアルロン酸組成物に含有されたときに膨らみすぎて注射器から吐出できないという不都合が生じず、高濃度のヒアルロン酸を生体内に注入することが可能となる。 本発明の架橋ヒアルロン酸組成物において、架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸の粒子の乾燥重量は３〜８ｗ／ｖ％である。例えば３ｗ／ｖ％は、架橋ヒアルロン酸組成物における自己架橋ヒアルロン酸の粒子の濃度を示し、架橋ヒアルロン酸組成物１ｍｌを−２０℃、２００ｍＴｏｒｒ以下、２０時間以上の条件で乾燥すると、乾燥重量として自己架橋ヒアルロン酸の粒子３０ｍｇが得られることを意味する。架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸の粒子の乾燥重量は、好ましくは３〜７ｗ／ｖ％である。 自己架橋ヒアルロン酸の粒子の濃度は、例えば、以下のように定量することができる。まず架橋ヒアルロン酸懸濁液を蒸留水で希釈し、水酸化ナトリウム溶液を添加し、室温にて静置することで、自己架橋ヒアルロン酸のエステル架橋を加水分解し、自己架橋ヒアルロン酸を溶解する。次に、この溶液に塩酸を添加し中和した後、カルバゾール硫酸法によりグルクロン酸濃度を定量する。このグルクロン酸濃度と、既知濃度のヒアルロン酸を標準物質として、自己架橋ヒアルロン酸の粒子の濃度を算出することができる。 本発明の架橋ヒアルロン酸組成物において、ｐＨ７．０±０．５、温度３６．０±２．０℃の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中に浸漬すると３０日以内に自己架橋ヒアルロン酸が全量溶解し、粘度平均分子量が８０万以上のヒアルロン酸が生成される。このようなヒアルロン酸の生成条件は、典型的には、ｐＨ７．４、温度３７．０℃の１０ｍＭリン酸緩衝化生理的食塩水中での浸漬である。 架橋ヒアルロン酸組成物に含有される水系溶媒は、架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸の粒子の乾燥重量が３〜８ｗ／ｖ％となるように、架橋ヒアルロン酸組成物中に含有される溶媒である。水系溶媒としては、生理的に受容な水性媒質を有する水溶液であればよい。生理的に受容とは、関節治療剤が関節腔内に注入されたとき、水性媒質自身が好ましくない作用もしくは副作用、例えば、組織の膨潤または収縮、炎症等の原因とならないことを意味する。生理的に受容な水性媒質は、通常アルカリもしくはアルカリ土類金属の塩化物、硫酸塩、リン酸塩または重炭酸塩のような無機塩類、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化マグネシウム、及び対応するカリウム、カルシウム塩、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウムのような有機酸の塩、またはグルコース、マンノース、多価アルコールのような中性有機物質、例えばグリセリン、マンニトール等から選択される１つ以上の低分子量物質の水溶液である。 製剤は、その剤型に応じ、製剤学的に公知の手法により、適切な賦形剤；等張化剤；防腐剤；乳化剤；分散剤；安定化剤；溶解補助剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；対イオン（例えば、ナトリウム）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、などの医薬品添加物、ヒアルロン酸などと適宜混合することにより調剤することができる。等張性及び化学的安定性を増強するこのような物質は、使用された投薬量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性である。 本発明に係る架橋ヒアルロン酸組成物の保存安定性を示す指標として、ゲル分率到達日数を用いることができる。ゲル分率到達日数とは、架橋ヒアルロン酸組成物を一定の測定条件下で静置した場合に、徐々にヒアルロン酸が遊離し、ゲル分率が基準値に低下するまでの日数である。例えば、自己架橋ヒアルロン酸に水系溶媒を加え、一定濃度に調整した架橋ヒアルロン酸懸濁液を一定環境下で加熱し、所定のゲル分率（例えば９７％ゲル分率や９５％ゲル分率）に到達するまでの時間をゲル分率到達日数として求めることができる。 平衡沈降濃度とは、架橋ヒアルロン酸懸濁液を静置し、完全に自己架橋ヒアルロン酸粒子を沈降させた際の、沈澱中に含まれるヒアルロン酸濃度である。架橋ヒアルロン酸懸濁液において外力を加えない平衡状態では、平衡沈降濃度がヒアルロン酸濃度の上限とみなせる。すなわち、ヒアルロン酸濃度が平衡沈降濃度と等しい架橋ヒアルロン酸懸濁液とは、懸濁液全体が沈澱であり上清がなく、これ以上ヒアルロン酸濃度を増加させることはできないことを示す。 平衡沈降濃度は、懸濁状の架橋ヒアルロン酸組成物のヒアルロン酸濃度［Ｃ］、体積［Ｖ０］及び沈澱の体積［Ｖ］を測定し、下記式（３）を用いて求めることができる。 平衡沈降濃度＝Ｃ×（Ｖ０／Ｖ）・・・（３） 架橋ヒアルロン酸組成物の粘度は、２５±２℃、せん断速度５０Ｓ−１において、３００ｍＰａ・ｓ以下が好ましい。架橋ヒアルロン酸組成物の粘度が３００ｍＰａ・ｓ以下であることによって、注射剤として注射器を用いて生体内へ投入される際に、容易に注射することができ、患者の負担が軽減される。 架橋ヒアルロン酸組成物の粘度は、例えば、回転粘度測定法を用いることにより測定することができる。回転粘度測定法は、コーンプレート１．００９°（Ｄ＝４９．９３８ｍｍ）を用い、せん断速度５０Ｓ−１、２５℃にて行うことができる。 架橋ヒアルロン酸組成物の吐出圧は、内径０．４０ｍｍ、針の長さ２５ｍｍの２３Ｇの注射針をつけた内径０．４５ｃｍの注射器を用い、温度２５℃、注入速度５０ｍｍ／ｍｉｎにおいて、０．８Ｎ以下であることが好ましく、より好ましくは０．２〜０．８Ｎであり、さらに好ましくは０．２〜０．６Ｎである。吐出圧が上記範囲の架橋ヒアルロン酸組成物は、注射剤として注射器（シリンジ）を用いて生体内へ投入される際に、容易に注射することができ、患者の負担が軽減される。 架橋ヒアルロン酸組成物の吐出圧は、架橋ヒアルロン酸組成物を注射器に充填し、注射針をつけ、所定の速度により注射器（シリンジ）から押し出す際にかかる吐出圧を押し出し圧測定機により測定することができる。押し出し圧測定機としては、一般的な材料試験で用いられる静的圧縮試験機を用いることができる。 本発明の注射剤は、上述の架橋ヒアルロン酸組成物を含有する。本架橋ヒアルロン酸組成物を用いた注射剤は、粘度及び吐出圧が低いことから、生体内へ投入する際に注入しやすくなる。 本発明の注射剤は、１回あたり１．２５ｍｇ／ｋｇ体重以上、又は１回あたり７５ｍｇ以上の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられることが好ましい。従来より用いられているヒアルロン酸関節製剤は、ヒアルロン酸濃度が１ｗ／ｖ％程度であり、１回あたりの投与量は約２５ｍｇであるが、本発明に係る注射剤は、上記所定の物性を備えた自己架橋ヒアルロン酸の粒子を含む架橋ヒアルロン酸組成物を用いるため、３ｗ／ｖ％以上の濃度にすることができるため、１回あたり７５ｍｇ以上の自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられることができる。また、人間の平均的な体重を６０ｋｇとすると、１回あたり１．２５ｍｇ／ｋｇ体重以上の自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられることができる。 上記注射剤は、好ましくは、１回あたり１．７ｍｇ／ｋｇ体重以上、又は１回あたり１００ｍｇ以上の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられ、より好ましくは、１回あたり２．０ｍｇ／ｋｇ体重以上、又は１回あたり１２０ｍｇ以上の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられる。また、上限値としては、１回あたり４．２ｍｇ／ｋｇ体重以下、又は１回あたり２５０ｍｇ以下の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられ、より好ましくは、１回あたり３．３ｍｇ／ｋｇ体重以下、又は１回あたり２００ｍｇ以下の上記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられる。 本発明のプレフィルドシリンジ製剤は、注射筒内部に上記注射剤を収容しており、上述のとおり本架橋ヒアルロン酸組成物を用いた注射剤は、粘度及び吐出圧が低いことから、高分子量の自己架橋ヒアルロン酸を容易に生体内へ注入することができる。 本発明の架橋ヒアルロン酸組成物は、任意の適当な投与経路で、生体に投与され得る。非経口でなされることが好ましく、注射剤として調製されることが好ましい。本発明による架橋ヒアルロン酸組成物をウサギの関節に注射剤として投与すると、生体中で粘度平均分子量が８０万以上のヒアルロン酸を生成することが確認され、本発明による自己架橋ヒアルロン酸は、生体内のｐＨや温度により架橋点が切断され、関節内にヒアルロン酸が生成されると考えられる。 本発明の架橋ヒアルロン酸組成物の投与は、非経口でなされる場合、筋肉内、皮下などにも行うことができ、特に好ましくは関節腔内などの組織に直接行うことができる。 処方及び投与のための技術は、例えば、日本薬局方の最新版及び最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）の最終版に記載されている。 本発明の架橋ヒアルロン酸組成物は、ヒアルロン酸が意図する目的を達成するのに有効な量で含有される薬剤とすることができ、「治療的有効量」又は「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識され、薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。治療的有効用量の決定は十分に当業者に知られている。 治療的有効量とは、投与により疾患の状態を軽減する薬剤の量をいう。治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。用量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＬＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、及び投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、複合体の投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する複合体の種類等により適宜選択される。 本発明の自己架橋ヒアルロン酸粒子、架橋ヒアルロン酸組成物は、変形性膝関節症以外にも、一般の生体内分解性医用材料及びヒアルロン酸が用いられる分野であれば特に制限なく使用することができる。例えば、薬理活性物質の担体、創傷被覆剤、組織置換型生体組織修復剤、癒着防止剤、止血剤、人工細胞外マトリクス、診断・治療に用いる医療器具・医療用具等の生物医学的製品又は医薬組成物への使用が挙げられる。 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。（実施例１（第１実施形態））＜自己架橋ヒアルロン酸の合成＞ ２Ｎの硝酸７５ｇを自公転型混練り装置(プライミクス製)に入れ、−１０℃に冷却し、シャーベット状の硝酸凍結物を得た。硝酸凍結物に粘度平均分子量２２０万のヒアルロン酸ナトリウムの粉末２２．５ｇ（水分含量１０％）を投入し、−１０℃、１００ｒｐｍで均一なゴム状になるまで１時間練り混ぜた（ヒアルロン酸ナトリウム２０．８質量％）。 このヒアルロン酸と硝酸の混合物を−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１０日後、５℃の純水１Ｌに投入し、１時間おきに純水を交換することを２回繰り返した。さらに５℃、５０ｍＭのリン酸緩衝液１Ｌに投入し、１時間おきに５０ｍＭのリン酸緩衝液を交換することを５回繰り返し、硝酸が完全に無くなるまで中和洗浄を行い、自己架橋ヒアルロン酸を得た。＜自己架橋ヒアルロン酸の粒子化＞ 上記のとおり得られた自己架橋ヒアルロン酸を中和後３０分間静置し、上清をデカンテーションで除き、沈降した自己架橋ヒアルロン酸に対して、９倍の重量の５０ｍＭリン酸緩衝液を加えた。次に、この架橋ヒアルロン酸懸濁液を高速回転装置（製品名：クレアミクスダブルモーション、エムテクニック（株）製）に投入し、装置のローターを順方向２０，０００ｒｐｍ、スクリーンを逆方向に１８，０００ｒｐｍで回転させ、５０℃未満になるよう冷却しながら１５分間微粒化した。ローターは後退角度０度ローターを使用し、スクリーン上に存在するスリットの巾が１．０ｍｍのものを使用した。 得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の粒子径について、粒度・形状分布測定器ＰＩＴＡ−１（セイシン企業製）を用い定量した。前処理として自己架橋ヒアルロン酸をメチレンブルーにより染色（染色液濃度：１ｗ／ｖ％、染色時間：１分以上）した。ＰＩＴＡ−１の測定条件としては、キャリア液は蒸留水を用い、測定粒子数は１０，０００個、対物レンズ４倍で測定した。その結果、得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は６５μｍだった。（実施例２） 実施例１と同様に自己架橋ヒアルロン酸を合成し、得られた自己架橋ヒアルロン酸について、処理時間を３０分とした以外は、実施例１と同様に粒子化させた。その結果、得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は５２μｍだった。（実施例３） 実施例１と同様に自己架橋ヒアルロン酸を合成し、得られた自己架橋ヒアルロン酸について、処理時間を１２０分とした以外は、実施例１と同様に粒子化させた。その結果、得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は４１μｍだった。（比較例１） 実施例１で得た自己架橋ヒアルロン酸粒子を、高圧型破砕装置（製品名：ナノマイザー、ナノマイザー（株）製）を用いて破砕した。装置破砕部にはφ１００μmの衝突型ジェネレーターを取り付け、自己架橋ヒアルロン酸粒子が直ちに室温以下となるように冷却しながら、２００ＭＰａで３回処理した。この自己架橋ヒアルロン酸粒子の粒子径を、レーザー回折・散乱式粒度分布計（製品名：ＳＡＬＤ−７０００、島津製作所製）を用いて測定した。測定条件として、試料の屈折率を１．３００とし、分散媒には１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を使用した。その結果、得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は５μｍだったが、収率が非常に低く実用的でなかった。（比較例２） また、上述の自己架橋ヒアルロン酸の合成方法に従って調製した自己架橋ヒアルロン酸を用い、中和後３０分間静置し、上清をデカンテーションで除き、沈降した自己架橋ヒアルロン酸に対して、９倍の重量の５０ｍＭリン酸緩衝液を加えた。次に、架橋ヒアルロン酸懸濁液を高速破砕装置（製品名：Ｔ．Ｋ．ホモミックス、プライミクス（株）製）に投入し、ローターを１６，０００ｒｐｍとし、５０℃未満になるよう冷却しながら６０分間破砕した。この自己架橋ヒアルロン酸粒子の粒子径について、粒度・形状分布測定器ＰＩＴＡ−１（セイシン企業製）を用いて定量したが、大粒子混在のため測定できなかった。そのため、開き目０．２ｍｍのふるいを用いて分級したところ、重量ベースで９０％以上ふるい上に残留したため、平均体積粒径は２００μｍ以上とした。＜溶解性半減期の測定＞ 上記で得られた実施例１〜３及び比較例１〜２の自己架橋ヒアルロン酸粒子について、溶解性半減期を測定した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を用いて、６０℃環境で加熱を行い、５時間間隔でサンプル採取した。採取したサンプルを希釈し、遠心分離により上清と沈殿部に分け、それぞれの部分のヒアルロン酸濃度を測定し、ゲル分率を算出した。加熱時間に対するゲル分率の挙動を読み取り、ゲル分率５０％に到達する加熱時間を求めた。＜粘度平均分子量＞ 生理的食塩水に１０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化食塩水を調整した。このリン酸緩衝化生理的食塩水１００ｍｌに対して実施例１〜３及び比較例１〜２の自己架橋ヒアルロン酸粒子を添加し、自己架橋ヒアルロン酸が完全に溶解するまで３０日間、３７．０℃で浸漬した。 リン酸緩衝化生理的食塩水中に溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量は、上澄を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、ＧＰＣ装置に０．１ｍｌ注入して測定した。ヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ＧＰＣ装置の検出器として示差屈折率計を使い、分子量分布のピークトップのリテンションタイムから算出した。ＧＰＣ装置は、ＧＰＣカラムとして昭和電工社製ＳＢ８０６ＨＱを１本、示差屈折率検出器としてＳｈｏｄｅｘ社製ＲＩ−７１Ｓを使用して、溶媒硝酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分で測定した。リテンションタイムからの粘度平均分子量の算出には、粘度平均分子量が既知のヒアルロン酸の分子量分布のピークトップのリテンションタイムを用いて作成した検量線を用いた。検量線作成に用いるヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ヒアルロン酸を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解し、ウベローデ型粘度計を使用し３０℃に於ける０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液の流下時間（ｔ０）及び試料溶液の流下時間（ｔ）を測定し、ｔ０、ｔより得られた還元粘度ηｒｅｄから時間０に於ける極限粘度を算出し、Ｌａｕｒｅｎｔの式［η］＝０．０００３６×Ｍ０．７８（［η］：極限粘度、Ｍ：粘度平均分子量）を用いて算出した。 実施例１〜３及び比較例１〜２の測定結果を表２に示す。 実施例１の自己架橋ヒアルロン酸粒子は、処理後の溶解性半減期が２５時間、粘度平均分子量が１７０万であり、処理前からの保持率がそれぞれ１００％と、粒子化による物性劣化が生じなかった。また、実施例２及び３の自己架橋ヒアルロン酸粒子も、粒子化による物性劣化はほとんど生じなかった。一方、比較例１の自己架橋ヒアルロン酸粒子は、粒子化後の溶解性半減期が１８時間、粘度平均分子量が１３０万であり、粒子化前からの保持率が６９％、７６％と、粒子化による物性劣化が生じ、また収率が非常に低く実用的でなかった。＜架橋ヒアルロン酸組成物の調製＞（実施例４） 実施例１で得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子を、５℃、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に投入し、一時間おきに１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を交換することを２回繰り返した。この架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸粒子の乾燥重量（濃度）が６ｗ／ｖ％になるように以下のように調整した。 自己架橋ヒアルロン酸の濃度の定量は、架橋ヒアルロン酸組成物５０ｍｇを蒸留水１．５５ｍｌで希釈し、そこに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を０．２ｍｌ添加し、室温にて３０分静置することで、自己架橋ヒアルロン酸のエステル架橋を加水分解し、自己架橋ヒアルロン酸を溶解した。さらに１Ｎ塩酸０．２ｍｌを添加し、中和した後、カルバゾール硫酸法により、既知濃度のヒアルロン酸（粘度平均分子量１９０万）を標準物質として、自己架橋ヒアルロン酸の濃度を計算した。この定量結果を基に、自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％となるように調整し、架橋ヒアルロン酸組成物を得た。（実施例５） 架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する自己架橋ヒアルロン酸粒子の乾燥重量が３ｗ／ｖ％になるように、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に投入して調整した以外は、実施例４と同様にして架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（比較例３） 自己架橋ヒアルロン酸の粒子化に高速回転装置（製品名：クレアミクスシングルモーション、エムテクニック（株）製）を使用し、装置のローターを順方向に１０，０００ｒｐｍ回転させ、架橋ヒアルロン酸が３０℃未満になるよう冷却しながら６分間微粒化した以外は、実施例１と同様にして平均体積粒径が３００μｍの自己架橋ヒアルロン酸粒子を調製した。さらに、実施例４と同様にして自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（比較例４） 自己架橋ヒアルロン酸の粒子化に高速回転装置（製品名：クレアミクスシングルモーション、エムテクニック（株）製）を使用し、装置のローターを順方向に２０，０００ｒｐｍで回転させ、架橋ヒアルロン酸が３０℃未満になるよう冷却しながら４分間微粒化した以外は、実施例１と同様にして平均体積粒径が１５３μｍの自己架橋ヒアルロン酸粒子を調製した。さらに、実施例４と同様にして自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（比較例５） 自己架橋ヒアルロン酸の粒子化に高速回転装置（製品名：クレアミクスシングルモーション、エムテクニック（株）製）を使用し、装置のローターを順方向に２０，０００ｒｐｍで回転させ、自己架橋ヒアルロン酸の冷却を行わずに２０分間微粒化し、平均体積粒径１００μｍの自己架橋ヒアルロン酸粒子を調製した。この時、自己架橋ヒアルロン酸の温度は８５℃まで上昇した。さらに、実施例４と同様にして自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（参考例１） ヒアルロン酸関節製剤「スベニール」（商品名、中外製薬（株）製） （粘度平均分子量２００万、ヒアルロン酸濃度１ｗ／ｖ％）（参考例２） ヒアルロン酸関節製剤「アルツ」（商品名、生化学工業（株）製） （粘度平均分子量８０万、ヒアルロン酸濃度１ｗ／ｖ％）（参考例３） ヒアルロン酸関節製剤「Ｓｙｎｖｉｓｃ」（商品名、ジェンザイムコーポレーション社製） （ヒアルロン酸濃度０．８ｗ／ｖ％）（参考例４） ヒアルロン酸関節製剤「Ｄｕｒｏｌａｎｅ」（商品名、Ｑ−ＭＥＤ社製） （ヒアルロン酸濃度２．０ｗ／ｖ％）（参考例５） 生理食塩水「大塚生食注」（商品名、大塚製薬（株）製） 実施例４及び５並びに比較例３〜５で得られた架橋ヒアルロン酸組成物の特性を、参考例１〜５とともに、以下のとおり測定及び評価した。＜架橋ヒアルロン酸組成物の粘度測定＞ 粘度測定装置であるレオメーターとして、ＭＣＲ３００(商品名、Ｐｈｙｓｉｃａ製)を使用した。コーンプレートはコーン角１．００９°（Ｄ＝４９．９３８ｍｍ）を用い、せん断速度５０Ｓ−１、２５℃にて測定した。実施例４及び５並びに比較例３の架橋ヒアルロン酸組成物、参考例１〜５の粘度比較を行った。表３に粘度の測定結果を示す。 表３のとおり、特に実施例４の架橋ヒアルロン酸組成物は、６ｗ／ｖ％と高濃度の自己架橋ヒアルロン酸粒子を含有するにもかかわらず、参考例１の粘度平均分子量８０万、１ｗ／ｖ％のヒアルロン酸と比べ、粘度が１／６以下となった。＜架橋ヒアルロン酸組成物の吐出圧測定（１）＞ 架橋ヒアルロン酸組成物１ｍｌを内径０．４５ｃｍの注射器テルモシリンジＳＳ−０１Ｔ（商品名、テルモ社製)に詰め、内径０．４０ｍｍ、針の長さ２５ｍｍの注射針２３Ｇ（テルモ社製)を付けた。押し出し圧測定機ＥＺ−ＴＥＳＴ（商品名、島津製作所（株）製）を用い、温度２５℃で速度５０ｍｍ/分の吐出条件で、実施例４、比較例３及び比較例４の架橋ヒアルロン酸組成物、参考例１〜５のこのシリンジにかかる圧力を測定した。表４に測定結果を示す。 表４のとおり、特に実施例４の架橋ヒアルロン酸組成物は、６ｗ／ｖ％と参考例１の６倍も高濃度のヒアルロン酸を含有するにもかかわらず、吐出圧を低く押さえることができた。＜架橋ヒアルロン酸組成物の吐出圧測定（２）＞ 吐出圧測定（１）で使用した「注射針２３Ｇ（内径０．４０ｍｍ）よりも細い２４Ｇ、２５Ｇ及び２７Ｇの注射針を使用し、実施例４及び参考例１〜５のサンプル１ｍｌを注射針のついたシリンジ（テルモ社製）に詰め、吐出圧測定（１）と同様にしてシリンジにかかる圧力を測定した。その結果を以下の表５及び図２に示す。 表５及び図２のとおり、特に実施例４の架橋ヒアルロン酸組成物は、６ｗ／ｖ％と参考例１の６倍も高濃度のヒアルロン酸を含有するにもかかわらず、吐出圧を低く押さえることができ、かつ細い針が使用可能であることから、注射時の患者の疼痛を軽減し得ることが示唆された。＜架橋ヒアルロン酸の一次分子量測定＞ 実施例４及び５並びに比較例５のサンプルについて、自己架橋ヒアルロン酸に換算して１０ｍｇ分を、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌに投入し、０℃で３０分間静置し、自己架橋ヒアルロン酸を溶解した。この溶解液に、０．１Ｎ塩酸１ｍｌを添加して中和し、ＧＰＣ溶媒で濃度を０．０１質量％になるように希釈調製し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、ＧＰＣ装置に０．１ｍｌ注入して、一次分子量として粘度平均分子量の測定を行った。 ヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ＧＰＣ装置の検出器として示差屈折率計を使い、分子量分布のピークトップのリテンションタイムから算出した。ＧＰＣ装置は、ＧＰＣカラムとして昭和電工社製ＳＢ８０６ＨＱを１本、示差屈折率検出器としてＳｈｏｄｅｘ社製ＲＩ−７１Ｓを使用して、溶媒硝酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分で測定した。リテンションタイムからの粘度平均分子量の算出には、粘度平均分子量が既知のヒアルロン酸の分子量分布のピークトップのリテンションタイムを用いて作成した検量線を用いた。検量線作成に用いるヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ヒアルロン酸を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解し、ウベローデ型粘度計を使用し３０℃に於ける０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液の流下時間（ｔ０）及び試料溶液の流下時間（ｔ）を測定し、ｔ０、ｔより得られた還元粘度ηｒｅｄから時間０に於ける極限粘度を算出し、Ｌａｕｒｅｎｔの式［η］＝０．０００３６×Ｍ０．７８（［η］：極限粘度、Ｍ：粘度平均分子量）を用いて算出した。＜架橋ヒアルロン酸から溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量測定＞ 生理的食塩水に１０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化食塩水を調整した。このリン酸緩衝化生理的食塩水１００ｍｌに対して実施例４及び５並びに比較例５のサンプル０．５ｍｌを添加し、自己架橋ヒアルロン酸が完全に溶解するまで３０日間、３７．０℃で浸漬した。リン酸緩衝化生理的食塩水中に溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量は、上記架橋ヒアルロン酸の粘度平均分子量測定と同様に行った。 表６に示すように、冷却温度制御を行わなかった比較例５は、破砕時に自己架橋ヒアルロン酸の一次分子量が低下し、自己架橋ヒアルロン酸から溶出するヒアルロン酸の粘度平均分子量も７０万と低くなった。それに対し、破砕時に５０℃未満に冷却温度制御した実施例４及び５は、自己架橋ヒアルロン酸から溶出するヒアルロン酸の粘度平均分子量が１７０万と高く保つことができた。＜関節中で自己架橋ヒアルロン酸から溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量測定＞ ウサギ（日本白色種 オス）、重量約３ｋｇを麻酔（麻酔組成：ケタミン（４ｍｌ）＋キシラジン（３ｍｌ）＋生食（５ｍｌ））し、後足両膝に実施例４及び５、比較例３及び５、並びに、参考例１及び３のサンプルを、内径０．４５ｃｍのシリンジに２３Ｇ注射針を用い、投与量０.１ｍｌ／ｋｇで注入した。 注入７日後、麻酔下で安楽死させ、膝を切り出し、関節液を高粘性用ピペットで回収した。関節液は、蒸留水で正確に１００倍希釈し、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離した。その上澄を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、ＧＰＣ装置に０．１ｍｌ注入して粘度平均分子量の測定を行った。測定結果を表７に示す。 表７に示すとおり、比較例５、参考例１及び３は、サンプル非投与と同様に、関節液量３０μｌ、関節液の粘度平均分子量１７０万以上、ヒアルロン酸濃度０．３質量％であった。これに対し、実施例４及び５の関節液量は、２００及び３００μｌ、関節液の粘度平均分子量１７０万以上、ヒアルロン酸濃度は０．６重量％となった。なお比較例３は、針詰まりが生じ、関節への注入が困難だった。実施例４及び５の関節液の増量と関節液中のヒアルロン酸濃度の上昇は、本発明の架橋ヒアルロン酸組成物に由来すると考えられ、本発明の架橋ヒアルロン酸組成物を注射剤として用いれば、注射して７日後でも、粘度平均分子量１７０万以上のヒアルロン酸が関節液中に保持されることがわかった。＜自己架橋ヒアルロン酸による疼痛抑制効果の測定＞ 実施例４及び５並びに参考例１及び５の関節腔内注射が疼痛に及ぼす作用を、ウサギの膝関節半月板部分切除による実験的変形性関節症を用いて測定した。＜使用動物及び飼育方法＞ 動物としては、１３週齢のＫｂｌ：ＪＷ（ＳＰＦ）系ウサギ（雄）を実施例・参考例毎に８羽ずつ用いるために計３２羽を準備した。動物を入荷後３〜８日の毎日、評価装置に対する訓化として、小動物用鎮痛評価装置Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｔｅｓｔｅｒ（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製）の本体容器（ホルダー）に入れ、５秒間静止させる操作を行った。 動物は、可動式ラックに装着したブラケット式金属製金網床ケージ（３５０Ｗ×５００Ｄ×３５０Ｈ ｍｍ）に個別に収容し、温度２０±３℃、湿度５０±２０%、換気回数１２〜１８回／時間、照明時間８：００〜２０：００（明１２時間、暗１２時間）の環境下で飼育した。飼料は、ステンレス製給餌器により、実験動物用固形飼料ＲＣ４（オリエンタル酵母工業社製）を１５０ｇ／日の制限給餌として与え、飲料水はポリプロピレン製給水瓶（先管ステンレス製）により水道水を自由に与えた。動物の個体識別は耳介にマジックインキで個体識別番号を記入して識別し、ケージには群分け前は性別及び個体識別番号を記入したカードを、群分け後は試験番号、投与群、性別、動物番号、手術日、投与日、部検日及び個体識別番号を記入したカードを付けた。＜動物の選択及び群分け＞ 半月板部分切除手術日の前日に、群分けを行った。群分け日に、全例の体重と両後足重量配分を測定した。測定した両後足重量配分より左後足重量配分比（（左荷重／両側合計荷重）×１００（％））を算出した。左後足重量配分比を基準とし、個体値が平均値に近い順に選択した。選択した動物は、左後足重量配分比による層別連続無作為化法を用いて各群に割り付けた。左後足重量配分比の平均値が各群で同様の値を示し、群間に差がないことを確認後、体重についても平均値が各群で同様の値を示し、群間に差がないことを確認した。＜変形性関節症モデルの作製（半月板部分切除）＞ 半月板部分切除手術は群分け日の翌日に行い、半月板部分切除手術日を術後０日と定義した。１４〜１５週齢の動物を用い、参考文献１〜３に記載の方法を参考にして、半月板部分切除変形性関節症モデルを作製した。 ここで、上記文献のうち、例えば参考文献１にはＫＢＬ：ＪＷ家兎（１３週齢、雌）３２羽を用意し、ケタミン及びキシラジン麻酔下に、左側膝関節の外側側副靭帯及び種子骨靭帯を切離し、半月板を３．０〜４．０ｍｍ部分切除し、２６Ｇの注射針を用いて、膝関節内に２週間に５回の割合で、ＡおよびＢ群の各８羽には高分子量ＨＡ溶液を注入し、対照のＣ群８羽には生理的食塩水を注入し、Ｃ群及びＤ群にはロキソニンを毎日経口投与し、疼痛抑制効果及び軟骨変性防止効果を評価することが記載されている。また参考文献２には、ニュージーランド白色家兎（体重２〜３ｋｇ）７２羽を用意し、麻酔下に、左側膝関節の靭帯を切離し、半月板を３〜４ｍｍ部分切除し、膝関節内に週２回の割合で期間２及び４週間で、Ａ群の４８羽には分子量１９０万の１〜０．０１％ＨＡ溶液を注入し、Ｂ群の１２羽には分子量８０万の１〜０．０１％ＨＡ溶液を注入し、Ｃ群の１２羽には生理的食塩水を注入し、屠殺後、膝関節を採取し薬効を評価することが記載されている。また参考文献３には、日本白色家兎（雌，２．５ｋｇ）１５羽をペントバルビタールナトリウム麻酔下に、左側膝関節の外側側副靭帯及び種子骨靭帯を切離し、半月板を３．０〜４．０ｍｍ部分切除し、２５Ｇの注射針を用いて膝関節内に週２回の割合で注入し、対照として生理食塩水を同量注入し、屠殺後、膝関節を採取し薬効を評価することが記載されている。 参考文献１：Ｍ． Ｍｉｈａｒａ， Ｓ． Ｈｉｇｏ， Ｙ． Ｕｃｈｉｙａｍａ、 Ｋ．Ｔａｎａｂｅ、 Ｋ． Ｓａｉｔｏ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｉｔ ｓｏｄｉｕｍ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ ａｎｄ ＮＳＡＩＤ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ＯＡ ｍｏｄｅｌ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ， Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．５， ｐｐ．５４３−５４９（２００７） 参考文献２：Ｔ． Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｈ． Ｙａｍａｄａ ａｎｄ Ｍ． Ｓｈｉｍｍｅｉ：Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｏｎ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ， Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２， ｐｐ．９９−１１０（１９９６） 参考文献３：菊池 寿幸，山田 治基，堀田 拓，館田 智昭，小松 修一， 新名 正由：家兎変形性関節症モデルにおける高分子ｈｙａｌｕｒｏｎａｎの軟骨変性抑制作用，関節外科，Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１１，９２−９８（１９９６） 参考文献４：舘田 智昭，永峯 春代，岩館 克治，中村 亨：ウサギの実験的変形性関節症（ＯＡ）モデルおよび固定関節拘縮（ＰＳ）モデルにおけるヒアルロン酸ナトリウム製剤（ＭＥ３７１０）の薬効薬理試験，薬理と治療，２３，８３３−８４１（１９９５） 参考文献５：野地 裕美，八木 直美，小田 康弘，岩館 克治，田元 浩一，関川 彬：室温保存可能な新規高分子ヒアルロン酸ナトリウム製剤の生物学的同等性試験，薬理と治療，３３，３０３−３１２（２００５） 参考文献６：渡辺 耕志，並木 脩，豊島 弘道，楠本 剛夫：固定関節に対する高分子ヒアルロン酸の影響，整形外科基礎科学，Ｖｏｌ．９，７７−７９（１９８２） 参考文献７：宮崎 匡輔，長野 聖，鈴木 啓太郎，後藤 幸子，山口 敏二郎，並木 脩：ウサギ固定関節に対するヒアルロン酸ナトリウムの影響，整形外科基礎科学，Ｖｏｌ．１１，１２５−１２７（１９８４） 参考文献８：Ｔ． ｋａｗａｎｏ， Ｈ． Ｍｉｕｒａ， Ｔ． Ｍａｗａｔａｒｉ， Ｔ． Ｍｏｒｏ−Ｏｋａ， Ｙ． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， Ｈ． Ｈｉｇａｓｈｉ ａｎｄ Ｙ． Ｉｗａｍｏｔｏ：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｌｕｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｏｎ Ｓｙｎｏｖｉａｌ Ｊｏｉｎｔ Ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ， Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．７， ｐｐ．１９２３ − １９２９ （２００３） 具体的には、塩酸ケタミン（製品名：ケタラール筋注用５００ｍｇ、三共エール薬品社製）及びキシラジン（製品名：スキルペ、２％注射液、インターベット社製）の併用麻酔下（大腿部筋肉内注射）でウサギの左膝関節部を除毛し、北島式固定器（夏目製作所社製）に背位固定した。無菌的に膝蓋の外側直下皮膚に約２ｃｍの切開を加え、外側側副靭帯を露呈させた後、この靭帯を切除した。さらに、膝窩筋起始部の腱を切除することにより外側半月板を露呈させ、半月板のほぼ中央部を３．０−４．０ｍｍに渡り切除した。その後、皮下筋層と皮膚をそれぞれ結節縫合し、アンピシリン（製品名：ビクシリンゾル−１５％、明治製菓社製）約０．２ｍｌを大腿部筋肉内に注射した。＜関節腔内に注入する群の構成＞ 参考文献１〜８に記載の方法を参考にして、実施例４及び５並びに参考例１及び５の注射剤を０．１ｍＬ／ｋｇ関節腔内に注入する４群を、表８のとおり設定した。 全群全例について、術後４日（疼痛発症日）の両後足重量配分測定後に１回、実施例４及び５並びに参考例１及び５の注射剤０．１ｍｌ／ｋｇを、手術側（左側）膝関節腔内に１ｍｌ注射筒（テルモシリンジ１ｍｌツベルクリン用、（株）テルモ）及び２３Ｇ注射針（テルモ注射針２３Ｇ、（株）テルモ）を用いて投与した。投与液量は投与日に測定した体重に基づく液量換算により個別に算出した。＜疼痛抑制効果の測定方法＞ 両後足重量配分の測定には小動物用鎮痛評価装置Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｔｅｓｔｅｒ（英国Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いた。本装置は、本体容器に入れた動物の左右の脚への重量配分を、容器底面に設置したデュアルチャンネルのセンサーパッドにより、左右それぞれの重量をグラム単位で正確に検出し、その値を試験者が設定した時間にて平均化した。本体容器はウサギ用のものを使用した。測定設定時間は動物の静止状態で５秒とした。 動物をウサギ用本体容器（ホルダー）内に移動し、動物の静止状態で測定し（１度目）、次に動物をホルダーから出し、再度入れて静止状態で測定し（２度目）、この操作を再度繰り返した（３度目）。３度測定した両後足重量配分のそれぞれについて、左右重量（荷重）から左後足重量配分比（％）を下記式（４）により算出した。 左後足重量配分比（％）＝｛左荷重（ｇ）／（右荷重（ｇ）＋左荷重（ｇ））×１００｝・・・（４） ３度算出した左後足重量配分比（％）の平均値を、測定1回当たりの左後足重量配分比（％）と定義した。その結果を図３に示す。 図３に示すように、実施例４及び５の自己架橋ヒアルロン酸は、参考例１よりも疼痛抑制効果が向上していることがわかった。なお、図３中、＊、＊＊は参考例５である陰性対照（生理的食塩水投与）と比較して有意差があることを示す。（＊：ｐ<０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ｔ検定））＜各種自己架橋エステル化度の自己架橋ヒアルロン酸の調製＞ 実施例１で得られた自己架橋ヒアルロンを５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）の溶媒に交換し、６ｗｔ％の懸濁状の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。得られた架橋ヒアルロン酸組成物７ｍｌを採取し、容器に移し密閉した。同様の架橋ヒアルロン酸組成物採取を繰り返し、５本の試験サンプルを得た。 上記５本の試験サンプルを６０℃に設定した恒温環境試験機（エスペック製）に入れ、所定時間加熱した。加熱時間は５本の試験サンプルで異なる時間とした。すなわち加熱開始より０，２，４，６，１０時間後の各時点に試験サンプル１本ずつ取り出した。以上の工程により、５種類の架橋ヒアルロン酸組成物を得た。これらを上記加熱時間の短い順に、実施例６〜９及び比較例６とした。＜平衡膨潤倍率の測定＞ 架橋ヒアルロン酸組成物０．４ｍｌを、遠心式フィルターユニット（０．４５マイクロメートル孔径，ミリポア社製）を用いて５℃、２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して溶媒を除去し、さらに遠心式フィルターユニットごと２０時間乾燥することで、溶媒除去した自己架橋ヒアルロン酸重量と乾燥した自己架橋ヒアルロン酸重量を求め、平衡膨潤倍率を算出した。溶媒は、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）で、ＮａＣｌ濃度は０．９ｗｔ％であり、５℃で１日間膨潤させ、平衡膨潤状態に到達した後に、測定した。＜６０℃溶解性半減期の測定＞ 実施例６〜９及び比較例６の架橋ヒアルロン酸組成物について、実施例１〜３及び比較例１〜２における測定方法と同様に、６０℃溶解性半減期を測定した。＜一次分子量の測定＞ 実施例６〜９及び比較例６の架橋ヒアルロン酸組成物の一次分子量として、実施例１〜３及び比較例１〜２における測定方法と同様に、粘度平均分子量を測定した。＜架橋度（自己架橋エステル化度）の測定＞ 自己架橋ヒアルロン酸中の架橋度（自己架橋エステル化度）は、プロトン核磁気共鳴法（ＮＭＲ）による化学シフト強度（ピーク面積値）によって求めた。測定のためには、あらかじめヒアルロン酸構造を加水分解し、低分子量化する必要があったため、自己架橋ヒアルロン酸の主鎖構造のみを選択的に加水分解するヒアルロン酸加水分解酵素による加水分解処理を行った。ヒアルロン酸加水分解酵素は、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｚｅ ｆｒｏｍ ｓｈｅｅｐ ｔｅｓｔｅｓ ＴｙｐｅＶ，ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ、ａｃｔｉｖｉｔｙ：＞１，５００ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ（シグマアルドリッチ社製）を用い、不純物を除くため陽イオン交換カラムＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用い精製した。精製は、上記の酵素を０．１ｇ／ｍＬ濃度になるよう１０ｍＭ、ｐＨ５．０酢酸緩衝液に溶解し、この溶液０．１ｍＬを同緩衝液で平衡化した上記のカラムに通液し、ＮａＣｌ濃度０．０５〜０．１５ｍｏｌ／Ｌで溶出してくる精製画分の酵素溶液０．８ｍＬを得た。加水分解処理は、架橋ヒアルロン酸を１０ｍＭ、ｐＨ５．０酢酸緩衝生理食塩水１．０ｍＬに濃度３ｗｔ％になるように調整し、上記の精製酵素溶液０．２ｍＬを添加し、３７℃１６０ｒｐｍ振とう条件下で２４時間反応させ、その後、酵素溶液０．２ｍＬを加えて同条件下でさらに２４時間反応させた。反応後の溶液は、−３０℃で凍結し、その後１８時間凍結乾燥させた後、ＮＭＲ測定試料とした。 なお、測定条件を以下のとおりとした。機器：ＡＶＡＮＣＥＩＩＩ ５００、観測幅：５００．２３２ＭＨｚ、パルス幅：１０．５μｓ（９０°）、測定モード：１３Ｃデカップル−１Ｈノンデカップル法、積算回数：７６００回、測定温度：３０℃。 測定で得られたスペクトル図より、架橋エステル基に相当する化学シフト（Ｈa：４．１８ｐｐｍ）及びアセチルメチル基に相当する化学シフト（Ｈｂ：２．０５ｐｐｍ）の積分値を求め、以下の式（５）より架橋度を算出した。 架橋度＝１００×（［Ｈａ］×２）／（［Ｈｂ］／３）・・・（５） 実施例６〜９及び比較例６の架橋ヒアルロン酸組成物の測定結果を表９及び図４〜７に示した。 表９及び図４〜７のとおり、加熱時間を増加させることによって、架橋度を小さくさせた架橋ヒアルロン酸組成物は、６０℃溶解性半減期も小さくなり、二次関数的な相関を示した。一方、平衡膨潤倍率は、架橋度を小さくさせた架橋ヒアルロン酸組成物ほど大きくなり、フローリー・レーナー式に相似する相関を示した。＜保存安定性の評価＞ 実施例６〜９及び比較例６の架橋ヒアルロン酸組成物の溶媒を、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．０）に交換し、自己架橋ヒアルロン酸の濃度が６ｗ／ｖ％となるように調整した。６０℃環境での加熱中、適当な間隔でサンプル採取を行い、遊離したヒアルロン酸量を測定し、ゲル分率を測定した。加熱時間に対するゲル分率の挙動を読み取り、ゲル分率９７％に到達する加熱時間を求めた。また、ゲル分率９５％に到達する加熱時間も上記と同様に求めた。その測定結果を以下の表１０及び図８〜９に示す。 表１０のとおり、加熱時間の増加に従い、ゲル分率到達日数が短くなった。特に、比較例６においては、ゲル分率９７％に到達する加熱時間が０．７日、ゲル分率９５％に到達する加熱時間が１．１日と短くなった。また、半減期及び架橋度が少なくなるほど、ゲル分率到達日数も短くなり、これらの物性値と保存安定性が相関することを示した（図８及び図９）。（平均沈降濃度の測定） また、実施例６〜９及び比較例６の架橋ヒアルロン酸懸濁液について、平均沈降濃度の測定を行った。平衡沈降濃度は、懸濁液のヒアルロン酸濃度［Ｃ］、懸濁液の体積［Ｖ０］及び沈澱の体積［Ｖ］を測定し、下記式（６）のとおり求めた。 平衡沈降濃度＝Ｃ×（Ｖ０／Ｖ）・・・（６） その測定結果を以下の表１１に示す。 表１１のとおり、設定可能な濃度上限である平衡沈降濃度が加熱時間と相関した。特に、比較例６は平均沈降濃度が５．２重量％と低く、実施例６〜９と比べて濃度を高くすることができないことを示した。（実施例１０（第２実施形態））＜ヒアルロン酸原料中のエタノール除去前処理＞ 粘度平均分子量２２０万のヒアルロン酸ナトリウムの粉末を通気フィルター付き容器に入れ、室温下でポンプにより吸引し、３日間通気してエタノールを除去した。＜自己架橋ヒアルロン酸の合成＞ ２Ｎの硝酸７５ｇを自公転型混練り装置(プライミクス製)に入れ、−１０℃に冷却し、シャーベット状の硝酸凍結物を得た。硝酸凍結物に上記処理を施したヒアルロン酸ナトリウムの粉末２２．５ｇ（水分含量１０％）を投入し、−１０℃、１００ｒｐｍで均一なゴム状になるまで１時間練り混ぜた（ヒアルロン酸ナトリウム２０．８質量％）。 このヒアルロン酸と硝酸の混合物を−２０℃に設定した冷凍庫に入れた。１０日後、５℃の純水１Ｌに投入し、１時間おきに純水を交換することを２回繰り返した。さらに５℃、５０ｍＭのリン酸緩衝液１Ｌに投入し、１時間おきに５０ｍＭのリン酸緩衝液を交換することを５回繰り返し、硝酸が完全に無くなるまで中和洗浄を行い、自己架橋ヒアルロン酸を得た。＜自己架橋ヒアルロン酸の粒子化＞ 上記のとおり得られた自己架橋ヒアルロン酸を中和後３０分間静置し、上清をデカンテーションで除き、沈降した自己架橋ヒアルロン酸に対して、９倍の重量の５０ｍＭリン酸緩衝液を加えた。次に、この架橋ヒアルロン酸懸濁液を高速回転装置（製品名：クレアミクスダブルモーション、エムテクニック（株）製）に投入し、装置のローターを順方向２０，０００ｒｐｍ、スクリーンを逆方向に１８，０００ｒｐｍで回転させ、５０℃未満になるよう冷却しながら１５分間微粒化した。ローターは後退角度０度ローターを使用し、スクリーン上に存在するスリットの巾が１．０ｍｍのものを使用した。（実施例１１） １０００ｐｐｍのエタノールを含有するように調整したヒアルロン酸原料を用い、実施例１０と同様にして、自己架橋ヒアルロン酸粒子を得た。（比較例７） ３１０００ｐｐｍのエタノールを含有するように調整したヒアルロン酸原料を用い、実施例１０と同様にして、自己架橋ヒアルロン酸粒子を得た。（比較例８） １１６０００ｐｐｍのエタノールを含有するように調整したヒアルロン酸原料を用い、実施例１０と同様にして、自己架橋ヒアルロン酸粒子を得た。＜自己架橋エステル化度（架橋度）の測定＞ 自己架橋ヒアルロン酸中の自己架橋エステル化度（架橋度）は、プロトン核磁気共鳴法（ＮＭＲ）による化学シフト強度（ピーク面積値）によって求めた。測定のためには、あらかじめヒアルロン酸構造を加水分解し、低分子量化する必要があったため、自己架橋ヒアルロン酸の主鎖構造のみを選択的に加水分解するヒアルロン酸加水分解酵素による加水分解処理を行った。ヒアルロン酸加水分解酵素は、Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｚｅ ｆｒｏｍ ｓｈｅｅｐ ｔｅｓｔｅｓ ＴｙｐｅＶ，ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ、ａｃｔｉｖｉｔｙ：＞１，５００ ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ（シグマアルドリッチ社製）を用い、不純物を除くため陽イオン交換カラムＭｏｎｏ Ｓ ５／５０ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用い精製した。精製は、上記の酵素を０．１ｇ／ｍＬ濃度になるよう１０ｍＭ、ｐＨ５．０酢酸緩衝液に溶解し、この溶液０．１ｍＬを同緩衝液で平衡化した上記のカラムに通液し、ＮａＣｌ濃度０．０５〜０．１５ｍｏｌ／Ｌで溶出してくる精製画分の酵素溶液０．８ｍＬを得た。加水分解処理は、架橋ヒアルロン酸を１０ｍＭ、ｐＨ５．０酢酸緩衝生理食塩水１．０ｍＬに濃度３ｗｔ％になるように調整し、上記の精製酵素溶液０．２ｍＬを添加し、３７℃１６０ｒｐｍ振とう条件下で２４時間反応させ、その後、酵素溶液０．２ｍＬを加えて同条件下でさらに２４時間反応させた。反応後の溶液は、−３０℃で凍結し、その後１８時間凍結乾燥させた後、ＮＭＲ測定試料とした。 測定で得られたスペクトル図より、架橋エステル基に相当する化学シフト（Ｈa：４．１８ｐｐｍ）及びアセチルメチル基に相当する化学シフト（Ｈｂ：２．０５ｐｐｍ）の積分値を求め、以下の式（４）より架橋度を算出した。 架橋度＝１００×（［Ｈａ］×２）／（［Ｈｂ］／３）・・・（４）＜エチルエステル量の測定＞ 上記で得られた実施例１０〜１１及び比較例７〜８の自己架橋ヒアルロン酸粒子について、エチルエステル量をＮＭＲにより測定した。 測定で得られたスペクトル図より、ヒアルロン酸のエチルエステル基に相当するピーク（Ｈａ：４．２７〜４．３３ｐｐｍ）及びヒアルロン酸のアセチルメチル基に相当するピーク（Ｈｂ：２．０５ｐｐｍ）の積分値を求め、以下の式（５）よりヒアルロン酸のエチルエステルを定量した。 ヒアルロン酸のエチルエステル量（モル％）＝１００×（［Ｈａ］／２）／（［Ｈｂ］／３）・・・（５）＜溶解性半減期の測定＞ 上記で得られた実施例１０〜１１及び比較例７〜８の自己架橋ヒアルロン酸粒子について、溶解性半減期を測定した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を用いて、６０℃環境で加熱を行い、５時間間隔でサンプル採取した。採取したサンプルを希釈し、遠心分離により上清と沈殿部に分け、それぞれの部分のヒアルロン酸濃度を測定し、ゲル分率を算出した。加熱時間に対するゲル分率の挙動を読み取り、ゲル分率５０％に到達する加熱時間を求めた。＜粘度平均分子量＞ 生理的食塩水に１０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化食塩水を調整した。このリン酸緩衝化生理的食塩水１００ｍｌに対して実施例１０〜１１及び比較例７〜８の自己架橋ヒアルロン酸粒子を添加し、自己架橋ヒアルロン酸が完全に溶解するまで３０日間、３７．０℃で浸漬した。 リン酸緩衝化生理的食塩水中に溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量は、上澄を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、ＧＰＣ装置に０．１ｍｌ注入して測定した。ヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ＧＰＣ装置の検出器として示差屈折率計を使い、分子量分布のピークトップのリテンションタイムから算出した。ＧＰＣ装置は、ＧＰＣカラムとして昭和電工社製ＳＢ８０６ＨＱを１本、示差屈折率検出器としてＳｈｏｄｅｘ社製ＲＩ−７１Ｓを使用して、溶媒硝酸ナトリウムの０．２Ｍ水溶液、測定温度４０℃、流速０．３ｍｌ／分で測定した。リテンションタイムからの粘度平均分子量の算出には、粘度平均分子量が既知のヒアルロン酸の分子量分布のピークトップのリテンションタイムを用いて作成した検量線を用いた。検量線作成に用いるヒアルロン酸の粘度平均分子量は、ヒアルロン酸を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解し、ウベローデ型粘度計を使用し３０℃に於ける０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液の流下時間（ｔ０）及び試料溶液の流下時間（ｔ）を測定し、ｔ０、ｔより得られた還元粘度ηｒｅｄから時間０に於ける極限粘度を算出し、Ｌａｕｒｅｎｔの式［η］＝０．０００３６×Ｍ０．７８（［η］：極限粘度、Ｍ：粘度平均分子量）を用いて算出した。 実施例１０〜１１及び比較例７〜８の測定結果を表１２に示す。 表１２のとおり、実施例１０〜１１の自己架橋ヒアルロン酸粒子は、エタノール含量が少なく、エチルエステル量も少なく、溶解性半減期及び一次分子量の低下は見られなかった。一方、エタノール含量及びエチルエステル量が多い比較例７〜８の自己架橋ヒアルロン酸粒子は、実施例１０〜１１と比較して、溶解性半減期及び一次分子量の値が低く、物性劣化が生じていた。また、比較例７〜８の自己架橋エステル化度は実施例１０〜１１と比較して低くなっていることから、エチルエステル化が自己エステル化を阻害していることを確認した。＜平均体積粒径＞ 実施例１０で得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の粒子径について、粒度・形状分布測定器ＰＩＴＡ−１（セイシン企業製）を用い定量した。前処理として自己架橋ヒアルロン酸をメチレンブルーにより染色（染色液濃度：１ｗ／ｖ％、染色時間：１分以上）した。ＰＩＴＡ−１の測定条件としては、キャリア液は蒸留水を用い、測定粒子数は１０，０００個、対物レンズ４倍で測定した。その結果、得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子の平均体積粒径は６５μｍだった。＜架橋ヒアルロン酸組成物の調製＞（実施例１２） 実施例１０で得られた自己架橋ヒアルロン酸粒子を、５℃、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に投入し、一時間おきに１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水を交換することを２回繰り返した。この架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、自己架橋ヒアルロン酸粒子の乾燥重量（濃度）が６ｗ／ｖ％になるように以下のように調整した。 自己架橋ヒアルロン酸の濃度の定量は、架橋ヒアルロン酸組成物５０ｍｇを蒸留水１．５５ｍｌで希釈し、そこに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を０．２ｍｌ添加し、室温にて３０分静置することで、自己架橋ヒアルロン酸のエステル架橋を加水分解し、自己架橋ヒアルロン酸を溶解した。さらに１Ｎ塩酸０．２ｍｌを添加し、中和した後、カルバゾール硫酸法により、既知濃度のヒアルロン酸（粘度平均分子量１９０万）を標準物質として、自己架橋ヒアルロン酸の濃度を計算した。この定量結果を基に、自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％となるように調整し、架橋ヒアルロン酸組成物を得た。（実施例１３） 架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する自己架橋ヒアルロン酸粒子の乾燥重量が３ｗ／ｖ％になるように、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に投入して調整した以外は、実施例１２と同様にして架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（比較例９） 自己架橋ヒアルロン酸の粒子化に高速回転装置（製品名：クレアミクスシングルモーション、エムテクニック（株）製）を使用し、装置のローターを順方向に１０，０００ｒｐｍで回転させ、架橋ヒアルロン酸が３０℃未満になるよう冷却しながら６分間微粒化した以外は、実施例１０と同様にして平均体積粒径が３００μｍの自己架橋ヒアルロン酸粒子を調製した。さらに、実施例１２と同様にして自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（比較例１０） 自己架橋ヒアルロン酸の粒子化に高速回転装置（製品名：クレアミクスシングルモーション、エムテクニック（株）製）を使用し、装置のローターを順方向に２０，０００ｒｐｍで回転させ、架橋ヒアルロン酸が３０℃未満になるよう冷却しながら４分間微粒化した以外は、実施例１０と同様にして平均体積粒径が１５３μｍの自己架橋ヒアルロン酸粒子を調製した。さらに、実施例１２と同様にして自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（比較例１１） 自己架橋ヒアルロン酸の粒子化に高速回転装置（製品名：クレアミクスシングルモーション、エムテクニック（株）製）を使用し、装置のローターを順方向に２０，０００ｒｐｍで回転させ、自己架橋ヒアルロン酸の冷却を行わずに２０分間微粒化し、平均体積粒径１００μｍの自己架橋ヒアルロン酸粒子を調製した。この時、自己架橋ヒアルロン酸の温度は８５℃まで上昇した。さらに、実施例１２と同様にして自己架橋ヒアルロン酸粒子の濃度が、６ｗ／ｖ％の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。（参考例１） ヒアルロン酸関節製剤「スベニール」（商品名、中外製薬（株）製） （粘度平均分子量２００万、ヒアルロン酸濃度１ｗ／ｖ％）（参考例２） ヒアルロン酸関節製剤「アルツ」（商品名、生化学工業（株）製） （粘度平均分子量８０万、ヒアルロン酸濃度１ｗ／ｖ％）（参考例３） ヒアルロン酸関節製剤「Ｓｙｎｖｉｓｃ」（商品名、ジェンザイムコーポレーション社製） （ヒアルロン酸濃度０．８ｗ／ｖ％）（参考例４） ヒアルロン酸関節製剤「Ｄｕｒｏｌａｎｅ」（商品名、Ｑ−ＭＥＤ社製） （ヒアルロン酸濃度２．０ｗ／ｖ％）（参考例５） 生理食塩水「大塚生食注」（商品名、大塚製薬（株）製） 実施例１２〜１３並びに比較例９〜１１で得られた架橋ヒアルロン酸組成物の特性を、参考例１〜５とともに、以下のとおり測定及び評価した。＜架橋ヒアルロン酸組成物の粘度測定＞ 粘度測定装置であるレオメーターとして、ＭＣＲ３００(商品名、Ｐｈｙｓｉｃａ製)を使用した。コーンプレートはコーン角１．００９°（Ｄ＝４９．９３８ｍｍ）を用い、せん断速度５０Ｓ−１、２５℃にて測定した。実施例１２〜１３並びに比較例９の架橋ヒアルロン酸組成物、参考例１〜５の粘度比較を行った。表１３に粘度の測定結果を示す。 表１３のとおり、特に実施例１２の架橋ヒアルロン酸組成物は、６ｗ／ｖ％と高濃度の自己架橋ヒアルロン酸粒子を含有するにもかかわらず、参考例１の粘度平均分子量８０万、１ｗ／ｖ％のヒアルロン酸と比べ、粘度が１／６以下となった。＜架橋ヒアルロン酸組成物の吐出圧測定（１）＞ 架橋ヒアルロン酸組成物１ｍｌを内径０．４５ｃｍの注射器テルモシリンジＳＳ−０１Ｔ（商品名、テルモ社製)に詰め、内径０．４０ｍｍ、針の長さ２５ｍｍの注射針２３Ｇ（テルモ社製)を付けた。押し出し圧測定機ＥＺ−ＴＥＳＴ（商品名、島津製作所（株）製）を用い、温度２５℃で速度５０ｍｍ/分の吐出条件で、実施例１２及び比較例９〜１０の架橋ヒアルロン酸組成物、参考例１〜５のこのシリンジにかかる圧力を測定した。表１４に測定結果を示す。 表１４のとおり、特に実施例１２の架橋ヒアルロン酸組成物は、６ｗ／ｖ％と参考例１の６倍も高濃度のヒアルロン酸を含有するにもかかわらず、吐出圧を低く押さえることができた。＜架橋ヒアルロン酸組成物の吐出圧測定（２）＞ 吐出圧測定（１）で使用した「注射針２３Ｇ（内径０．４０ｍｍ）よりも細い２４Ｇ、２５Ｇ及び２７Ｇの注射針を使用し、実施例１２及び参考例１〜５のサンプル１ｍｌを注射針のついたシリンジ（テルモ社製）に詰め、吐出圧測定（１）と同様にしてシリンジにかかる圧力を測定した。その結果を以下の表１５及び図１０に示す。 表１５及び図１０のとおり、特に実施例１２の架橋ヒアルロン酸組成物は、６ｗ／ｖ％と参考例１の６倍も高濃度のヒアルロン酸を含有するにもかかわらず、吐出圧を低く押さえることができ、かつ細い針が使用可能であることから、注射時の患者の疼痛を軽減し得ることが示唆された。＜架橋ヒアルロン酸の一次分子量測定＞ 実施例１２及び１３並びに比較例１１のサンプルについて、自己架橋ヒアルロン酸に換算して１０ｍｇ分を、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌに投入し、０℃で３０分間静置し、自己架橋ヒアルロン酸を溶解した。この溶解液に、０．１Ｎ塩酸１ｍｌを添加して中和し、ＧＰＣ溶媒で濃度を０．０１質量％になるように希釈調製し、０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、ＧＰＣ装置に０．１ｍｌ注入して、実施例１０〜１１及び比較例７〜８と同様に、一次分子量として粘度平均分子量の測定を行った。測定結果を表１６に示す。＜架橋ヒアルロン酸から溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量測定＞ 生理的食塩水に１０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、ｐＨ７．４のリン酸緩衝化食塩水を調整した。このリン酸緩衝化生理的食塩水１００ｍｌに対して実施例１２及び１３並びに比較例１１のサンプル０．５ｍｌを添加し、自己架橋ヒアルロン酸が完全に溶解するまで３０日間、３７．０℃で浸漬し、実施例１０〜１１及び比較例７〜８と同様に、粘度平均分子量の測定を行った。測定結果を表１６に示す。 表１６に示すように、冷却温度制御を行わなかった比較例１１は、破砕時に自己架橋ヒアルロン酸の一次分子量が低下し、自己架橋ヒアルロン酸から溶出するヒアルロン酸の粘度平均分子量も７０万と低くなった。それに対し、破砕時に５０℃未満に冷却温度制御した実施例１２及び１３は、自己架橋ヒアルロン酸から溶出するヒアルロン酸の粘度平均分子量が１７０万と高く保つことができた。＜関節中で自己架橋ヒアルロン酸から溶出したヒアルロン酸の粘度平均分子量測定＞ ウサギ（日本白色種 オス）、重量約３ｋｇを麻酔（麻酔組成：ケタミン（４ｍｌ）＋キシラジン（３ｍｌ）＋生食（５ｍｌ））し、後足両膝に実施例１２及び１３、比較例９及び１１、並びに、参考例１及び３のサンプルを、内径０．４５ｃｍのシリンジに２３Ｇ注射針を用い、投与量０.１ｍｌ／ｋｇで注入した。 注入７日後、麻酔下で安楽死させ、膝を切り出し、関節液を高粘性用ピペットで回収した。関節液は、蒸留水で正確に１００倍希釈し、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離した。その上澄を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過した後、ＧＰＣ装置に０．１ｍｌ注入して粘度平均分子量の測定を行った。測定結果を表１７に示す。 表１７に示すとおり、比較例１１、参考例１及び３は、サンプル非投与と同様に、関節液量３０μｌ、関節液の粘度平均分子量１７０万以上、ヒアルロン酸濃度０．３質量％であった。これに対し、実施例１２及び１３の関節液量は、２００及び３００μｌ、関節液の粘度平均分子量１７０万以上、ヒアルロン酸濃度は０．６重量％となった。なお比較例９は、針詰まりが生じ、関節への注入が困難だった。実施例１２及び１３の関節液の増量と関節液中のヒアルロン酸濃度の上昇は、本発明の架橋ヒアルロン酸組成物に由来すると考えられ、本発明の架橋ヒアルロン酸組成物を注射剤として用いれば、注射して７日後でも、粘度平均分子量１７０万以上のヒアルロン酸が関節液中に保持されることがわかった。＜自己架橋ヒアルロン酸による疼痛抑制効果の測定＞ 実施例１２及び１３並びに参考例１及び５の関節腔内注射が疼痛に及ぼす作用を、ウサギの膝関節半月板部分切除による実験的変形性関節症を用いて測定した。＜使用動物及び飼育方法＞ 動物としては、１３週齢のＫｂｌ：ＪＷ（ＳＰＦ）系ウサギを実施例・参考例毎に８羽ずつ用いるために計３２羽を準備した。動物を入荷後３〜８日の毎日、評価装置に対する訓化として、動物を小動物用鎮痛評価装置Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｔｅｓｔｅｒ（Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製）の本体容器（ホルダー）に入れ、５秒間静止させる操作を行った。 動物は、可動式ラックに装着したブラケット式金属製金網床ケージ（３５０Ｗ×５００Ｄ×３５０Ｈ ｍｍ）に個別に収容し、温度２０±３℃、湿度５０±２０%、換気回数１２〜１８回／時間、照明時間８：００〜２０：００（明１２時間、暗１２時間）の環境下で飼育した。飼料は、ステンレス製給餌器により、実験動物用固形飼料ＲＣ４（オリエンタル酵母工業社製）を１５０ｇ／日の制限給餌として与え、飲料水はポリプロピレン製給水瓶（先管ステンレス製）により水道水自由に与えた。動物の個体識別は耳介にマジックインキで個体識別番号を記入して識別し、ケージには群分け前は性別及び個体識別番号を記入したカードを、群分け後は試験番号、投与群、性別、動物番号、手術日、投与日、部検日及び個体識別番号を記入したカードを付けた。＜動物の選択及び群分け＞ 半月板部分切除手術日の前日に、群分けを行った。群分け日に、全例の体重と両後足重量配分を測定した。測定した両後足重量配分より左後足重量配分比（（左荷重／両側合計荷重）×１００（％））を算出した。左後足重量配分比を基準とし、個体値が平均値に近い順に選択した。選択した動物は、左後足重量配分比による層別連続無作為化法を用いて各群に割り付けた。左後足重量配分比の平均値が各群で同様の値を示し、群間に差がないことを確認後、体重についても平均値が各群で同様の値を示し、群間に差がないことを確認した。＜変形性関節症モデルの作製（半月板部分切除）＞ 半月板部分切除手術は群分け日の翌日に行い、半月板部分切除手術日を術後０日と定義した。１４〜１５週齢の動物を用い、上述の参考文献１〜３に記載の方法を参考にして、半月板部分切除変形性関節症モデルを作製した。 具体的には、塩酸ケタミン（製品名：ケタラール筋注用５００ｍｇ、三共エール薬品社製）及びキシラジン（製品名：スキルペン２％注射液、インターベット社製）の併用麻酔下（大腿部筋肉内注射）でウサギの左膝関節部を除毛し、北島式固定器（夏目製作所社製）に背位固定した。無菌的に膝蓋の外側直下皮膚に約２ｃｍの切開を加え、外側側副靭帯を露呈させた後、この靭帯を切除した。さらに、膝窩筋起始部の腱を切除することにより外側半月板を露呈させ、半月板のほぼ中央部を３．０−４．０ｍｍに渡り切除した。その後、皮下筋層と皮膚をそれぞれ結節縫合し、アンピシリン（製品名：ビクシリンゾル−１５％、明治製菓社製）約０．２ｍｌを大腿部筋肉内に注射した。＜関節腔内に注入する群の構成＞ 上述の参考文献１〜８に記載の方法を参考にして、実施例１２及び１３並びに参考例１及び５の注射剤を０．１ｍＬ／ｋｇ関節腔内に注入する４群を、表１８のとおり設定した。 全群全例について、術後４日（疼痛発症日）の両後足重量配分測定後に１回、実施例１２及び１３並びに参考例１及び５の注射剤０．１ｍｌ／ｋｇを、手術側（左側）膝関節腔内に１ｍｌ注射筒（テルモシリンジ１ｍｌツベルクリン用、（株）テルモ）及び２３Ｇ注射針（テルモ注射針２３Ｇ、（株）テルモ）を用いて投与した。投与液量は投与日に測定した体重に基づく液量換算により個別に算出した。＜疼痛抑制効果の測定方法＞ 両後足重量配分の測定には小動物用鎮痛評価装置Ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ Ｔｅｓｔｅｒ（英国Ｌｉｎｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いた。本装置は、本体容器に入れた動物の左右の脚への重量配分を、容器底面に設置したデュアルチャンネルのセンサーパッドにより、左右それぞれの重量をグラム単位で正確に検出し、その値を試験者が設定した時間にて平均化した。本体容器はウサギ用のものを使用した。測定設定時間は動物の静止状態で５秒とした。 動物をウサギ用本体容器（ホルダー）内に移動し、動物の静止状態で測定し（１度目）、次に動物をホルダーから出し、再度入れて静止状態で測定し（２度目）、この操作を再度繰り返した（３度目）。３度測定した両後足重量配分のそれぞれについて、左右重量（荷重）から左後足重量配分比（％）を下記式（６）により算出した。 左後足重量配分比（％）＝｛左荷重（ｇ）／（右荷重（ｇ）＋左荷重（ｇ））×１００｝・・・（６） ３度算出した左後足重量配分比（％）の平均値を、測定１回当たりの左後足重量配分比（％）と定義した。その結果、図１１に示すように、実施例１２及び１３の自己架橋ヒアルロン酸は、参考例１よりも疼痛抑制効果が向上していることがわかった。なお、図１１中、＊、＊＊は参考例５である陰性対照群（生理的食塩水投与）と比較して有意差があることを示す。（＊：ｐ<０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（ｔ検定））＜各種自己架橋エステル化度の自己架橋ヒアルロン酸の調製＞ 実施例１０で得られた自己架橋ヒアルロンを５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）の溶媒に交換し、６ｗｔ％の懸濁状の架橋ヒアルロン酸組成物を調製した。得られた架橋ヒアルロン酸組成物７ｍｌを採取し、容器に移し密閉した。同様の架橋ヒアルロン酸組成物採取を繰り返し、５本の試験サンプルを得た。 上記５本の試験サンプルを６０℃に設定した恒温環境試験機（エスペック製）に入れ、所定時間加熱した。加熱時間は５本の試験サンプルで異なる時間とした。すなわち加熱開始より０，２，４，６，１０時間後の各時点に試験サンプル１本ずつ取り出した。以上の工程により、５種類の架橋ヒアルロン酸組成物を得た。これらを上記加熱時間の短い順に、実施例１４〜１７及び比較例１２とした。＜平衡膨潤倍率の測定＞ 架橋ヒアルロン酸組成物０．４ｍｌを、遠心式フィルターユニット（０．４５マイクロメートル孔径，ミリポア社製）を用いて５℃、２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して溶媒を除去し、さらに遠心式フィルターユニットごと２０時間乾燥することで、溶媒除去した自己架橋ヒアルロン酸重量と乾燥した自己架橋ヒアルロン酸重量を求め、平衡膨潤倍率を算出した。溶媒は、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）で、ＮａＣｌ濃度は０．９ｗｔ％であり、５℃で１日間膨潤させ、平衡膨潤状態に到達した後に、測定した。＜６０℃溶解性半減期の測定＞ 実施例１４〜１７及び比較例１２の架橋ヒアルロン酸組成物について、実施例１０〜１１及び比較例７〜８における測定方法と同様に、６０℃溶解性半減期を測定した。＜一次分子量の測定＞ 実施例１４〜１７及び比較例１２の架橋ヒアルロン酸組成物の一次分子量として、実施例１０〜１１及び比較例７〜８における測定方法と同様に、粘度平均分子量を測定した。＜架橋度（自己架橋エステル化度）の測定＞ 実施例１４〜１７及び比較例１２の架橋ヒアルロン酸組成物について、実施例１０〜１１及び比較例７〜８における測定方法と同様に、架橋度（自己架橋エステル化度）を測定した。なお、測定条件を以下のとおりとした。機器：ＡＶＡＮＣＥＩＩＩ ５００、観測幅：５００．２３２ＭＨｚ、パルス幅：１０．５μｓ（９０°）、測定モード：１３Ｃデカップル−１Ｈノンデカップル法、積算回数：７６００回、測定温度：３０℃。 実施例１４〜１７及び比較例１２の架橋ヒアルロン酸組成物の測定結果を表１９及び図１２〜１５に示した。 表１９及び図１２〜１５のとおり、加熱時間を増加させることによって、架橋度を小さくさせた架橋ヒアルロン酸組成物は、６０℃溶解性半減期も小さくなり、二次関数的な相関を示した。一方、平衡膨潤倍率は、架橋度を小さくさせた架橋ヒアルロン酸組成物ほど大きくなり、フローリー・レーナー式に相似する相関を示した。＜保存安定性の評価＞ 実施例１４〜１７及び比較例１２の架橋ヒアルロン酸組成物の溶媒を、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．０）に交換し、自己架橋ヒアルロン酸の濃度が６ｗ／ｖ％となるように調整した。６０℃環境での加熱中、適当な間隔でサンプル採取を行い、遊離したヒアルロン酸量を測定し、ゲル分率を測定した。加熱時間に対するゲル分率の挙動を読み取り、ゲル分率９７％に到達する加熱時間を求めた。また、ゲル分率９５％に到達する加熱時間も上記と同様に求めた。その測定結果を以下の表２０及び図１６〜１７に示す。 表２０のとおり、加熱時間の増加に従い、ゲル分率到達日数が短くなった。特に、比較例１２においては、ゲル分率９７％に到達する加熱時間が０．７日、ゲル分率９５％に到達する加熱時間が１．１日と短くなった。また、半減期及び架橋度が少なくなるほど、ゲル分率到達日数も短くなり、これらの物性値と保存安定性が相関することを示した（図１６及び図１７）。（平均沈降濃度の測定） また、実施例１４〜１７及び比較例１２の架橋ヒアルロン酸懸濁液について、平均沈降濃度の測定を行った。平衡沈降濃度は、懸濁液のヒアルロン酸濃度［Ｃ］、懸濁液の体積［Ｖ０］及び沈澱の体積［Ｖ］を測定し、下記式（７）のとおり求めた。 平衡沈降濃度＝Ｃ×（Ｖ０／Ｖ）・・・（７） その測定結果を以下の表２１に示す。 表２１のとおり、設定可能な濃度上限である平衡沈降濃度が加熱時間と相関した。特に、比較例１２は平均沈降濃度が５．２重量％と低く、実施例１４〜１７と比べて濃度を高くすることができないことを示した。 本発明によれば、従来よりも投与回数を少なくした場合であっても、変形性膝関節症に対して充分な治療効果の得られる架橋ヒアルロン酸組成物及びそれに用いる自己架橋ヒアルロン酸粒子を提供することができる。 １・・・ローター、２・・・スクリーン、３・・・スリット、１０・・・回転装置。 平均体積粒径が１０〜１００μｍであり、平衡膨潤倍率が３〜１０倍であり、一次分子量が８０万以上であり、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％である自己架橋ヒアルロン酸の粒子と、 水系溶媒とを含有する架橋ヒアルロン酸組成物であって、 前記架橋ヒアルロン酸組成物の全体積に対する、前記自己架橋ヒアルロン酸の粒子の乾燥重量は３〜８ｗ／ｖ％である、架橋ヒアルロン酸組成物。 前記自己架橋ヒアルロン酸の粒子は、エチルエステル量が０．０５ｍｏｌ％以下である、請求項１記載の架橋ヒアルロン酸組成物。 請求項１又は２記載の架橋ヒアルロン酸組成物を含有する注射剤。 １回あたり１．２５ｍｇ／ｋｇ体重以上の前記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられる、請求項３記載の注射剤。 １回あたり７５ｍｇ以上の前記自己架橋ヒアルロン酸が投与されるように用いられる、請求項３記載の注射剤。 請求項３〜５のいずれか一項に記載の注射剤を収容した、プレフィルドシリンジ製剤。 平均体積粒径が１０〜１００μｍであり、平衡膨潤倍率が３〜１０倍であり、一次分子量が８０万以上であり、自己架橋エステル化度が０．０５〜０．５０ｍｏｌ％である自己架橋ヒアルロン酸粒子。 エチルエステル量が０．０５ｍｏｌ％以下である、請求項７記載の自己架橋ヒアルロン酸粒子。