生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_乳酸菌の細胞壁成分を含有する腸管免疫力増強剤 |
| 出願番号： | 2012282540 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | A61K 35/74,C12N 1/20,A61P 1/00,A61P 37/04,C12R 1/25 |
特許情報キャッシュ
田辺 創一 菊池 洋介 沖田 公子 JP 2014125446 公開特許公報(A) 20140707 2012282540 20121226 乳酸菌の細胞壁成分を含有する腸管免疫力増強剤 国立大学法人広島大学 504136568 オリエンタル酵母工業株式会社 000103840 株式会社日清製粉グループ本社 000226998 羽鳥 修 100076532 田辺 創一 菊池 洋介 沖田 公子 A61K 35/74 20060101AFI20140610BHJP C12N 1/20 20060101ALI20140610BHJP A61P 1/00 20060101ALI20140610BHJP A61P 37/04 20060101ALI20140610BHJP C12R 1/25 20060101ALN20140610BHJP JPA61K35/74 BC12N1/20 EA61P1/00A61P37/04C12N1/20 EC12R1:25 4 ＯＬ 7 4B065 4C087 4B065AA30X 4B065BA21 4B065BD01 4B065BD46 4B065BD50 4B065CA44 4C087AA01 4C087AA02 4C087BC56 4C087CA11 4C087MA43 4C087MA52 4C087NA14 4C087ZA66 4C087ZB09 本発明は、腸管でのＩｇＡ抗体産生を向上させることにより感染抵抗性を高めるなどの腸管免疫力増強作用を有する乳酸菌の細胞壁成分を含有する腸管免疫力増強剤に関するものである。 腸管粘膜は、常に無数のウイルス、細菌、寄生虫、病原性抗原や食物抗原にさらされており、これらの異物抗原から生体を守るシステムとして腸管免疫系は発達してきた。しかし、大きな手術を行なった後や病後などは腸管免疫力が一時的に低下し、外部からの異物侵入に対する抵抗力が弱り、感染症にかかるリスクが増大することが知られている。加齢と共に腸管免疫力が徐々に低下した老人や腸管免疫系の発達が不十分な幼児も同様のリスクを背負っている。 腸管免疫力を評価する指標としては、Ｔ細胞の増殖能、免疫グロブリンＡ（以下、ＩｇＡ抗体という）の産生量、細胞が生産する種々の働きをもつペプチド、サイトカイン量などが知られている。これらの中でもＩｇＡ抗体は、細菌やウイルスの中和、組織への細菌の付着の抑制などに重要な役割を果たしている。従って、ＩｇＡ抗体量の増加は腸管免疫力向上の有力な指標となる。上記した感染予防や治療において、ＩｇＡ抗体量を高く保つ作用を有する製剤、ＩｇＡ抗体の生産力を高めることができる製剤の開発が強く望まれている。 乳酸菌は、腸管免疫力を向上させる食品成分として知られており、最近プロバイオティックスとして注目される乳酸菌による免疫賦活力に注目した食品素材も数多く提案されている。乳酸菌の属も多岐に渡り、ラクトコッカス属に着目したもの（特許文献１）、エンテロコッカス属に着目したもの（特許文献２）、ラクトバチルス属に着目したもの（特許文献３、特許文献４）など様々である。しかしながら、特許文献１では、ＩｇＡ抗体産生量の増加が重要な指標になると指摘しておきながら直接的な定量を実施していないのでその効果が明確でない。また、特許文献２では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１２産生しか評価していないし、特許文献３では、ＩｇＡ抗体産生能を評価しているもののパイエル板を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行なっているに過ぎず、特許文献４では、ＩＬ−１２に加えてＩＦＮγ、亜硝酸イオン濃度を指標としているが、生体内で免疫賦活効果を示すのかどうかは各文献では明らかにされていない。ｉｎ ｖｉｔｒｏで効果を示したものは生体で必ず効果を示すと仮定しても、特許文献４では、乳酸菌全般の効果として免疫力増強作用があるとしているのにガセリ菌とカゼイ菌各１菌株しか試験していない、カゼイ菌全般に効果があるとしているが、寄託した菌株での評価しかしていない、さらに、イネ科穀物との組み合わせによる相乗効果についてもオートミール以外の素材との組み合わせについては一切示していないなど、不備な点が多い。そこで、ＩｇＡ抗体産生能などを指標としたｉｎ ｖｉｖｏでの試験結果に基づいた腸管免疫力増強作用を有する安全な機能性素材、特に乳酸菌由来製剤の開発が切望されている。 特許文献５には、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、腸管免疫力増強作用を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤が記載されている。この腸管免疫力増強剤は、乳酸菌全体を有効成分としている。特開２００３−８８３６２号公報特開２００４−４１０９９号公報特開２００４−３５７５３５号公報特開２００６−６９９９３号公報特開２００８−２０１７０８号公報 乳酸菌は様々な生理活性を有することが知られており、目的とする生理活性を有する成分を特定することは重要である。 本発明の目的は、高い腸管免疫力増強作用を有する乳酸菌由来の成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を提供することである。 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、乳酸菌の特定の部位に、高いＩｇＡ抗体産生向上作用があることを見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明は、ＩｇＡ抗体産生向上作用を有する乳酸菌の細胞壁成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を提供するものである。 本発明の腸管免疫力増強剤は、高いＩｇＡ抗体産生向上作用を有し、該作用によって腸管免疫力増強作用をもたらす。それゆえ、本発明の腸管免疫力増強剤を摂取することにより、免疫力の低い幼児期や加齢や病後の免疫力が低下している状態での腸管免疫力を増強し、細菌の感染に対する抵抗力をつけることが可能になる。本発明の腸管免疫力増強剤は、食経験のある天然食品素材から分離した乳酸菌由来であるので安全性にも優れている。実施例１における実験結果（ＩｇＡ抗体産生量）を示すグラフである。 本発明の腸管免疫力増強剤は、ＩｇＡ抗体産生向上作用を有する乳酸菌の細胞壁成分、好ましくはラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum) に属する乳酸菌の細胞壁成分、特に好ましくはラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株の細胞壁成分を有効成分として含有するものである。 本発明の腸管免疫力増強剤で用いられる上記のＩｇＡ抗体産生向上作用を有する乳酸菌の細胞壁成分は、その作用メカニズムは限定されず、結果的にＩｇＡ抗体産生が向上し、該ＩｇＡ抗体産生向上による腸管免疫力増強作用を有するものであればよい。 ここで、「ＩｇＡ抗体産生向上作用を有する」とは、好ましくは、腸管免疫力増強剤を摂取する前後において、統計的に有意水準５％でＩｇＡ抗体産生が向上される状態をいう。 乳酸菌細胞壁成分のＩｇＡ抗体産生向上作用の評価は、以下の方法により評価することが好ましい。 乳酸菌をＭＲＳ培地等で培養し、この培養した乳酸菌から調製した細胞壁成分を０．１〜２０質量％含む飼料をマウスに一定期間摂取させる。摂取後、マウス（乳酸菌細胞壁成分添加群）を解剖し、小腸パイエル板細胞を取り出す。この小腸パイエル板細胞を培養し、培養上清を回収する。回収した培養上清中のＩｇＡ抗体産生量をＥＬＩＳＡ法により測定する。同様にして、乳酸菌細胞壁成分を含まない飼料を摂取させたマウス（乳酸菌無添加群）のＩｇＡ抗体産生量を測定する。乳酸菌細胞壁成分添加群のＩｇＡ抗体産生量と乳酸菌無添加群のＩｇＡ抗体産生量とを比較して、乳酸菌のＩｇＡ抗体産生向上作用を評価する。 前記乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−２１１０６である。 乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株の菌学的性質を下記に示す。 ＭＲＳ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）を用いて、３０℃、１８時間培養したときの菌の形態（１）菌の形態 桿菌（２）グラム染色 陽性（３）運動性 なし（４）胞子 なし（５）カタラーゼ なし（６）通性嫌気性（７）ブドウ糖の代謝 ５０％以上乳酸に転換する（８）生育温度範囲 １５℃、３０℃および３５℃では生育を認めるが、４５℃では生育を認めない（９）乳酸発酵 ホモ型（１０）乳酸の旋光性 ＤＬ（１１）炭水化物の発酵性 グリセロールは陽性、Ｄ- アラビノースは陰性、Ｌ- アラビノースは陽性、リボースは陽性、Ｄ- キシロースは陰性、ガラクトースは陽性、グルコースは陽性、フルクトースは陽性、マンノースは陽性、ラムノースは陽性、マンニトールは陽性、ソルビトールは陽性、αメチルＤグルコシドは陰性、アミグダリンは陽性、エスクリンは陽性、サリシンは陽性、セロビオースは陽性、マルトースは陽性、ラクトースは陽性、メリビオースは陽性、シュクロースは陽性、トレハロースは陽性、イヌリンは陰性、メレジトースは陽性、ラフィノースは陽性、スターチは陰性、グルコン酸は陽性。 乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株は、食経験が豊富な素材（パン酵母）から分離したものであるため、腸管免疫力を増強させる製剤に安全に利用することができる。 本発明の腸管免疫力増強剤の有効成分である乳酸菌の細胞壁成分は、乳酸菌の細胞壁中に含まれる活性成分である。 乳酸菌の細胞壁は、一般的には、乳酸菌に消化酵素処理、酸もしくはアルカリまたは熱水処理、あるいは物理的損傷処理等を施すことにより細胞壁の物質透過性を高めて、水または有機溶媒、あるいはこれらの混合物により、細胞内の可溶性成分を除去した残渣として得られる。 本発明の有効成分である細胞壁成分（細胞壁中に含まれる活性成分）は、上記のようにして得られた細胞壁（残渣）をそのまま、または必要に応じて該細胞壁を物理的損傷処理または酵素処理、あるいはこれらの組み合わせにより分解した後、溶媒抽出法により分離、回収することができる。 前記乳酸菌の細胞壁は、市販品でもよく、乳酸菌の菌体から採取したものでもよい。乳酸菌の菌体から採取する場合は、菌体は生菌でも死菌でもよく、水分を含んでいても乾燥されていてもよい。 上記溶媒抽出法に用いられる抽出溶媒としては、水や、酢酸、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、アセトニトリルなどの極性溶媒、またはこれらを混合したものや、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、酢酸エチルなどの無極性溶媒、またはこれらを混合したもの等が用いられる。好ましい抽出溶媒は、水またはエタノールである。 抽出条件は、好ましくは冷却抽出、室温抽出、加熱抽出、加圧・加熱抽出（オートクレーブ等の処理）で行う０℃〜１２１℃であり、より好ましくは室温〜１２１℃である。 抽出後、遠心分離などにより液体を分離、回収することにより、可溶性画分が得られる。可溶性画分は、必要に応じて濾過などの処理を行った後、減圧濃縮などで濃縮する。さらに、真空乾燥、凍結乾燥などにより粉末化してもよく、該粉末化の際に賦形剤を添加してもよい。 前記不溶性画分は、前記細胞壁から前記可溶性成分を分離、回収した後に得られるものである。この不溶性画分は、遠心分離などにより液体を分取した後の残渣をそのまま用いることもできるが、真空乾燥、凍結乾燥などにより粉末化してもよく、該粉末化の際に賦形剤を添加してもよい。 本発明の腸管免疫力増強剤中の乳酸菌の細胞壁成分の含有量は、ＩｇＡ抗体産生を向上しうる量であればいかなる量であってもよく、使用形態、腸管免疫力増強剤の剤形、投与又は摂取する者の症状や年齢性別などによって適宜変化させることができる。本発明の腸管免疫力増強剤を経口投与又は摂取させる場合には、１人１日当たりの投与量又は摂取量が１ｍｇ〜２０ｇとなるように含有させることが好ましい。 次に本発明をさらに具体的に説明するために実施例を挙げるが、本発明は、以下の実施例に制限されるものではない。 実施例１（使用した乳酸菌） ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０６：以下、ＡＹＡ株という）を使用した。（乳酸菌試料の調製） １０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含むＭＲＳ(de Man-Rogosa-Sharpe)培地を用い、ＡＹＡ株を３７℃で４８時間培養した。その後、遠心分離によって集菌し、滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水に懸濁し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、これらを凍結乾燥してＡＹＡ株試料粉末を得た。（乳酸菌の細胞壁成分の調製） 上記で得られたＡＹＡ株試料粉末０．１ｇを２０ｍＭリン酸カリウム（１ｍＭジチオスレイトール含有）１ｍｌに懸濁し、超音波処理を氷上で１分間行った。その後、Triton X-100を５μｌ添加し、６０℃で０．５時間インキュベートした。それを０．１Ｍ酢酸アンモニウム１ｍｌに懸濁し、卵白リゾチームを終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で２．５時間インキュベートした。その上清に２倍量のアセトンを加えて、ＡＹＡ株細胞壁成分を沈殿させた。（in vitro試験によるＩｇＡ抗体産生向上作用の評価） パイエル板細胞の調製とサンプルとの共培養 ＢＡＬＢ／ｃマウスから小腸を採取し、パイエル板を回収した。このパイエル板を磨り潰し、３７℃で７０分間コラゲナーゼ処理を行ってから７０μｍのメッシュを通し、スルー側を細胞懸濁液として回収した。ライフテクノロジーズ製のウシ胎児血清：ＦＣＳ（Foetal Calf Serum)を１質量％添加したＡｄｖａｎｃｅｄ−ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ製）で２回洗浄後、ＦＣＳを１質量％添加したＡｄｖａｎｃｅｄ−ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。当培地に懸濁したパイエル板細胞（１．５×１０6 cells ／ｍｌ）、サンプル（ＡＹＡ株細胞壁成分５０μｇ／ウェル）を細胞培養用９６穴プレートに１００μｌスケールで添加し、３日間培養した。（ＩｇＡ定量） 培養上清を回収し、上清中のＩｇＡ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。（実験結果） 実験結果を図１に示した。コントロール（サンプル無添加）と比較し、ＡＹＡ株細胞壁成分を添加することで、有意にＩｇＡ抗体産生が亢進されることがわかった。 ＩｇＡ抗体産生向上作用を有する乳酸菌の細胞壁成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤。 前記細胞壁成分が、前記乳酸菌の細胞壁、又は前記乳酸菌の細胞壁を溶媒抽出して得られる可溶性成分若しくは不溶性残渣である請求項１に記載の腸管免疫力増強剤。 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌である請求項１又は２に記載の腸管免疫力増強剤。 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０６）である請求項１〜３の何れか１項に記載の腸管免疫力増強剤。 【課題】高い腸管免疫力増強作用を有する乳酸菌由来の成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤を提供すること。【解決手段】ＩｇＡ抗体産生向上作用を有する乳酸菌の細胞壁成分を有効成分として含有する腸管免疫力増強剤。前記細胞壁成分は、前記乳酸菌の細胞壁、又は前記乳酸菌の細胞壁を溶媒抽出して得られる可溶性成分若しくは不溶性残渣であり、前記乳酸菌は、好ましくはラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌、特に好ましくはラクトバチルス・プランタラムＡＹＡ株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１１０６）である。【選択図】なし