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| タイトル： | 公開特許公報(A)_無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物、頻尿非ヒトモデル動物およびこれらを用いた被験物質の評価方法 |
| 出願番号： | 2012228540 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | A01K 67/027,G01N 33/48 |
特許情報キャッシュ
菅谷 公男 西島 さおり 嘉手川 豪心 安次富 勝博 JP 2014079188 公開特許公報(A) 20140508 2012228540 20121016 無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物、頻尿非ヒトモデル動物およびこれらを用いた被験物質の評価方法 菅谷 公男 512267232 西島 さおり 512267243 嘉手川 豪心 512267254 安次富 勝博 512267265 特許業務法人 小野国際特許事務所 110000590 菅谷 公男 西島 さおり 嘉手川 豪心 安次富 勝博 A01K 67/027 20060101AFI20140411BHJP G01N 33/48 20060101ALI20140411BHJP JPA01K67/027G01N33/48 N 11 ＯＬ 12 特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２４年８月３０日第１９回日本排尿機能学会プログラム・抄録集５７ページＰ−１−１１「頻尿の骨盤うっ血モデルラットの作製」 名古屋市熱田区熱田西町１番１号 名古屋国際会議場 2G045 2G045CB17 2G045GC08 本発明は、無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物、頻尿非ヒトモデル動物およびこれらのモデル動物を用いた被験物質の評価方法に関する。 慢性前立腺炎は、頻尿、尿意切迫感、排尿困難、残尿感、下腹部不快感、排尿時痛、会陰部痛や腰痛など多彩な症状を伴う細菌性または無菌性の慢性炎症である。無菌性慢性前立腺炎は原因が不明であり、時に治療に抵抗して長期間患者を悩ます疾患である。無菌性の慢性前立腺炎の治療には抗炎症剤や植物製剤が用いられているが十分な効果は得られていない。そのため、無菌性慢性前立腺炎に対する新たな治療法の開発が望まれている。 これまで、動物実験における無菌性慢性前立腺炎モデルとしては、オスラットの両側精巣の摘出やエストラジオール投与を組み合わせる方法で作製されることが多かった（非特許文献１）。しかし、このモデルでも薬効評価は前立腺の萎縮や炎症現象の評価のみがされており、下部尿路機能の評価はされていないことから、このモデルが正確に無菌性慢性前立腺炎を再現しているかどうかも不明であった。 そのため、無菌性慢性前立腺炎に対する新たな治療法を開発するための新規な無菌性慢性前立腺炎モデルが必要とされていた。Sugimoto M, Oka M, Tsunemori H,Yamashita M,Kakehi Y. Effect of a phytotherapeutic agent, Eviprostat(登録商標), on prostatic andurinarycytokines/chemokines in a rat model of nonbacterial prostatitis.Prostate.2011; 71: 438-444. 従って、本発明の課題は、無菌性慢性前立腺炎を再現可能な非ヒトモデル動物を提供し、更には、その非ヒトモデル動物を利用して、慢性前立腺炎に対して有効な被検物質を評価する方法を提供することである。 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、まず、ヒトの慢性前立腺炎患者では高率に骨盤うっ血状態となっているとの知見を得（Sugaya K, Matsumura E, Tasaki S, Kimura R, Kiyuna A, NishijimaS,Kadekawa K. Relationship between urological disease and inferior venacavareflux on color doppler ultrasonography. LUTS2011; 3: 94-98.）、その知見に基づいてメスラットの両側総腸骨静脈を結紮した骨盤うっ血モデルラットを作製し、膀胱機能を検討してみたところ、モデル作製後、４週目には頻尿であり、更に、このラットの骨盤内静脈系は拡張しており、膀胱組織は肥厚しており、炎症性変化のあることが肉眼的にも確認できた。 このことから、本発明者らは、オスラットに骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施したところ、無菌性慢性前立腺炎のモデル動物となることを見出した。また、意外にも、オスラットに骨盤うっ血させる手段だけを施した場合には頻尿のモデル動物となることも見出した。更に、これらのモデル動物を用いれば被検物質を評価できることを見出し、本発明を完成させた。 すなわち、本発明は以下の（１）〜（６）に記載の発明である。（１）非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施して得られることを特徴とする無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物。（２）非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段を施して得られることを特徴とする頻尿非ヒトモデル動物。（３）非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施すことを特徴とする無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物の作製方法。（４）非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段を施すことを特徴とする頻尿非ヒトモデル動物の作製方法。（５）上記（１）の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与することを特徴とする無菌性慢性前立腺炎に対する被験物質の評価方法。（６）上記（２）の頻尿非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与することを特徴とする頻尿に対する被験物質の評価方法。 本発明の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物は、無菌性慢性前立腺炎を正確に再現することができる。そのため、このモデル動物は、無菌性慢性前立腺炎の新たな治療法や、治療に有効な被験物質の評価やスクリーニング等に役立つ。 本発明の頻尿非ヒトモデル動物は、頻尿を再現することができる。そのため、このモデル動物は、頻尿の新たな治療法や、治療に有効な被験物質の評価やスクリーニング等に役立つ。実施例１におけるシャム群の膀胱内圧測定（single CMG）の結果を示す図面である。実施例１における骨盤うっ血群の膀胱内圧測定（single CMG）の結果を示す図面である。実施例１における骨盤うっ血＋去勢群の膀胱内圧測定（single CMG）の結果を示す図面である。実施例１における３群の膀胱容量、排尿量、残尿量、残尿率を比較した図面である（図面中、各バーは左から順にシャム群、骨盤うっ血群、骨盤うっ血＋去勢群である）。実施例１における３群の膀胱基線圧、最大膀胱収縮圧を比較した図面である（各図とも左から順にシャム群、骨盤うっ血群、骨盤うっ血＋去勢群である）。実施例１におけるシャム群の前立腺組織像である（図中、Ａは５０倍、Ｂは２００倍、Ｃは４００倍、Ｄは５０倍、Ｅは２００倍であり、ＢおよびＣはＡの拡大像、ＥはＤの拡大像である）。実施例１における骨盤うっ血群の前立腺組織像である（図中、Ａは５０倍、Ｂは２００倍、Ｃは４００倍、Ｄは５０倍、Ｅは２００倍であり、ＢおよびＣはＡの拡大像、ＥはＤの拡大像である）。実施例１における骨盤うっ血＋去勢群の前立腺組織像である（図中、Ａは５０倍、Ｂは２００倍、Ｃは４００倍、Ｄは５０倍、Ｅは２００倍であり、ＢおよびＣはＡの拡大像、ＥはＤの拡大像である）。 本発明の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物（以下、単に「本発明モデル動物」という）は、非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施して得られるものである。 本発明モデル動物に用いられる非ヒトオス動物とは、ヒト以外の動物のオス、好ましくはほ乳類の動物のオス、好ましくは齧歯類の動物のオスであり、より好ましくはラット、マウス、ハムスター等のオスであり、特に好ましくはオスラットである。 上記非ヒトオス動物に施す骨盤うっ血させる手段としては、骨盤をうっ血させることのできる手段であれば特に限定されないが、例えば、総腸骨静脈、内腸骨静脈、下大静脈等の血管を結紮する手段が挙げられる。これらの手段の中でも両側総腸骨静脈の結紮が好ましい。なお、血管を結紮させる方法は特に限定されず、例えば、血管を絹等の糸で縛る、血管に血管クリップをかけること等により行うことができる。 また、上記非ヒトオス動物に施すホルモンレベルを変化させる手段としては、非ヒトオス動物のホルモンレベルを変化させる手段であれば特に限定されないが、例えば、精巣を摘出することによる男性ホルモンレベルを減少させる手段、エストラジオール等の女性ホルモンの投与等による女性ホルモンレベルを増加させる手段等が挙げられる。これらの手段の中でも両側精巣の摘出が好ましい。なお、精巣の摘出は腹腔内から行うことができ、女性ホルモンの投与は皮下注射で行うことができる。 上記手段を非ヒトオス動物に施す順序は特に限定されず、例えば、骨盤うっ血させる手段を施してから、ホルモンレベルを変化させる手段を施せばよく、また、これらを同時に施してもよい。また、非ヒトオス動物にこれらの手段を施す前には、例えば、イソフルレン、ハロセン等を吸入させて麻酔をしておくことが好ましい。 本発明モデル動物を得る方法の好ましい態様としては、まず、オスラットに、イソフルレン、ハロセン等を吸入させ麻酔をした後、開腹して両側総腸骨静脈を絹糸または血管クリップで結紮し、次に、両側精巣を腹腔内に引き出して摘出した後、閉腹すればよい。閉腹後は頻尿等の症状が安定するまで４週間程度経過させることが好ましい。 上記の手段を施すことにより本発明モデル動物が得られる。本発明モデル動物は、無菌性慢性前立腺炎と、その代表的症状のひとつである頻尿も伴っているものであり、従来のモデル動物よりも正確に慢性前立腺炎を再現することができる。 なお、本発明モデル動物が、無菌性慢性前立腺炎となっているかどうかは、例えば、前立腺の組織像に炎症所見があり、感染の所見がないことで判断し、更に、発症（症状を呈する）しているかどうかは、例えば、頻尿となっていることで判断することができる。なお、頻尿なっているかどうかは、例えば、コントロールに比べて膀胱容量の減少、１回の排尿量の減少、排尿回数の増加等により判断することができる。 また、上記で得られた本発明モデル動物に対して被検物質を投与することにより無菌性慢性前立腺炎に対する被験物質の評価をすることができる。なお、被験物質としては、食品素材、化合物、生薬、漢方製剤、医薬品等が挙げられる。また、被験物質の評価方法には、各種の数値、画像の所見等を指標とした公知の評価方法を用いることができる。 具体的な被験物質の評価方法の例としては、本発明モデル動物やコントロールの膀胱容量、排尿量、残尿量、膀胱内圧、排尿回数等の膀胱機能の測定をしておき、被験物質を投与し、所定の時間経過後に再度前記測定をし、それらの数値等を比較することにより評価する方法が挙げられる。 また、上記評価方法の別の例としては、本発明モデル動物やコントロールに被験物質を投与し、その後前立腺組織像等を比較することにより評価する方法が挙げられる。なお、これらの評価方法は組み合わせることもできる。これらの評価により有効とされた被験物質は、無菌性慢性前立腺炎の治療薬となりうる。 なお、非ヒトオス動物に、上記手段のうち骨盤うっ血させる手段のみを施した場合には、頻尿ヒトモデル動物（以下、「本発明頻尿モデル動物」という）が得られる。 なお、本発明頻尿モデル動物が、頻尿となっているかどうかは、上記と同様に、例えば、コントロールに比べて膀胱容量の減少、１回の排尿量の減少、排尿回数の増加等により判断することができる。 また、上記で得られた本発明頻尿モデル動物に対して被検物質を投与することにより頻尿に対する被験物質の評価をすることができる。本発明頻尿モデル動物に対する被検物質の評価は、上記と同様にすることができ、例えば、本発明頻尿モデル動物やコントロールの膀胱容量、排尿量、残尿量、膀胱内圧、排尿回数等の膀胱機能の測定をしておき、被験物質を投与し、所定の時間経過後に再度前記測定をし、それらの数値等を比較することにより評価する方法が挙げられる。この評価により有効とされた被験物質は、頻尿の治療薬となりうる。 以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。実 施 例 １ 無菌性慢性前立腺炎に対するβ３作動薬の評価：（１）無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物の作製 ＳＤ系オスラット（９週齢）２４頭を用い、これにイソフルレン吸入麻酔下に以下の３群（各群８頭）を作製した。なお、両側総腸骨静脈結紮と両側精巣摘出は開腹創から行った。 シャム群 ：開腹シャムラット 骨盤うっ血群 ：両側総腸骨静脈結紮ラット 骨盤うっ血＋去勢群：両側総腸骨静脈結紮＋両側精巣摘出ラット（２）実験方法 上記の３群において、術後１ヶ月目にウレタン麻酔下（通常麻酔量の半量を使用）に膀胱頂部から膀胱瘻カテーテルを挿入し、拘束器に固定し、β３作動薬のミラベグロンを０.０３、０.３または３ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。ミラベグロンの投与前後に、膀胱内に生理食塩水を０.０５ｍｌ／分の速度で注入して膀胱内圧測定（single CMG）を行い、膀胱容量、排尿量、残尿量、膀胱内圧等の膀胱機能を比較した。なお、結果は平均±標準誤差で表し、Student's paired t-testまたはnon-paired t-testでp<0.05を有意とした。また、各群のラットの前立腺を摘出して組織像を比較した。（３）結果 膀胱内圧測定（single CMG）の結果を図１〜３に、膀胱容量、排尿量、残尿量、膀胱内圧等の膀胱機能の測定結果を表１〜６に、３群の膀胱容量、排尿量と残尿量の比較を図４に、３群の膀胱基線圧と最大膀胱収縮圧の比較を図５に示した。また、前立腺の組織像を図６〜８に示した。 膀胱内圧測定（single CMG）における膀胱容量はシャム群（０.５３±０.０４ｍｌ）に比べて骨盤うっ血群（０.３８±０.０７ｍｌ）と骨盤うっ血＋去勢群（０.３７±０.０８ｍｌ）で有意（何れもｐ＜０.０５）に少なかった。排尿量も同様に、シャム群（０.５２±０.０４ｍｌ）に比べて骨盤うっ血群（０.３５±０.０７ｍｌ）と骨盤うっ血＋去勢群（０.２８±０.０７ｍｌ）で有意（ｐ＜０.０１、ｐ＜０.０５）に少なかった。しかし、残尿量、残尿率、膀胱基線圧と最大膀胱収縮圧に群間差はなかった。 ミラベグロン投与後は３群とも膀胱容量が有意に増加した。排尿量も３群で増加傾向にあり、シャム群と骨盤うっ血＋去勢群で有意に増加した。残尿量も３群で増加傾向にあり、シャム群と骨盤うっ血で有意に増加した。残尿率は残尿量と同一傾向であった。膀胱基線圧はミラベグロンの影響を受けなかったが、最大膀胱収縮圧はシャム群と骨盤うっ血群で有意に低下した。 肉眼的には前立腺はシャム群と骨盤うっ血群に差はなかった。しかし、骨盤うっ血＋去勢群の前立腺は固く黄色化して脂肪変性しているようにみえた。組織像はシャム群と骨盤うっ血群の全例にわずかながら中等度の腺上皮の扁平化と腺腔の拡大がみられ、間質で軽度から中等度のうっ血あるいは充出血および水腫が観察された。シャム群と骨盤うっ血群の組織所見の程度に明らかな差はなかった。しかし、骨盤うっ血＋去勢群では脂肪細胞の壊死がみられ、リンパ球、好中球、マクロファージの侵潤、異物巨細胞の出現や石灰沈着がみられた。 以上の通り、骨盤うっ血群も、骨盤うっ血＋去勢群もシャム群に比べて膀胱容量と排尿料が有意に少なく、残尿量には差がなかった。また、何れの群もミラベグロン投与で膀胱容量、排尿量と残尿量が増加または増加傾向にあり、最大膀胱収縮圧は不変か低下した。 従って、骨盤うっ血群も骨盤うっ血＋去勢群も頻尿モデルとして使用できることがわかった。 また、前立腺組織像はシャム群と骨盤うっ血群に差がなく、骨盤うっ血＋去勢群で前立腺の著明な炎症像や脂肪壊死、切開沈着がみられた。従って、骨盤うっ血＋去勢群が骨盤うっ血に伴う無菌性慢性前立腺炎モデルとして使用できることがわかった。更に、今回の試験から頻尿は骨盤うっ血によりもたらされるが、無菌性前立腺炎は骨盤うっ血に性ホルモンレベルの変化が加味されて発症することが示唆された。 本発明モデル動物や本発明頻尿モデル動物は、無菌性慢性前立腺炎や頻尿の治療法を開発するために利用することができる。 以 上 非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施して得られることを特徴とする無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段が、総腸骨静脈の結紮である請求項１記載の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物のホルモンレベルを変化させる手段が、精巣の摘出である請求項１記載の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物が、オスラットである請求項１〜３の何れかに記載の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段を施して得られることを特徴とする頻尿非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段が、総腸骨静脈の結紮である請求項５記載の頻尿非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物が、オスラットである請求項５または６記載の頻尿非ヒトモデル動物。 非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施すことを特徴とする無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物の作製方法。 非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段を施すことを特徴とする頻尿非ヒトモデル動物の作製方法。 請求項１〜４の何れかに記載の無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与することを特徴とする無菌性慢性前立腺炎に対する被験物質の評価方法。 請求項５〜７の何れかに記載の頻尿非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与することを特徴とする頻尿に対する被験物質の評価方法。 【課題】無菌性慢性前立腺炎を再現可能な非ヒトモデル動物を提供し、更には、その非ヒトモデル動物を利用して、慢性前立腺炎に対して有効な被検物質を評価する方法を提供する。【解決手段】非ヒトオス動物に骨盤うっ血させる手段と、ホルモンレベルを変化させる手段を施して得られることを特徴とする無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物および前記無菌性慢性前立腺炎非ヒトモデル動物に対して被検物質を投与することを特徴とする無菌性慢性前立腺炎に対する被験物質の評価方法。【選択図】なし