生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_ペルオキシナイトライト生成抑制剤 |
| 出願番号： | 2012190357 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | A61K 36/00,A61K 36/18,A61K 36/28,A61P 31/04 |
特許情報キャッシュ
金 辰也 JP 2014047154 公開特許公報(A) 20140317 2012190357 20120830 ペルオキシナイトライト生成抑制剤 株式会社ファンケル 593106918 長谷部 善太郎 100122954 佐藤 荘助 100150681 山田 泰之 100162396 児玉 喜博 100105061 金 辰也 A61K 36/00 20060101AFI20140218BHJP A61K 36/18 20060101ALI20140218BHJP A61K 36/28 20060101ALI20140218BHJP A61P 31/04 20060101ALI20140218BHJP JPA61K35/78 BA61K35/78 CA61K35/78 TA61P31/04 9 1 ＯＬ 10 4C088 4C088AB02 4C088AB26 4C088AB81 4C088AC02 4C088AC05 4C088AC13 4C088CA05 4C088CA06 4C088CA08 4C088NA14 4C088ZB35 4C088ZC41 本発明は、マクロファージのペルオキシナイトライト生成を抑制する剤に関する。 生体内では一酸化窒素は、一酸化窒素合成酵素 (NOS) によってアルギニンと酸素とから合成される。一酸化窒素は細胞内の可溶型グアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックGMP (cGMP) を合成させることによりシグナル伝達に関与する。この機構を介して一酸化窒素は生体内の様々な器官で種々の機能の発現を担っている。 例えば、血管内皮は一酸化窒素をシグナルとして周囲の平滑筋を弛緩させ、それにより動脈を拡張させて血流量を増やす。この作用は、ニトログリセリン、亜硝酸アミル、一硝酸イソソルビド（5-ISMN,アイトロール(R)）などの亜硝酸誘導体の心臓病の治療の基本的な作用機構である。これらの亜硝酸化合物は血流内で一酸化窒素に変化し、心臓の冠動脈を拡張させて血液供給を増やす。 また、発毛剤ミノキシジル（商品名：リアップ）は cGMP分解を抑制して毛細血管の血流量を増やす。一酸化窒素は陰茎の勃起機構にも係わっており、やはり cGMP分解抑制薬であるシルデナフィル（商品名：バイアグラ）はこのメカニズムを利用したものである。 一酸化窒素を気管内に吸入させることにより、肺動脈の血管平滑筋を弛緩させ、肺高血圧を改善させることができる。特に新生児の新生児遷延性肺高血圧や、開心術後の心臓の負荷軽減、原発性肺高血圧症の治療などに利用される。 免疫系於いては、マクロファージは病原体を殺すために一酸化窒素を産生する。 特に細菌感染に伴い細菌細胞壁由来のリポポリサッカライド（LPS、エンドトキシン）が、マクロファージの一酸化窒素産生を刺激し、その結果血管内皮細胞の産生する一酸化窒素の30倍以上の大量な一酸化窒素が全身的に産生され、その結果急激な血圧低下や微小血栓の形成などを伴う敗血症を発症する。敗血症の進展に伴って、全身の線溶系異常がおこり、播種性血管内凝固症候群（DIC）が誘発され、その結果多臓器不全を起こして死に至る場合もある。すなわち敗血症に伴う一酸化窒素に係わる免疫系の異常は、そのまま線溶系の異常につながっている。 このように、一酸化窒素の生物機能は多岐にわたっており、一酸化窒素の生体内での分泌を制御することで種々の疾患の治療や予防効果が期待できる。このためいくつかの提案がすでになされている。特許文献１（特開２０１０−２５４５８９号公報）には、一酸化窒素の前駆物質であるシトルリンやアルギニン又はアルギノコハク酸を投与して、ドライマウス患者の一酸化窒素分泌量を増加させ、それによってドライマウスやドライアイを改善しようとする試みが提案されている。特許文献２（特開２００８−２５５０７５号公報）はハイペロサイドとイソクエルシトルリンの混合物を投与して、血管内皮細胞の一酸化窒素分泌を促進させることによって血管内皮機能を改善し動脈硬化や高血圧の予防を行う試みが提案されている。また特許文献３（特開２０００−２９０１９８号公報）には一酸化窒素の産生を抑制することで、血管の透過性と血管の拡張を抑制し、花粉症によるくしゃみや鼻汁の分泌を抑制しようという試みが提案されている。 特許文献４（特開２００３−３３５６８９号公報）には、上述したNOS阻害作用を有するプロポリスを一酸化窒素合成酵素阻害剤として利用し、敗血症やエンドトキシンショックなど各種疾患の治療に利用できることが開示されている。特許文献５（特開平１１−３１０５３０号公報）にはケリドニン、コリノリン、サンギナリン、プロトピン、コリダリン、ベルベリン誘導体等を一酸化窒素産生抑制剤として使用し、敗血症性ショック、低血圧症、炎症性組織障害、虚血性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、慢性関節リウマチまたはインスリン依存性糖尿病の予防・治療剤として利用することが提案されている。また特許文献６（特開平１１−２２２４３５号公報）には、Ｎ−（２−ｎ−ブチルピラゾロ〔１，５−ａ〕−１，３，５−トリアジン−４−イル）−２，３，４−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチル−９Ｈ−プリン−６−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミド、Ｎ−（２−ｎ−ブチルチエノ〔３，２−ｄ〕ピリミジン−４−イル）−３，４，５−トリメトキシベンズアミドを前述のNOS阻害剤として利用したエンドトキシンショックの治療剤が提案されている。 総じて一酸化窒素には良い作用と悪い作用があり、良い作用は、cGMPを分解抑制することによる血圧降下、抗血小板および勃起などである。 悪い作用は、ペルオキシナイトライトを生成し、チロシンをニトロ化することによる敗血症、炎症及び神経毒性を惹起するなどである。血管内皮細胞やマクロファージでは、細菌性のリポポリサッカライド（LPS）の刺激によってNOとスーパーオキシド（O2-）が同時に発生する。 NOは、スーパーオキシドを捕捉し、スーパーオキシドを消去する。しかし、この際に、ペルオキシナイトライト（パーオキシナイトライト：peroxynitrite：ONOO-）という、より強力な酸化力や毒性を持つラジカルが生成され、生体により強い障害を与えることとなる）。 こうした２面性を有する窒素酸化物に対して、生体機能を増強させる上で、必要な「一酸化窒素」は産生促進し、不要な「ペルオキシナイトライト」は生成抑制する剤が求められていた。特開２０１０−２５４５８９号公報特開２００８−２５５０７５号公報特開２０００−２９０１９８号公報特開２００３−３３５６８９号公報特開平１１−３１０５３０号公報特開平１１−２２２４３５号公報 本発明の課題は天然物由来のマクロファージのペルオキシナイトライト産生を抑制する剤を提供することである。また、マクロファージのペルオキシナイトライト産生を抑制することで、LPSなどのエンドトキシンによる敗血症の予防治療剤を提供することである。 本発明者らは、敗血症の原因となるLPSによって誘導されるマクロファージの産生する一酸化窒素により生成するペルオキシナイトライトを抑制する天然物を探索したところ、カレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）に強い抑制効果を見出した。すなわち本発明の主な構成は以下のとおりである。（１）カレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）のいずれかの抽出物を有効成分とするLPSによって誘導されるマクロファージのペルオキシナイトライト生成抑制剤。（２）カレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）のいずれかの抽出物を有効成分とする敗血症予防治療剤。（３）抽出物が水又は有機溶媒抽出物である（１）又は（２）の剤。（４）有機溶媒がアルコールである（１）〜（３）のいずれかに記載の剤。（５）アルコールがエチルアルコールである（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。（６）アルコールが含水エチルアルコールである（１）〜（５）記載の剤。（７）経口剤である（１）〜（６）のいずれかに記載の剤。（８）錠剤の形態である（１）〜（７）のいずれかに記載の剤。（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の剤を添加した飲食品、又は動物用飼料。 本発明の有効成分であるカレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）抽出物は、LPSによって誘導されるマクロファージからの一酸化窒素の産生によるペルオキシナイトライト生成を抑制し、細菌感染による敗血症の予防や治療に効果を有する。カレープラント抽出物のマクロファージ様細胞をLPSで刺激したときのペルオキシナイトライト生成を抑制する効果を確認したグラフである。イチョウ葉エキス、ショウガエキスのマクロファージ様細胞をLPSで刺激したときのペルオキシナイトライト生成を抑制する効果を確認したグラフである。 以下、本発明を詳細に説明する。 カレープラント（学名: Helichrysum italicum、英語: curry plant）はキク科に属する多年草の一種である。葉茎からカレーの香りがするためカレープラントと呼ばれる。イモーテル、エバーラスティングともいう。本発明で用いる抽出物は、カレープラント地上部が好適である。また、カレープラントの植物体はそのままの形態で抽出してもよい。抽出効率を高めるために好ましくは乾燥させて粉砕して抽出する。 イチョウ（銀杏、公孫樹、鴨脚樹、学名：Ginkgo biloba）は、裸子植物の1種であり、中国原産の落葉高木であり、夏季に採取した葉を用いる。抽出効率を高めるために好ましくは乾燥させて粉砕して抽出する。 ショウガ (Zingiber officinale) はショウガ科の多年草である。熱帯アジア原産で、地下に根茎があり、地上には葉だけが出る。ショウガは全草を利用可能であるが、根茎の利用が好ましい。抽出に当たっては、抽出効率を高めるために好ましくは乾燥させて粉砕して抽出する。 なお、イチョウ及びショウガは生薬原料として市販されている生薬エキスなどを用いることもできる。 抽出には、溶媒抽出や圧搾抽出等種々の抽出方法を用いることができるが、好ましくは、溶媒抽出を用いることができる。抽出に使用される溶媒としては、水、エチルアルコール、エーテル、アセトン、ヘキサン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン等が挙げられるがこれに限定されるものではない。これらの溶媒の中から１種または２種以上選択して使用するが、安全性の見地から、水、エチルアルコールが好ましく、更に好ましくは、水とエチルアルコールの混合物、例えば1〜99%のエチルアルコール水溶液、特に20〜80%のエチルアルコール水溶液を使用することが好ましい。 抽出方法は、植物体の粉砕物100gに対して0.1〜10リットル、好ましくは1リットルの溶媒を加え、1時間〜1週間、室温にて放置、あるいは抽出効率を高めるため攪拌する。あるいは溶媒を加温してもよい。 抽出は不溶物と抽出液を濾過あるいは沈降法等により分離する。好ましくは、不溶物は同様の抽出操作を繰り返し、適当な濃縮処理により、例えばエバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより濾別後、濾液を濃縮し濃縮液を得ることが出来る。さらに濃縮液を凍結乾燥させて濃縮乾固物を得ることも出来る。さらには、カラムクロマトグラフィー等各種のクロマトグラフィー等、植物成分の分離、抽出に利用される公知の方法を用いて有効成分を分画し、その純度を高めてもよい。 上述のようにして得られる抽出物は、LPSによって誘導されるマクロファージのペルオキシナイトライト生成抑制剤又は敗血症の予防治療剤としてそのまま直接使用してもよいが、種々の剤型での投与が可能であり、一般的には薬学的に許容される適当な液体担体に溶解するか若しくは分散させ、または薬学的に許容される適当な粉末担体と混合するか若しくはこれに吸着させ、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の経口投与剤や、座薬や点滴剤などの非経口投与剤として使用できる。投与量は患者の症状や年齢に応じて適宜変更できるが、1日当たり、乾燥抽出物0.01〜1000mg/kg体重の範囲で用いればよく、更に0.1〜100mg/kg体重の範囲で用いるのが好ましい。 また、本発明のLPSによって誘導されるマクロファージのペルオキシナイトライト生成抑制剤又は敗血症の予防治療剤は、通常の飲食品に抽出物を添加することもできる。例えば、チョコレート、キャンディ、ゼリー、ビスケット、チューインガム、アイスクリーム、シャーベット、氷菓、和菓子等の菓子、清涼飲料、ジュース、ウーロン茶等の飲料、畜肉加工品、魚肉・水産加工肉、乳・卵加工品、野菜加工品、穀類加工品、冷凍食品、調味料、スプレッド等の飲食品に用いることができる。添加量は、対象の飲食品に対して重量を基準として乾燥抽出物を0.01〜10%、好ましくは0.05〜5%の範囲で添加するのが好ましい。 以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。 各抽出物のLPSによって誘導されるマクロファージのペルオキシナイトライト生成抑制効果確認試験[材料] カレープラントの抽出物は以下の方法で調製した。 地上部全草を採取したカレープラントは乾熱乾燥を経て室温保管した乾燥物を使用した。採取物に対する植物乾燥物の乾燥歩留は15%から30%の範囲で、一般的な植物の乾燥歩留と大差無かった。 カレープラント水抽出物（以下CPW）はカレープラント乾燥物1Kgを1時間60℃の温水10Kgに浸漬して抽出した抽出液を減圧濃縮により固形化し、ドラムドライヤーにて加熱乾燥させた固形物にして使用した。 カレープラント40%エチルアルコール抽出物（以下CPEt）は、カレープラント乾燥物1Kgを室温で1時間40%（v/v）エチルアルコール10Kgに浸漬して得た抽出液を減圧濃縮により固形化し、ドラムドライヤーにて加熱乾燥させた固形物にして用いた。 またショウガは市販のしょうがエキス（ジンジャーパウダーHG；富士フレーバー（株）製、以下「Shoga」）、イチョウは市販のイチョウ葉エキス（ギンコロン−24F；（株）常盤植物化学研究所製、以下「Ichou」）を用いた。＜試験例＞マウス由来マクロファージ様細胞株（RAW264.7）におけるLPS刺激時のPeroxynitrite（ONOO-）消去能 細胞株はATCCより購入したマクロファージ様細胞株（RAW264.7）を10%FBS含有D-MEM（Wako,低グルコース、グルタミン含有、フェノールレッド含有）で継代培養した。平板6ウェルプレートに5×105cell/wellの細胞密度で播種して24時間37℃5%CO2インキュベーター中で培養して細胞を定着させた。その後、培地をフェノールレッドフリーD−MEM（Sigma）に置換して、各試験サンプルを30、10μg/ml添加（IchouとShogaは30、10、3μg/ml）しつつ、同時添加で細菌毒素であるLipopolysaccharides(LPS) from E.coli0111:B4(ゲル濾過処理）（Sigma社製）を1μg/mlの濃度で添加し、RAW264.7におけるiNOS（誘導型一酸化窒素合成酵素）を刺激した。その後、48時間37℃5%CO2インキュベーターで培養した。 培養終了直後の培養液を回収し、NO2/NO3Assay Kit FX（同仁化学）で溶液中のPeroxynitrite（ペルオキシナイトライト）量を求め、各群n=3でmean±S.D.表記して各群比較した。結果 図１にカレープラント抽出物による効果、図２にイチョウエキス、ショウガエキスの試験結果を示す。各試料はいずれも濃度依存的にLPSによって誘導されるマクロファージのペルオキシナイトライト生成を抑制することが確認できた。したがって、本発明は敗血症の予防治療効果を有することが明らかとなった。処方例１（錠剤） カレープラント水抽出物 ４０．０ 乳糖 ４０．０ コーンスターチ １９．０ シュガーエステル １．０ １００．０重量％処方例２（錠剤） カレープラント４０％エチルアルコールの抽出物 １０．０ Ｄ−マンニトール ３５．０ 乳糖 ４０．０ 結晶セルロース １０．０ ヒドロキシプロピルセルロース ５．０ １００．０重量％処方例３（散剤） カレープラントの水抽出物 ２０．０ コーンスターチ ２５．０ 乳糖 ５５．０ １００．０重量％処方例４（カプセル剤） カレープラントエチルアルコール抽出物 ５０．０ 乳糖 ４８．０ ステアリン酸マグネシウム ２．０ １００．０重量％ 上記成分を均一に混合し次いで造粒し、その造粒物をハードカプセルに充填した。処方例５（シロップ剤） カレープラントの４０％エチルアルコール抽出物 ０．１ 精製水 ６９．８ 単シロップ ３０．０ 炭酸カルシウム ０．１ １００．０重量％処方例６（錠菓） 砂糖 ７６．６ グルコース １８．０ ショ糖脂肪酸エステル ０．２ 香料 ０．２ 処方例１の抽出物 ５．０ １００．０ 重量％処方例７（飲料） 果糖ブドウ糖液糖 ５．００ 砂糖 ４．５０ 酸味料 １．２８ 香料 ０．２０ カレープラントの水抽出物 ０．０２ 水 ８９．００ １００．００重量％処方例８（飲料） オレンジ果汁 ８０．０ 砂糖 １１．７ 酸味料 ２．０ 香料 １．０ カレープラントのエチルアルコール抽出物 ０．０００５ 水 残余 １００．０重量％処方例９（錠剤） ショウガエキス（ジンジャーパウダーHG；富士フレーバー製） ４０．０ 乳糖 ４０．０ コーンスターチ １９．０ シュガーエステル １．０ １００．０重量％処方例１０（錠剤） イチョウ葉エキス（ギンコロン−24F；常盤植物化学研究所製） １０．０ Ｄ−マンニトール ３５．０ 乳糖 ４０．０ 結晶セルロース １０．０ ヒドロキシプロピルセルロース ５．０ １００．０重量％ カレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）のいずれかの抽出物を有効成分とするLPSによって誘導されるマクロファージのペルオキシナイトライト生成抑制剤。 カレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）のいずれかの抽出物を有効成分とする敗血症予防治療剤。 抽出物が水又は有機溶媒抽出物である請求項１又は請求項２の剤。 有機溶媒がアルコールである請求項１〜請求項３のいずれかに記載の剤。 アルコールがエチルアルコールである請求項１〜請求項３のいずれかに記載の剤。 アルコールが含水エチルアルコールである請求項１〜請求項５記載の剤。 経口剤である請求項１〜請求項６のいずれかに記載の剤。 錠剤の形態である請求項１〜請求項７のいずれかに記載の剤。 請求項１〜請求項８のいずれかに記載の剤を添加した飲食品、又は動物用飼料。 【課題】天然物由来のマクロファージの一酸化窒素産生を抑制する剤を提供する。【解決手段】カレープラント（Helichrysum italicum）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ショウガ（Zingiber officinale）のいずれかの抽出物をマクロファージのペルオキシナイトライト生成抑制剤とする。【選択図】 図１