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猪田 利夫 森 陽子 川瀬 一朗 JP 5789426 特許公報(B2) 20150807 2011135181 20110617 表皮ターンオーバー促進剤 エスエス製薬株式会社 000102496 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 猪田 利夫 森 陽子 川瀬 一朗 20151007 A61K 31/192 20060101AFI20150917BHJP A61K 31/196 20060101ALI20150917BHJP A61P 17/16 20060101ALI20150917BHJP A61P 43/00 20060101ALI20150917BHJP A61K 8/44 20060101ALI20150917BHJP A61K 8/36 20060101ALI20150917BHJP A61Q 19/08 20060101ALI20150917BHJP A61Q 19/00 20060101ALI20150917BHJP JPA61K31/192A61K31/196A61P17/16A61P43/00 107A61K8/44A61K8/36A61Q19/08A61Q19/00 Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｑ ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ） ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） 特開平０２−０１７１１５（ＪＰ，Ａ） 特開平０８−０９９８２２（ＪＰ，Ａ） 特開平１０−２７９４６８（ＪＰ，Ａ） 特開平１０−２７９４６４（ＪＰ，Ａ） 米国特許出願公開第２０１１／００２０４１４（ＵＳ，Ａ１） 特開２００９−２２７６３２（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−２１２０５２（ＪＰ，Ａ） 特開２００２−２０１１２２（ＪＰ，Ａ） 特表平０７−５０１５４０（ＪＰ，Ａ） 特表平０７−５０１５４１（ＪＰ，Ａ） 特開２０１３−００１６４２（ＪＰ，Ａ） 特開２０１３−０８２６３１（ＪＰ，Ａ） 日本薬学会第１２９年会要旨集，２００９年，Vol.3，p.223，28P-pm278 Biological and Pharmaceutical Bulletin，２００８年，Vol.31, No.1，p.33-37 2 2013001684 20130107 9 20140521 深谷 良範 本発明は、表皮のターンオーバーを促進して皮膚を正常化する薬剤及び化粧品に関する。 皮膚は、生体と外界との境界壁として種々の機能を有している。すなわち、外部からの物理的力に対する保護作用、化学的刺激や病原微生物に対する保護作用、紫外線に対する保護作用等を有する。また組織からの水分や生体成分の損失を防ぎ、体温調節も行っている。 これらの機能のうちのほとんどは、表皮の最外層である角層が担っている。すなわち、表皮機能を形成する上で最も重要な役割を果たす表皮細胞は、表皮の最も内側の基底層で分裂増殖し、有棘細胞、顆粒細胞と形を変え、タンパク質や脂質などを合成、分泌しながら、最終分化して角質細胞となり最外層である角層を形成し、その後垢となって脱落するというターンオーバーを繰り返している。このターンオーバーにより、表皮機能が維持されていると考えられている。 しかし、乾燥、紫外線、化学物質等の外的要因及び酸化ストレスや加齢などの内的要因により、表皮のバリア機能が低下することが知られており、これらの要因により表皮のターンオーバーが低下することも知られている。 このような観点から、表皮のターンオーバーを促進して皮膚を正常化しようとする試みはいくつかなされており、種々の植物抽出物、ヒドロキシカルボン酸、トラネキサム酸、魚鱗等が報告されている（特許文献１〜３）。レチノイン酸及びその誘導体、あるいはその受容体作動薬が、表皮のターンオーバーを促進するとの知見もあるが（非特許文献１〜３）、これらは紅斑の誘発、表皮の肥厚といった好ましからぬ副作用を有している。特開平０８−２５９４２０号公報特開平０８−２５９４４３号公報特開２０００−２４７８９４号公報吉村 浩太郎，日皮会誌，１１０，ｐ．２１８５−２１９０，２０００医薬品インタビューフォーム，オルセノン 軟膏０．２５％，２０１０年改定医薬品インタビューフォーム，ディフェリンゲル０．１％，２００９年改定 しかしながら、これら従来の組成物では、表皮のターンオーバー促進作用は十分でなく、あるいは副作用が強く、さらに新たな薬剤、化粧品が望まれていた。 従って、本発明の課題は、表皮のターンオーバーを促進し、皮膚の機能を正常化できる薬剤、化粧品を提供することにある。 そこで本発明者は、種々の薬物についての表皮のターンオーバーに対する作用を検討したところ、非ステロイド系抗炎症剤のうち、ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンが優れた表皮基底細胞の増殖促進活性を有し、表皮を肥厚させる副作用を生じないことから、これらの成分が表皮のターンオーバー促進剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩を有効成分とする表皮ターンオーバー促進剤を提供するものである。 また本発明は、ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩を有効成分とする表皮細胞増殖促進剤を提供するものである。 また本発明は、ジクロフェナク、フェルビナク、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩を有効成分とする皮膚老化防止剤を提供するものである。 ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩は、若年者又は老年者の表皮基底細胞の増殖を促し、かつ表皮を肥厚促進しないことから、表皮ターンオーバー促進剤として有用である。従って本発明の表皮ターンオーバー促進剤を皮膚に適用すれば、肌あれ、皮膚の老化、沈着した色素の排出、皮膚のバリア機能等が改善され、医薬品、化粧品として有用である。ジクロフェナクナトリウム（ＤＦ−Ｎａ）、フルルビプロフェン（ＦＬＢ）、イブプロフェン（ＩＢＵ）、ケトプロフェン（ＫＴＰ）及びロキソプロフェンナトリウム（ＬＸＰ）各製剤をヘアレスマウス皮膚に５日間塗布したときのＰＣＮＡ染色皮膚切片像を示す。ＤＦ−Ｎａ、ＦＬＢ、ＩＢＵ、ＫＴＰ及びＬＸＰ各製剤をヘアレスマウス皮膚に５日間塗布したときのＰＣＮＡ陽性細胞数を示す。ＤＦ−Ｎａ、ＦＬＢ、ＩＢＵ、ＫＴＰ及びＬＸＰ各製剤をヘアレスマウス皮膚に５日間塗布したときの表皮の厚さを示す。週齢の異なるヘアレスマウス皮膚基底細胞におけるＰＣＮＡ陽性細胞数及びＤＦ−Ｎａによるその回復効果を示す。 本発明の表皮ターンオーバー促進剤、表皮細胞増殖促進剤及び皮膚老化防止剤の有効成分は、ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩である。ジクロフェナクは、２−（２−（２，６−ジクロロフェニルアミノ）フェニル酢酸であり、フェルビナクは４−ビフェニル酢酸であり、イブプロフェンは２−（ｐ−イソブチルフェニル）プロピオン酸であり、ケトプロフェンは２−（３−ベンゾイルフェニル）プロピオン酸であり、これらはいずれも非ステロイド系抗炎症剤として知られている。しかし、これらの抗炎症剤が、表皮細胞の増殖及び表皮のターンオーバーを促進する作用を有することは知られていない。 ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、及びロキソプロフェンの塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。 ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はこれらの塩は、自体公知の合成方法により製造することができる。 ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、及びロキソプロフェンと類似の作用を発揮すると期待されるものとして、サリチル酸、アスピリン、サリチルアミド、フルフェナム酸、メフェナム酸、スリンダク、インドメタシン、アンフェナク、アセメタシン、プログルメタシン、ナブメトン、エトドラク、モフェゾラク、フルルビプロフェン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、ナプロキセン、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、ブコローム、ピロキシカム、アンピロキシカム、テノキシカム、メロキシカム、ロルノキシカム及びその塩などの非ステロイド系抗炎症剤が挙げられる。 本発明の表皮ターンオーバー促進剤、表皮細胞増殖促進剤及び皮膚老化防止剤（以下、表皮ターンオーバー促進剤等という）は、皮膚のターンオーバーを促進して低下した皮膚の機能を回復するための医薬、医薬部外品又は化粧品である。本発明により回復する低下した皮膚機能としては、肌あれ、皮膚の老化（シミ、ソバカス、しわなど）が挙げられる。 本発明の表皮ターンオーバー促進剤等の投与形態は、外用剤、内服剤など任意の公知の投与経路で投与されうるが、皮膚外用剤の形態が好ましい。当該皮膚外用剤としては、水溶液、Ｗ／Ｏ型又はＯ／Ｗ型エマルション、軟膏等が挙げられる。より具体的には、クリーム、乳液、化粧水、パック、ジェル、シート、パップ、軟膏、テープ、硬膏、リニメント、ローション、エアゾール、パウダー等が挙げられる。なお、内服剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、液剤、トローチ剤、ゼリー剤等が挙げられる。 本発明の表皮ターンオーバー促進剤等中のジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェンケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩の含有量は、剤形によっても異なるが、０．００１〜２０質量％が好ましく、さらに０．１〜１０質量％がより好ましい。これらの含有量とすることにより、良好な表皮ターンオーバー促進作用が得られるとともに、皮膚刺激、表皮細胞等の副作用も生じない。 本発明の表皮ターンオーバー促進剤等には、上記成分の他、従来公知の美白成分など、例えばアスコルビン酸及びその誘導体、プラセンタエキス、ハイドロキノン及びその配糖体、コウジ酸、トラネキサム酸、エラグ酸、レチノイン酸及びその誘導体、あるいはその受容体作動薬等を配合することができる。また、さらに、保湿剤、着色顔料、防腐剤、シリコーン油、炭化水素類、植物油、ロウ類、エステル油、低級アルコール、高級アルコール、界面活性剤、抗酸化剤、増粘剤、中和剤、紫外線吸収剤、紫外線防御剤等を配合することができる。 本発明の表皮ターンオーバー促進剤等は、経口または皮膚に適用すればよく、その適用量は投与経路によっても異なるがジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩の量として通常１日あたり１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度が好ましい。 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１（表皮細胞増殖促進試験） ヘアレスマウス皮膚を用い、細胞増殖マーカーであるＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）発現を評価することで表皮の細胞増殖促進作用を有する成分の探索を行った。 ＰＣＮＡは、核内増殖抗原で、ＰＣＮＡ合成レベルは、細胞周期中の細胞増殖及びＤＮＡ合成の程度に相関すると言われている。ＰＣＮＡは非増殖細胞中では非常に低いレベルで存在しており、長い休止期のために細胞を静止状態に保つが、細胞が細胞分裂周期に入るとＰＣＮＡレベルは急激に増加する。これを利用して非増殖細胞集団から増殖細胞集団への移行を検出することが可能である。Ａ．試験方法（１）動物 ＨＲ−１ヘアレスマウス♂１６匹、５−２０週齢（２）被験物質 ジクロフェナクナトリウム、フェルビナク、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンナトリウム なお、陽性対照としてディフェリン（レチノイン酸受容体作動薬）０．１％含有外用剤を用いた。（３）投与方法 マウス１頭あたり１製剤を背部に１日１回、５日間塗布した（５回塗布）。また、何も処置しない無処置も実施した。塗布量は、１製剤あたり３０μＬとした。無処置及び製剤塗布群の内容を下記に示した。 １：無処置（略号：ＮＴ） ２：陽性対照（レチノイン酸受容体作動薬ディフェリン０．１％含有外用剤、略号：ＰＣ） ３：ジクロフェナクナトリウム１％含有外用剤（略号：ＤＦ−Ｎａ） ４：フェルビナク３％含有外用剤（略号：ＦＬＢ） ５：インドメタシン１％含有外用剤（略号：ＩＭ） ６：イブプロフェン２％含有外用剤（略号：ＩＢＵ） ７：ケトプロフェン３％含有外用剤（略号：ＫＴＰ） ８：ロキソプロフェンナトリウム１％含有外用剤（略号：ＬＸＰ）（４）組織切片の作成及び免疫染色 最終塗布後、３日目に皮膚を約１ｃｍ四方採取し、１０％中性ホルマリン液で一晩固定した。固定した皮膚切片は、自動固定包埋装置（ＲＨ−１２、サクラ）にて、パラフィン包埋を行った。 パラフィン包埋後、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（サクラ）にてパラフィンブロックを作成した。その後、ミクロトーム（ＲＯＭ−３８０、Ｙａｍａｔｏ）を用いて２−３μｍの厚さで薄切し、スライドグラスに貼り付け、４０℃で一晩乾燥し、脱パラフィンを行い標本を作成した。 ＰＣＮＡ免疫染色法に先立ち、３％Ｈ2Ｏ2（ＭｅＯＨ）で１０分浸し、その後、リン酸緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で３回洗浄（１回あたり２分）した。ＰＣＮＡ免疫染色は、ＰＣＮＡ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従って行った。作成した切片は、光学顕微鏡（ＢＩＯＺＥＲＯ、Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて観察した。（５）データ解析・ＰＣＮＡ陽性及び陰性細胞のカウント ＰｈｏｔｏＳｈｏｐＣＳ４（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、撮影した画像を基に解析した。サンプルあたり、異なる５枚の画像から、基底細胞全数をカウントし、ＰＣＮＡ免疫染色法によって茶色に染色された基底細胞（ＰＣＮＡ陽性細胞）の割合を求めた。・表皮の厚さ ＰｈｏｔｏＳｈｏｐＣＳ４（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、撮影した画像を基に解析した。サンプルあたり、異なる３−５枚の画像から、それぞれ１０か所の表皮の厚さを測定し（計３０−５０データ）、その平均値とＳＤ（標準偏差）を求めた。Ｂ．結果 無処置、製剤塗布及び陽性対照塗布時における塗布部位の皮膚切片像を図１に示した。このときのＰＣＮＡ陽性細胞数を図２、表皮の厚さの計測値を図３に示した。 無処置に比べ、ジクロフェナクナトリウム、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンナトリウム塗布及び陽性対照塗布で、基底細胞中におけるＰＣＮＡ陽性細胞数が増加していることが観察された。ケトプロフェンでは、他製剤塗布よりも若干低い値を示し、インドメタシンではマウスが死亡した。全基底細胞数に対するＰＣＮＡ陽性細胞の割合は、ジクロフェナクナトリウム、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンナトリウム塗布及び陽性対照塗布で、著しく増加していることが分かる。ＰＣＮＡは細胞増殖のマーカーであることから、細胞増殖活性が活発に行われていることを示している。 撮影した画像を基に表皮の厚さを測定し（計３０−５０データ）、その平均値とＳＤを求めた。陽性対照塗布では、無処置に比べ、表皮の厚さの著しい増加が認められた。陽性対照塗布と比較すると、ジクロフェナクナトリウム、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンナトリウム塗布における表皮の厚さの増加は低い値であった。陽性対照であるアダパレンはレチノイン酸受容体作動薬である。レチノイン酸類は皮膚のターンオーバーを促進するが、表皮の肥厚（表皮の厚さの増加）や、炎症を惹起する副作用もある。ジクロフェナクナトリウム、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンナトリウムは細胞増殖を促進するが、明確な肥厚は認められておらず、その作用はレチノイン酸類とは異なるメカニズムを介しているものと推察された。実施例２ ヘアレスマウス皮膚を用い、細胞増殖マーカーであるＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）発現を評価することで、加齢に伴う表皮の細胞増殖活性を検討した。また、実施例１で効果があったジクロフェナクナトリウムの影響についても検討した。Ａ．試験方法（１）動物 ＨＲ−１ヘアレスマウス♂８匹、５−２０週齢（２）被験物質 ジクロフェナクナトリウム（３）投与方法 １９−２０週齢のマウス背部に１日１回、５日間塗布した（５回塗布）。また、５、８、１９−２０週齢の各無処置群を設けた。（４）投与群 １：５週齢、無処置（略号：５Ｗ） ２：８週齢、無処置（略号：８Ｗ） ３：１９−２０週齢、無処置（略号：１９−２０Ｗ） ４：１９−２０週齢、ジクロフェナクナトリウム１％含有外用剤（略号：１９−２０Ｗ＿ＤＦ−Ｎａ）（５）組織切片の作成及び免疫染色 実施例１と同様に行った（６）データ解析 ＰｈｏｔｏＳｈｏｐＣＳ４（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、撮影した画像を基に解析した。サンプルあたり、異なる５枚の画像から、基底細胞全数をカウントし、ＰＣＮＡ免疫染色法によって茶色に染色された基底細胞（ＰＣＮＡ陽性細胞）の割合を求めた。Ｂ．結果 各週齢の無処置ヘアレスマウスのＰＣＮＡ陽性細胞数並びに１９−２０週齢ヘアレスマウスにジクロフェナクナトリウムを５日間塗布したときのＰＣＮＡ陽性細胞数を図４に示した。 無処置ヘアレスラットにおける表皮基底細胞のＰＣＮＡ陽性細胞数は、５週齢では著しく高かったが、８週齢ではそれより低く、１９−２０週齢では５週齢の１／２以下に低下していた。表皮の細胞増殖活性は加齢に伴い低下することが示唆された。一方、１９−２０週齢ヘアレスマウスにジクロフェナクナトリウムを５日間塗布することで、５週齢ヘアレスマウスと同程度のＰＣＮＡ陽性細胞数となった。このことから、ジクロフェナクナトリウムは、皮膚のターンオーバーを促進することで、老化した皮膚機能を回復する働きがあると思われた。 また、ジクロフェナクナトリウム同様実施例１で活性を示した抗炎症剤フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェンナトリウムについても同様の効果があると推察される。 ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩を有効成分とする表皮ターンオーバー促進剤。 ジクロフェナク、フェルビナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン又はそれらの塩を有効成分とする表皮細胞増殖促進剤。

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