生命科学関連特許情報
| タイトル： | 再公表特許(A1)_高いスクワレン産生能を有する新規微生物及びこれによるスクワレンの製造方法 |
| 出願番号： | 2011078603 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C12N 1/12,C12P 5/02,C12R 1/89 |
特許情報キャッシュ
渡邉 信 彼谷 邦光 志甫 諒 中澤 敦 井上 勲 本多 大輔 JP WO2012077799 20120614 JP2011078603 20111209 高いスクワレン産生能を有する新規微生物及びこれによるスクワレンの製造方法 国立大学法人 筑波大学 504171134 株式会社新産業創造研究所 510154039 学校法人甲南学園 397022911 青木 篤 100099759 石田 敬 100077517 福本 積 100087871 古賀 哲次 100087413 渡辺 陽一 100117019 武居 良太郎 100150810 中島 勝 100141977 渡邉 信 彼谷 邦光 志甫 諒 中澤 敦 井上 勲 本多 大輔 JP 2010275109 20101209 C12N 1/12 20060101AFI20140425BHJP C12P 5/02 20060101ALI20140425BHJP C12R 1/89 20060101ALN20140425BHJP JPC12N1/12 CC12P5/02C12N1/12 CC12R1:89 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN 再公表特許(A1) 20140522 2012547928 14 （出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２１年度、平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願） 4B064 4B065 4B064AB04 4B064BH03 4B064BH07 4B064BJ09 4B064CA08 4B064CC03 4B064CC06 4B064CC12 4B064CD01 4B064CD25 4B064DA10 4B064DA16 4B065AA83X 4B065AC08 4B065AC13 4B065AC14 4B065AC16 4B065BA22 4B065BB02 4B065BB15 4B065BB24 4B065BB29 4B065BC02 4B065BC03 4B065BC05 4B065BC26 4B065CA03 4B065CA41 4B065CA44 4B065CA60 本発明は、高いスクワレン（squalene）産生能を有する新規微生物、及び当該微生物を用いるスクワレンの製造方法に関する。 スクワレンは、ステロール類の合成中間体であるが、従来から健康食品として世界中で使用されてきた。近年、スクワレン自体に生理活性があり、放射線障害防止効果、細胞のがん化防止効果が発見され、話題となっている。また、スクワレンを還元したスクワランは化粧品の保湿剤として広く利用される他、機械の潤滑油、及び熱交換媒体としても利用されている。 スクワレンの主要な供給源は深海鮫であり、従来のスクワレン抽出精製法は深海鮫の肝臓を集め、熱湯中で細胞を破砕することによって遊離してくるオイル状油脂を集め、吸着剤等で精製するものであった。しかしながら、鮫は自然界より捕獲されるためその漁獲高は極めて不安定であり、供給不安の価格の変動が問題となる。また近年、深海鮫は絶滅危惧種に指定され捕獲が制限されており、自然環境保護の観点からも、深海鮫から抽出する以外の代替的スクワレン製造方法の開発が望まれている。 スクワレンの代替製造方法として、小麦胚芽、米ぬか油、オリーブオイル等の植物原料のスクワレンも知られるが、例えば、オリーブオイルの場合、スクワレンの含有量が少ない上に、スクワレン近縁の不純物の割合が多く、品質としての評価は鮫スクワレンより劣るとされており、商業生産するには問題が多いと考えられている。 そこで天然物を原料とせず安定なスクワレンを提供できるスクワレン製造方法が望まれ、微生物によるスクワレンの生産が考案されている。例えば、ユーグレナに属する原生動物から培養液１リットル当たり最大４９．４ｍｇのスクワレンを産生することが報告されている（特許文献１：特開平７−１１５９８１）。ここで乾燥重量当たりの産生量は不明だが、最高含量の脂質産生条件における全産生脂質類中のスクワレンの含量は３０％程度に留まる。また、フザリウム（Fusarium）属の微生物により最大で２９．１７６ｍｇ／ｇ（乾燥細胞）のスクワレンが得られたことが報告されるが、特定の微生物に変異誘導する必要がある（特許文献２：特開平５−９０）。さらに、酵母等から最大１５５．３ｍｇ／ｇ（乾燥細胞）のスクワレンが得られたことが報告されているが、スクワレンを体内に蓄積するよう変異誘導し、且つ培地にステロール類を添加する必要がある（特許文献３：特許第２６６３０３９号）。 しかしながら、工業化の際には、厳密な制御が必要なく安価な培地及び装置で、大量のスクワレンを生産できることが好ましい。特開平７−１１５９８１特開平５−９０特許第２６６３０３９号 本発明の課題は、特別な条件での変異誘導や培養を必要とせず、且つ高収量でスクワレンを提供することである。 本発明者等は、上記の要請に鑑み研究を重ねた結果、スクワレンを大量に産生し、増殖性に優れる微生物を見出した。さらに、当該微生物を利用し、スクワレンを効率良く生成可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 本発明は、スクワレン産生能を有する、ラビリンチュラ（Labyrinthula）類、スラウストキトリウム（Thraustochytrid）科、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属する新規株であって、当該株が産生する全脂質中、スクワレンが10質量％以上であり、且つオレンジ色〜赤色を呈するコロニーを形成することを特徴とする株を提供する。また、本発明は、前記オーランチオキトリウム新規株を培地中で培養させ、増殖した当該株の産生するスクワレンを採取することを特徴とする、スクワレンの製造方法を提供するである。さらには、本発明はスクワレンの製造のための、前記オーランチオキトリウム新規株の使用を提供する。図１は、寒天培地で培養した本発明のオーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株の写真である。図２は、本発明のオーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株の細胞の写真である。図３は、本発明のオーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３が産生した脂質をシリカゲル精製した後の、薄層シリカゲルでの分析写真を示す。 本発明の高いスクワレン産生能を有する微生物は、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属するスクワレン産生能を有し、且つオレンジ色〜赤色（極大吸収波長において590〜750nm程度）を呈する微生物であれば、いずれのものでもよい。具体的には、例えば、本発明の新規微生物である、オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株を用いることができる。１．本発明の新規株 本発明の新規株は、沖縄県の海岸に生息するマングローブの葉より採取及び分離したものである。当該株は以下の特徴を有する。 本発明のオーランチオキトリウム属の株は、通常明瞭なコロニーを形成しない。外観の形状的特徴：寒天培地で培養した本発明のオーランチオキトリウム属の株は、オレンジ色〜赤色を呈し得る（図１）。細胞の形状的特徴：形状は球形であり、大きさは、５〜１５μｍ程度である（図２）。 基本的に栄養細胞は球形で、不動であり得る。培養の初期対数増殖期においては、鞭毛をもつ遊送子がしばしばみられるが、静止期ではこの遊送子が全く観察されず、球形の栄養細胞だけとなることがある。 本発明のオーランチオキトリウム属の株は、ラビリンチュラ（Labyrinthula）類、スラウストキトリウム（Thraustochytrid）科、オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属し、従属栄養性で、細胞内に多量のスクワレンを蓄積する株である。ラビリンチュラ類は、卵菌類に属するものであるが、系統的には他の菌類とちがって褐藻類や珪藻類等の不等毛植物と近縁の系統であり、不等毛植物とともにストラメノパイル系統を構成するものである。これまで知られている本科の株は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等の高度不飽和脂肪酸を多量に蓄積する性質を有する株（ＳＲ２１株、特許第２７６４５７２号）がある。またスクワレン産生能を有する株も存在するが、その産生能は、最大でも約０．３〜０．６ｍｇ／ｇ（乾燥細胞）のものしか知られていなかった（G. Chen. et al. New Biotechnology 27, 382-289 (2010)；Q. Li et al., J.Agric. Food Chem. 57(10), 4267-4272 (2009)；及びK. W. Fan et al.,WorldJ.Microbiol.Biotechnol. 26, 1303-1309 (2010)）。 なお、本発明のオーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２０１０年１２月９日付で国内寄託し、受託番号FERM P-22047を得ている。その後同研究所においてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、２０１１年１２月８日付で国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４２が付与されている。 また、本発明のスクワレンの製造方法に用いる微生物は、前記オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株に限らず、上述したオーランチオキトリウム属の株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株であればいずれの菌株も使用することができる。このような微生物を培養し、その培養細胞中にスクワレン含有脂質を高濃度に蓄積させた後、そのスクワレン含有脂質等を採取し、既知の方法でスクワレンを抽出することでスクワレンを製造することができる。２．培養条件 本発明のオーランチオキトリウム属の新規株の増殖は、当該株を天然水又は人工海水で調製した適当な培地に播種し、定法にしたがって培養することにより行われる。培地としては、任意の公知のものを使用できる、例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース、デンプンなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどがある。これらの炭素源を、例えば、培地１リットル当たり20〜120ｇの濃度で使用する。窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、又はタンパク質消化物等がある。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。また、上記培地は適宜ビタミン類や、プロテアーゼペプトン、酵母抽出物等を含むこともできる。培養液中、天然水又は人工海水の割合は、約５０質量％である。上記の培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることにより適宜ｐＨを調整できる。培地のｐＨは、ｐＨ２．０〜１１．０、好ましくはｐＨ３．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ４．０〜９．０、より好ましくはｐＨ４．５〜９．０であり、通常はｐＨ６．５を用いる。当該培地に、オーランチオキトリウム属の新規株を含有する溶液を添加前に、当該培地をオートクレーブにより殺菌する。培養は、培養温度５〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは１０〜３０℃にて、通常１〜１０日間、好ましくは３〜７日間培養を行う。培養は通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で行うことができるが、好ましくは通気攪拌培養又は振とう培養で培養する。３．スクワレンの抽出及び分析 本発明のオーランチオキトリウム属の新規株が産生するスクワレン含有脂質は、当業者に既知の方法で抽出及び分析することができる。例えば、上記の通り培養して増殖させ、得られた培養液から遠心分離又は濾過等により回収した湿藻体を、凍結乾燥又は加温による乾燥等により乾燥させる。または、培養後の培地をそのままスクワレン含有脂質の抽出ステップに用いてもよい。 得られた細胞乾燥物、又は培養後の細胞を含有する培地から、有機溶媒を用いて脂質を抽出できる。抽出は、異なる有機溶媒を用いて２度以上行ってもよい。有機溶媒としては、クロロホルム・メタノール混合溶媒（例えば、１：１、１：２）、又はエタノール・ジエチルエーテル混合溶媒等の極性溶媒と弱極性溶媒の混合液を用いることができる。上記抽出後に、例えば窒素気流下で濃縮乾固したサンプルから、ｎ−ヘキサンを用いて抽出する。得られた抽出液を、当業者に既知の方法で精製する。例えば、シリカゲルや酸性白土を用い、極性脂質を吸着させて精製することができる。また、精製したスクワレンをＮＭＲ，ＩＲ、ガスクロマトグラフィー、ＧＣ／ＭＳ等により分析する。 上記の手順により得られた本発明のオーランチオキトリウム属の新規株は、培地１リットル当たり乾燥細胞質量で、少なくとも１ｇ以上、好ましくは少なくとも３ｇ以上、好ましくは５ｇから７ｇのバイオマス量で産生される。また、当該バイオマス量に達するまでに要する期間は、１〜１０日、好ましくは２〜８日、より好ましくは３〜７日である。 本発明のオーランチオキトリウム属の新規株が産生する全脂質含量は、乾燥細胞質量１ｇ当たり、少なくとも５質量％、好ましくは少なくとも２５質量％、より好ましくは少なくとも３０質量％である。ここで、脂質とは、スクワレン及びステロール類、及び／又はピグメント等の色素を含むトリグリセリド；又は混合脂質を含む。また、本発明のオーランチオキトリウム属の新規株が産生する全脂質中、スクワレンは、少なくとも１０質量％以上、少なくとも３０質量％以上、少なくとも５０質量％以上、好ましくは、１０〜１００質量％、３０〜９５質量％、より好ましくは５０〜９０質量％、最も好ましくは６０質量％〜８５質量％である。 したがって、１リットル当たりのスクワレンの産生量としては、１．０〜２．０ｇとなる。 本発明のオーランチオキトリウム属の新規株を用いた場合、産生される脂質には、スクワレンが高濃度で含有される。これは、既報のスクワレン産生性オーランチオキトリウム属と比較して、スクワレン産生能が５００倍以上であることがわかった。 また、本発明のオーランチオキトリウム属の新規株は、増殖速度が非常に速いことも特徴である。１日に３−１２回分裂することが観察され、これは、ユーグレナやクロレラよりきわめて速い増殖速度であり、さらに炭化水素を産生するボトリオコッカスと比較した場合、１０〜３０倍以上の増殖速度を有することになる。 以上のように、本発明のオーランチオキトリウム属の新規株は、特別な条件での変異誘導や培養を必要とせず、且つ高収量且つ短期間でスクワレンを提供することができる、大量生産に適する株である。 以下に、本発明のオーランチオキトリウム属の新規株の分離及び産生されるスクワレンの分析を実施例として示すが、本願発明の請求の範囲は、これらの実施例により制限されるものではない。１．培養及び分離 ＧＰＹ培地（培地１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、ポリペプトン１０ｇ、及び酵母エキストラクト５ｇ）に海水（培地１Ｌ当たり５００ｍｌ）、及び蒸留水を添加し、本発明のオーランチオキトリウム属の株を含む溶液と合わせて１Ｌとした（ｐＨ６．５）。これを１２０℃で２０分間オートクレーブした後、２５℃で４日間、通気条件下で振とう培養した。２．産生された脂質の分析 得られた本発明のオーランチオキトリウム属の株を含む培養液に、クロロホルム・メタノール（２：１,Ｖ／Ｖ）を加えて脂質を抽出し、濃縮乾固後、ｎ−ヘキサンで再抽出した。 この試料をカラムクロマトグラフィーで精製した。条件は、カラム内径：１０φｍｍ、シリカゲル：２０ｍｌ（カラム充填量）、溶媒：（１）ｎ−ヘキサン、（２）ｎ−ヘキサン／クロロホルム（９／１）、（３）ｎ−ヘキサン／クロロホルム（１／１）、（４）クロロホルム、（５）クロロホルム／メタノール（１／１）、（６）クロロホルム／メタノール（１／４）。得られた溶出液を、シリカゲルＧプレートを用い、溶媒ｎ−ヘキサン／クロロホルム（９／１）により、上記溶出の（１）に該当するｎ−ヘキサン溶出液に単一の物質が含まれることを確認した（図２）。当該物質をＴＯＦ／ＭＳ解析に供した。 ＴＯＦ／ＭＳ解析により、前記の単一の物質が、分子式Ｃ30Ｈ50（不飽和度６）の炭化水素であることが確認された（(M+H) observed exact mass: 411.3987、Formula (M+H): C30H51,calcd for C30H51, 411.3985, 0.2 mmu）。また、ＮＭＲにより以下の構造を有するスクワレンであることを確認した。 この株をオーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株として受託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託した（受託番号：FERM P-22047）。その後同研究所においてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、２０１１年１２月８日付で国際寄託されて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４４２が付与されている。 オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株から得られた脂質の組成を表１に示す。また比較例として、本発明に属するオーランチオキトリウム属で、オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株と同様にオレンジ〜赤色を呈するコロニーを形成する他の株（Ａ、Ｂ）、本発明に属さない、白色、クリーム色あるいは黄色を呈するコロニーを形成するオーランチオキトリウム属の他の株（Ｃ、Ｄ及びＥ）及びシゾキトリウム属ＳＲ２１株の分析結果も示す。Aurantiochytriumtsukuba 3 FERM BP-11442 オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属する株であって、当該株が産生する全脂質中、スクワレンが10質量％以上であり、且つオレンジ色〜赤色を呈するコロニーを形成することを特徴とする株。 前記株が、オーランチオキトリウム・ｔｓｕｋｕｂａ−３株（受領番号：FERMN BP-11442）である、請求項１に記載の株。 請求項１又は２のいずれか１項に記載のオーランチオキトリウム属に属する株を用いるスクワレンの製造方法。 オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属に属する株であって、当該株が産生する全脂質中、スクワレンが10質量％以上であり、且つオレンジ色〜赤色を呈するコロニーを形成することを特徴とする株の提供。