生命科学関連特許情報

タイトル：公開特許公報(A)_微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法
出願番号：2011030738
年次：2012
IPC分類：C12N 1/20,C02F 3/34,C12R 1/01,C12R 1/38


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黒住 悟 上田 明弘 倉根 隆一郎 上杉 正和 松浦 崇 JP 2012080872 公開特許公報(A) 20120426 2011030738 20110216 微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法 積水アクアシステム株式会社 000002451 学校法人中部大学 500433225 藤田 隆 100100480 黒住 悟 上田 明弘 倉根 隆一郎 上杉 正和 松浦 崇 JP 2010208787 20100917 C12N 1/20 20060101AFI20120330BHJP C02F 3/34 20060101ALI20120330BHJP C12R 1/01 20060101ALN20120330BHJP C12R 1/38 20060101ALN20120330BHJP JPC12N1/20 AC12N1/20 DC12N1/20 FC02F3/34 ZC12N1/20 AC12N1/20 AC12R1:01C12R1:38 4 1 ＯＬ 16 4B065 4D040 4B065AA01X 4B065AA41X 4B065AC20 4B065BA22 4B065BB04 4B065BB36 4B065CA55 4D040DD03 4D040DD12 4D040DD16 4D040DD31 本発明は、微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法に関し、さらに詳細には、高い界面活性剤分解能を有する微生物、並びに、当該微生物を利用した界面活性剤含有廃水の処理方法に関する。 界面活性剤は、食品産業、機械産業、電子産業、等、様々な業種にて多量に使用されており、生活排水のみならず産業廃水として排出されている。界面活性剤は特に洗浄目的で利用されることが多く、界面活性剤を含む生活廃水等は、他の様々な汚染物質をも含む複合廃水となる。例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は合成洗剤として広く利用されている界面活性剤であり、ＳＤＳを含む廃水の確実な処理が求められている。 一般的に廃水処理では、活性汚泥法等の生物処理が適用されていることが多い。しかしながら界面活性剤は難生分解性であり、かつ微生物の膜を溶解する性質がある界面活性剤も存在することから、産業排水処理の主力である活性汚泥法では処理が困難である。例えば、界面活性剤と一般天然有機物を含む複合廃水を生物処理に供すれば、廃水中の易分解性の物質が優先的に分解され、難分解性である界面活性剤は処理水中に残留しやすいという問題が発生する。その結果、界面活性剤が残留した処理水が河川などの環境中に放出された場合、界面活性剤の分解には数日から数十日の期間が必要とされており、大きな環境負荷となっている。 天然物ではない合成界面活性剤を速やかに分解できる微生物は、自然界には多く存在しない。従って、土着微生物に依存した従来の生物処理で、界面活性剤を含有する廃水（界面活性剤含有廃水）を十分に処理することは困難である。そこで、界面活性剤を分解する高い能力を有する特定微生物を外来種として生物処理に利用することが有効であると考えられる。 このような背景の下、近年、界面活性剤を分解する能力（界面活性剤分解能）を有する微生物が種々見出され（例えば、特許文献１〜３）、界面活性剤含有廃水の処理への応用が試みられている。しかし、界面活性剤含有廃水の処理に十分適用されているとは言い難い。 また、界面活性剤は僅かな濃度で発泡するため、生物処理において多量の消泡剤を必要とする。さらに、閉鎖性水域等のＣＯＤ総量規制区域において処理水の三次処理が求められる場合には、活性炭吸着やオゾン処理などの物理化学的処理が行われている。しかし当該処理は、イニシャルコストとランニングコストの両面において不利である。特開２００４−１７３６９７号公報特開２０００−３５４８９１号公報特開２０００−２７０８５２号公報 上記のように、界面活性剤含有廃水の生物処理に関しては、種々の課題をなお残しており、解決策が望まれている。そこで本発明は、界面活性剤分解能に優れた新規微生物を提供するとともに、当該微生物を利用した廃水処理技術を提供することを目的とする。 本発明者らは、より高い界面活性剤分解能を有する新規微生物を分離すべく、様々な環境から採取した土壌を分離源として微生物のスクリーニングを行った。その結果、界面活性剤、特にＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤に対する分解能に優れた複数種の新規微生物を分離することに成功した。そして、当該微生物を利用した界面活性剤含有廃水の処理方法を開発し、本発明を完成した。上記した課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。 請求項１に記載の発明は、Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）、Cupriavidus necator KR-26R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４）、Pseudomonas nitroreducens KR-33R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５）、Ralstonia pickettii KR-35R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６）、Ralstonia eutropha KR-41R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７）、又はRalstonia eutropha KR-43R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８）である微生物である。 本発明の微生物は、界面活性剤、特にＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤に対する高い分解能を有する。本発明の微生物によれば、界面活性剤含有廃水を高効率で処理（浄化）することができる。例えば、本発明の微生物を用いることで、界面活性剤含有廃水の処理として行われている上記物理化学的処理を、軽減あるいは省略することが可能となる。 請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の少なくとも１種の微生物と界面活性剤を含有する廃水とを接触させて、廃水中の界面活性剤を分解する界面活性剤含有廃水の処理方法である。 本発明は界面活性剤含有廃水の処理方法に係るものであり、上記した本発明の微生物の少なくとも１種と界面活性剤含有廃水とを接触させる工程を包含する。本発明によれば、界面活性剤含有廃水を高効率で処理することができる。 請求項２に記載の界面活性剤含有廃水の処理方法において、界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である構成が好ましい（請求項３）。 請求項３に記載の界面活性剤含有廃水の処理方法において、陰イオン界面活性剤が、硫酸エステル塩、スルホン酸塩、及びカルボン酸塩からなる群より選択されたものである構成が好ましい（請求項４）。 本発明の微生物によれば、界面活性剤含有廃水を高効率で処理（浄化）することができる。例えば、界面活性剤含有廃水の処理として行われている上記物理化学的処理を、軽減あるいは省略することが可能となる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法についても同様であり、界面活性剤含有廃水を高効率で処理（浄化）することができる。新規微生物によるＳＤＳ分解曲線を示すグラフである（実施例）。新規微生物による別のＳＤＳ分解曲線を示すグラフである（実施例）。標準活性汚泥によるＳＤＳ分解曲線を示すグラフである（比較例）。 本発明の微生物は、Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）、Cupriavidus necator KR-26R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４）、Pseudomonas nitroreducens KR-33R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５）、Ralstonia pickettii KR-35R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６）、Ralstonia eutropha KR-41R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７）、又はRalstonia eutropha KR-43R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８）である。これらの微生物は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託されている。寄託の詳細を以下に示す。〔ＫＲ−２０Ｒ株〕 表示：Cupriavidus taiwanensis KR-20R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−２６Ｒ株〕 表示：Cupriavidus necator KR-26R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−３３Ｒ株〕 表示：Pseudomonas nitroreducens KR-33R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−３５Ｒ株〕 表示：Ralstonia pickettii KR-35R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−４１Ｒ株〕 表示：Ralstonia eutropha KR-41R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−４３Ｒ株〕 表示：Ralstonia eutropha KR-43R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８ 受領日：平成２２年９月１５日 各菌株の菌学的性質を表１〜３に示す。以下、「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。 さらに、各菌株の追加試験の結果を以下に示す。〔ＫＲ−２０Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・４２℃での生育：＋・リパーゼ活性（Tween 80）：＋〔ＫＲ−２６Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・２％ＮａＣｌ条件下での生育：＋・３％ＮａＣｌ条件下での生育：−〔ＫＲ−３３Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・でんぷんの加水分解：−・King's B寒天で蛍光色素の産生：−〔ＫＲ−３５Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・でんぷんの加水分解：−・リパーゼ活性（Tween 80）：＋〔ＫＲ−４１Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・Lactateの資化性：＋・Glutamateの資化性：＋〔ＫＲ−４３Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・Lactateの資化性：＋・Glutamateの資化性：＋ 後述の実施例で詳述するように、これらの微生物は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性により、同定されている（表５）。 本発明の微生物を培養する方法としては、好気性微生物の培養方法として一般的な方法をそのまま採用することができる。例えば、適当な炭素源等を含有する液体培地を用いて、通気及び撹拌して培養することができる。培養温度としては、例えば５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲を選択することができる。培地に炭素源として界面活性剤を添加する場合、濃度としては、例えば７５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下の範囲を選択することができる。 本発明の微生物は、高い界面活性剤分解能を有する。界面活性剤分解能の評価方法としては、例えば、界面活性剤を含有する培地で本発明の微生物を培養した際の、当該培養液中における界面活性剤の減少速度をもって評価することができる。界面活性剤の減少速度は、例えば、界面活性剤を唯一、あるいは主たる炭素源とする培地を用い、培地中の界面活性剤量の変化を全有機体炭素（ＴＯＣ）の変化をもって検出し、算出することができる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法は、上記した６種の微生物の少なくとも１種を界面活性剤含有廃水に接触させるものである。用いる微生物の種類は１種のみでもよいし、２種以上を併用してもよい。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法において、処理対象となる界面活性剤としては特に限定はなく、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤など、全ての界面活性剤が処理対象となり得るが、陰イオン界面活性剤の処理に特に効果的である。陰イオン界面活性剤としては、硫酸エステル塩、スルホン酸塩、カルボン酸塩などが挙げられる。硫酸エステル塩の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アルキル硫酸エステルナトリウム（ＡＳ）、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム（ＡＥＳ）が挙げられる。スルホン酸塩の例としては、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＡＢＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルカンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）が挙げられる。カルボン酸塩の例としては、ヤシ油やパーム油を原料とした脂肪酸石鹸、ペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩（ＭＥＳ）が挙げられる。 陽イオン性界面活性剤の例としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型が挙げられる。 両性界面活性剤の例としては、ベタイン型、アルキルベタイン型、グリシン型が挙げられる。 非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ポリエチレングリコールが挙げられる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法は、好気性処理のあらゆる方式、例えば、活性汚泥法、生物膜法のいずれにも適用できる。活性汚泥法に適用する場合には、活性汚泥中に本発明の微生物を添加して他微生物と共存（共生）させることにより、界面活性剤含有廃水の処理を高効率で行うことができる。生物膜法に適用する場合には、回転円板法や散水ろ床法等の公知の手法をそのまま適用することができる。本発明の微生物を担体に固定化し、流動床式の処理を行うこともできる。また、本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法は、回分式、連続式のいずれの処理方式にも適用できる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法において、界面活性剤含有廃水に接触させる微生物の量（例えば、添加量や添加サイクル）は、使用する微生物の種類、処理すべき廃水の性状、廃水処理施設の構成等に応じて適宜選択すればよい。また、界面活性剤含有廃水と微生物との接触時間についても、廃水に含まれる界面活性剤の種類や量、処理すべき廃水の性状等に応じて適宜選択することができる。廃水処理時の温度としては、本発明の微生物の生育可能範囲であればよく、例えば、培養温度として例示した５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲を選択することができる。同様に、界面活性剤の濃度としては、例えば７５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下の範囲を選択することができる。 以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。（１）新規微生物のスクリーニング 自然界の様々な環境から採取した土壌を新規微生物の分離源とした。０．５ｇの土壌サンプルを５ｍＬの滅菌生理食塩水に懸濁し、６０分間静置した。懸濁液の上清１００μＬを、表４に示す組成の界面活性剤含有培地５ｍＬに接種し、３０℃、１００ｒｐｍで振とう培養した。５回の植え継ぎの後、ＳＤＳが分解されたサンプルを複数選択した。これらの集積培養液から、寒天培地を用いて界面活性剤分解微生物を純粋分離した。 分離した複数の微生物のうち、特に有用と考えられた６種（ＫＲ−２０Ｒ株、ＫＲ−２６Ｒ株、ＫＲ−３３Ｒ株、ＫＲ−３５Ｒ株、ＫＲ−４１Ｒ株、ＫＲ−４３Ｒ株）について、１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域をＰＣＲにて増幅し、シーケンス解析を行った。ＢＬＡＳＴデータベースを利用して既知微生物との相同性検索を行った。結果を表５に示す。すなわち、これら６種は、それぞれCupriavidus taiwanensis、Cupriavidus necator、Pseudomonas nitroreducens、Ralstonia pickettii、Ralstonia eutropha、Ralstonia eutrophaと高い相同性を示した。 純粋分離した６種の微生物を、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託した。 各微生物についてグリセロールストックを作製し、以下の試験に用いた。（２）界面活性剤分解能力の評価［１］ 表６に示す栄養培地１００ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに仕込み、オートクレーブで滅菌した。各微生物のグリセロールストック１ｍＬを植菌し、回転振とう培養機にて培養を開始した（２００ｒｐｍ、３０℃）。３６〜４８時間培養後、遠心分離にて各微生物の培養菌体を集めた。生理食塩水で菌体を洗浄後、生理食塩水にて１０ｍＬにメスアップし、菌体濃縮液を得た。 表６に示す界面活性剤含有培地の「培地Ａ」１００ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに仕込み、オートクレーブで滅菌した。各菌体濃縮液について、接種菌体濃度が乾燥菌体重量換算で９０ｍｇ／Ｌとなるように、界面活性剤含有培地を仕込んだ三角フラスコに植菌した。回転振とう培養機にて培養を開始した（２００ｒｐｍ、３０℃）。培養開始から０時間、８時間、２４時間、および４８時間目に培養液をサンプリングし、ＯＤ660、ｐＨ、及びＴＯＣを測定した。コントロールとして、微生物を植菌しない培地を用いて同様の操作を行った。結果を表７及び図１に示す。図１はＳＤＳ分解曲線を示すグラフであり、曲線の傾きがＳＤＳ分解速度（ＳＤＳ除去速度）となる。各微生物について、ＴＯＣ濃度が急激に減少した時間（ＫＲ−２０Ｒ株、ＫＲ−２６Ｒ株、ＫＲ−３３Ｒ株、及びＫＲ−４３Ｒ株は８〜２４時間、ＫＲ−３５Ｒ株は２４〜４８時間、ＫＲ−４１Ｒ株は０〜８時間）におけるＳＤＳ分解速度（ＴＯＣ除去速度にて表現，単位：ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）を算出した。表７に示すように、いずれの微生物においても、０．５（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）以上の高いＳＤＳ分解速度を達成しており、各微生物が高いＳＤＳ分解能力を有していることが示された。（３）界面活性剤分解能力の評価［２］ 界面活性剤含有培地として表６に示す界面活性剤含有培地の「培地Ｂ」を用いる以外は上記（２）と同様にして、実験を行った。培養液のサンプリングは、培養開始から０時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、および４８時間目とした。結果を表８及び図２に示す。各微生物について、ＴＯＣ濃度が急激に減少した時間（ＫＲ−２０Ｒ株及びＫＲ−２６Ｒは２４〜４８時間、ＫＲ−３３Ｒ株は０〜８時間、ＫＲ−３５Ｒ株は１６〜２０時間、ＫＲ−４１Ｒ株及びＫＲ−４３Ｒは１２〜１６時間）におけるＳＤＳ分解速度を算出した。表８に示すように、いずれの微生物においても、０．３（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）以上のＳＤＳ分解速度を達成しているが、特にＫＲ−３３Ｒ株、ＫＲ−３５Ｒ株、ＫＲ−４１Ｒ株、ＫＲ−４３Ｒ株については１．２（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）以上の高いＳＤＳ分解速度を達成しており、各微生物が高いＳＤＳ分解能力を有していることが示された。〔比較例〕活性汚泥法によるＳＤＳ分解速度評価 容量２Ｌの曝気槽に、ＳＤＳを唯一の炭素源とする合成廃水（１００ｍｇ／Ｌ ＳＤＳ、２．０ｇ／Ｌ無機塩類、３ｍｇ／Ｌシリコン系消泡剤）１Ｌを入れた。この合成廃水に、濃縮活性汚泥をＭＬＳＳが１０００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加し、曝気を開始した。曝気開始後、所定時間ごとにサンプリングし、ＴＯＣとｐＨを測定した。曝気時間２４時間を１サイクルとして、fill＆draw方式により被処理水を交換した。ＴＯＣ除去速度が安定するまで活性汚泥の順養とサンプリングを継続した。処理速度安定後のＴＯＣ除去速度を、標準活性汚泥によるＴＯＳ除去速度とした。 活性汚泥の馴養は５回行った。ＴＯＣの測定結果を表９に、仕込み時のＭＬＳＳ濃度とＴＯＣ分解速度（ＳＤＳ分解速度に相当，単位：ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）を表１０に示す。また図３に、ＳＤＳ分解曲線を示す。図３の曲線の傾きがＳＤＳ分解速度（除去速度）となる。その結果、処理速度が安定した馴養４回目以降の最大分解速度の平均で、０．１７（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）のＳＤＳ分解速度を示した。この値は、上記６種の微生物における値（表７、表８）よりもかなり低く、通常の活性汚泥法ではＳＤＳが分解され難いことを示していた。 以上より、上記６種の微生物は、いずれも高いＳＤＳ分解能力を有していることが示された。 Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）、Cupriavidus necator KR-26R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４）、Pseudomonas nitroreducens KR-33R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５）、Ralstonia pickettii KR-35R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６）、Ralstonia eutropha KR-41R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７）、又はRalstonia eutropha KR-43R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８）である微生物。 請求項１に記載の少なくとも１種の微生物と界面活性剤を含有する廃水とを接触させて、廃水中の界面活性剤を分解する界面活性剤含有廃水の処理方法。 界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である請求項２に記載の界面活性剤含有廃水の処理方法。 陰イオン界面活性剤が、硫酸エステル塩、スルホン酸塩、及びカルボン酸塩からなる群より選択されたものである請求項３に記載の界面活性剤含有廃水の処理方法。 【課題】界面活性剤含有廃水を高効率で処理できる新規の微生物等を提供する。【解決手段】Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）、Cupriavidus necator KR-26R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４）、Pseudomonas nitroreducens KR-33R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５）、Ralstonia pickettii KR-35R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６）、Ralstonia eutropha KR-41R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７）、又はRalstonia eutropha KR-43R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８）である微生物が提供される。これらの微生物は界面活性剤、特に陰イオン界面活性剤の分解能に優れている。これらの微生物を用いた界面活性剤含有廃水の処理方法も提供される。【選択図】図１


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特許公報(B2)_微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法

生命科学関連特許情報

タイトル：特許公報(B2)_微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法
出願番号：2011030738
年次：2013
IPC分類：C12N 1/20,C02F 3/34,C12R 1/01,C12R 1/38


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黒住 悟 上田 明弘 倉根 隆一郎 上杉 正和 松浦 崇 JP 5237403 特許公報(B2) 20130405 2011030738 20110216 微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法 積水アクアシステム株式会社 000002451 学校法人中部大学 500433225 藤田 隆 100100480 黒住 悟 上田 明弘 倉根 隆一郎 上杉 正和 松浦 崇 JP 2010208787 20100917 20130717 C12N 1/20 20060101AFI20130627BHJP C02F 3/34 20060101ALI20130627BHJP C12R 1/01 20060101ALN20130627BHJP C12R 1/38 20060101ALN20130627BHJP JPC12N1/20 AC12N1/20 DC12N1/20 FC02F3/34 ZC12N1/20 AC12R1:01C12N1/20 AC12R1:38 Ｃ１２Ｎ １／００ Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００ Ｃ０２Ｆ ３／００ ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） Biotechnology Letters(2003),Vol.25,p.55-59 Journal of Hazardous Materials(2009),Vol.168,p.507-514 Journal of Hazardous Materials(2007),Vol.139,p.232-237 日本農芸化学会2011年度大会講演要旨集(2011.03.05)，p,5,2C02a07 Journal of Environmental Management(2006),Vol.80,No.4,p.279-286 2 IPOD FERM P-22013 IPOD FERM P-22014 IPOD FERM P-22015 IPOD FERM P-22016 IPOD FERM P-22017 IPOD FERM P-22018 2012080872 20120426 15 20110318 ▲高▼ 美葉子 本発明は、微生物、並びに、界面活性剤含有廃水の処理方法に関し、さらに詳細には、高い界面活性剤分解能を有する微生物、並びに、当該微生物を利用した界面活性剤含有廃水の処理方法に関する。 界面活性剤は、食品産業、機械産業、電子産業、等、様々な業種にて多量に使用されており、生活排水のみならず産業廃水として排出されている。界面活性剤は特に洗浄目的で利用されることが多く、界面活性剤を含む生活廃水等は、他の様々な汚染物質をも含む複合廃水となる。例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は合成洗剤として広く利用されている界面活性剤であり、ＳＤＳを含む廃水の確実な処理が求められている。 一般的に廃水処理では、活性汚泥法等の生物処理が適用されていることが多い。しかしながら界面活性剤は難生分解性であり、かつ微生物の膜を溶解する性質がある界面活性剤も存在することから、産業排水処理の主力である活性汚泥法では処理が困難である。例えば、界面活性剤と一般天然有機物を含む複合廃水を生物処理に供すれば、廃水中の易分解性の物質が優先的に分解され、難分解性である界面活性剤は処理水中に残留しやすいという問題が発生する。その結果、界面活性剤が残留した処理水が河川などの環境中に放出された場合、界面活性剤の分解には数日から数十日の期間が必要とされており、大きな環境負荷となっている。 天然物ではない合成界面活性剤を速やかに分解できる微生物は、自然界には多く存在しない。従って、土着微生物に依存した従来の生物処理で、界面活性剤を含有する廃水（界面活性剤含有廃水）を十分に処理することは困難である。そこで、界面活性剤を分解する高い能力を有する特定微生物を外来種として生物処理に利用することが有効であると考えられる。 このような背景の下、近年、界面活性剤を分解する能力（界面活性剤分解能）を有する微生物が種々見出され（例えば、特許文献１〜３）、界面活性剤含有廃水の処理への応用が試みられている。しかし、界面活性剤含有廃水の処理に十分適用されているとは言い難い。 また、界面活性剤は僅かな濃度で発泡するため、生物処理において多量の消泡剤を必要とする。さらに、閉鎖性水域等のＣＯＤ総量規制区域において処理水の三次処理が求められる場合には、活性炭吸着やオゾン処理などの物理化学的処理が行われている。しかし当該処理は、イニシャルコストとランニングコストの両面において不利である。特開２００４−１７３６９７号公報特開２０００−３５４８９１号公報特開２０００−２７０８５２号公報 上記のように、界面活性剤含有廃水の生物処理に関しては、種々の課題をなお残しており、解決策が望まれている。そこで本発明は、界面活性剤分解能に優れた新規微生物を提供するとともに、当該微生物を利用した廃水処理技術を提供することを目的とする。 本発明者らは、より高い界面活性剤分解能を有する新規微生物を分離すべく、様々な環境から採取した土壌を分離源として微生物のスクリーニングを行った。その結果、界面活性剤、特にＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤に対する分解能に優れた複数種の新規微生物を分離することに成功した。そして、当該微生物を利用した界面活性剤含有廃水の処理方法を開発し、本発明を完成した。上記した課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。 請求項１に記載の発明は、Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）である微生物である。 本発明の微生物は、界面活性剤、特にＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤に対する高い分解能を有する。本発明の微生物によれば、界面活性剤含有廃水を高効率で処理（浄化）することができる。例えば、本発明の微生物を用いることで、界面活性剤含有廃水の処理として行われている上記物理化学的処理を、軽減あるいは省略することが可能となる。 請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の微生物とラウリル硫酸ナトリウムを含有する廃水とを接触させて、廃水中のラウリル硫酸ナトリウムを分解する界面活性剤含有廃水の処理方法である。 本発明は界面活性剤含有廃水の処理方法に係るものであり、上記した本発明の微生物とラウリル硫酸ナトリウムを含有する廃水とを接触させる工程を包含する。本発明によれば、界面活性剤含有廃水を高効率で処理することができる。 本発明の微生物によれば、界面活性剤含有廃水を高効率で処理（浄化）することができる。例えば、界面活性剤含有廃水の処理として行われている上記物理化学的処理を、軽減あるいは省略することが可能となる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法についても同様であり、界面活性剤含有廃水を高効率で処理（浄化）することができる。新規微生物によるＳＤＳ分解曲線を示すグラフである（実施例）。新規微生物による別のＳＤＳ分解曲線を示すグラフである（実施例）。標準活性汚泥によるＳＤＳ分解曲線を示すグラフである（比較例）。 本発明の微生物は、Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）、Cupriavidus necator KR-26R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４）、Pseudomonas nitroreducens KR-33R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５）、Ralstonia pickettii KR-35R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６）、Ralstonia eutropha KR-41R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７）、又はRalstonia eutropha KR-43R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８）である。これらの微生物は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託されている。寄託の詳細を以下に示す。〔ＫＲ−２０Ｒ株〕 表示：Cupriavidus taiwanensis KR-20R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−２６Ｒ株〕 表示：Cupriavidus necator KR-26R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１４ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−３３Ｒ株〕 表示：Pseudomonas nitroreducens KR-33R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１５ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−３５Ｒ株〕 表示：Ralstonia pickettii KR-35R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１６ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−４１Ｒ株〕 表示：Ralstonia eutropha KR-41R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１７ 受領日：平成２２年９月１５日〔ＫＲ−４３Ｒ株〕 表示：Ralstonia eutropha KR-43R株 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１８ 受領日：平成２２年９月１５日 各菌株の菌学的性質を表１〜３に示す。以下、「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。 さらに、各菌株の追加試験の結果を以下に示す。〔ＫＲ−２０Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・４２℃での生育：＋・リパーゼ活性（Tween 80）：＋〔ＫＲ−２６Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・２％ＮａＣｌ条件下での生育：＋・３％ＮａＣｌ条件下での生育：−〔ＫＲ−３３Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・でんぷんの加水分解：−・King's B寒天で蛍光色素の産生：−〔ＫＲ−３５Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・でんぷんの加水分解：−・リパーゼ活性（Tween 80）：＋〔ＫＲ−４１Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・Lactateの資化性：＋・Glutamateの資化性：＋〔ＫＲ−４３Ｒ株〕・嫌気条件下での生育：−・Lactateの資化性：＋・Glutamateの資化性：＋ 後述の実施例で詳述するように、これらの微生物は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列の相同性により、同定されている（表５）。 本発明の微生物を培養する方法としては、好気性微生物の培養方法として一般的な方法をそのまま採用することができる。例えば、適当な炭素源等を含有する液体培地を用いて、通気及び撹拌して培養することができる。培養温度としては、例えば５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲を選択することができる。培地に炭素源として界面活性剤を添加する場合、濃度としては、例えば７５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下の範囲を選択することができる。 本発明の微生物は、高い界面活性剤分解能を有する。界面活性剤分解能の評価方法としては、例えば、界面活性剤を含有する培地で本発明の微生物を培養した際の、当該培養液中における界面活性剤の減少速度をもって評価することができる。界面活性剤の減少速度は、例えば、界面活性剤を唯一、あるいは主たる炭素源とする培地を用い、培地中の界面活性剤量の変化を全有機体炭素（ＴＯＣ）の変化をもって検出し、算出することができる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法は、上記した６種の微生物の少なくとも１種を界面活性剤含有廃水に接触させるものである。用いる微生物の種類は１種のみでもよいし、２種以上を併用してもよい。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法において、処理対象となる界面活性剤としては特に限定はなく、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤など、全ての界面活性剤が処理対象となり得るが、陰イオン界面活性剤の処理に特に効果的である。陰イオン界面活性剤としては、硫酸エステル塩、スルホン酸塩、カルボン酸塩などが挙げられる。硫酸エステル塩の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、アルキル硫酸エステルナトリウム（ＡＳ）、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム（ＡＥＳ）が挙げられる。スルホン酸塩の例としては、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＡＢＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルカンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＳ）が挙げられる。カルボン酸塩の例としては、ヤシ油やパーム油を原料とした脂肪酸石鹸、ペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩（ＭＥＳ）が挙げられる。 陽イオン性界面活性剤の例としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型が挙げられる。 両性界面活性剤の例としては、ベタイン型、アルキルベタイン型、グリシン型が挙げられる。 非イオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ポリエチレングリコールが挙げられる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法は、好気性処理のあらゆる方式、例えば、活性汚泥法、生物膜法のいずれにも適用できる。活性汚泥法に適用する場合には、活性汚泥中に本発明の微生物を添加して他微生物と共存（共生）させることにより、界面活性剤含有廃水の処理を高効率で行うことができる。生物膜法に適用する場合には、回転円板法や散水ろ床法等の公知の手法をそのまま適用することができる。本発明の微生物を担体に固定化し、流動床式の処理を行うこともできる。また、本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法は、回分式、連続式のいずれの処理方式にも適用できる。 本発明の界面活性剤含有廃水の処理方法において、界面活性剤含有廃水に接触させる微生物の量（例えば、添加量や添加サイクル）は、使用する微生物の種類、処理すべき廃水の性状、廃水処理施設の構成等に応じて適宜選択すればよい。また、界面活性剤含有廃水と微生物との接触時間についても、廃水に含まれる界面活性剤の種類や量、処理すべき廃水の性状等に応じて適宜選択することができる。廃水処理時の温度としては、本発明の微生物の生育可能範囲であればよく、例えば、培養温度として例示した５〜４０℃、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃の範囲を選択することができる。同様に、界面活性剤の濃度としては、例えば７５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以下の範囲を選択することができる。 以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。（１）新規微生物のスクリーニング 自然界の様々な環境から採取した土壌を新規微生物の分離源とした。０．５ｇの土壌サンプルを５ｍＬの滅菌生理食塩水に懸濁し、６０分間静置した。懸濁液の上清１００μＬを、表４に示す組成の界面活性剤含有培地５ｍＬに接種し、３０℃、１００ｒｐｍで振とう培養した。５回の植え継ぎの後、ＳＤＳが分解されたサンプルを複数選択した。これらの集積培養液から、寒天培地を用いて界面活性剤分解微生物を純粋分離した。 分離した複数の微生物のうち、特に有用と考えられた６種（ＫＲ−２０Ｒ株、ＫＲ−２６Ｒ株、ＫＲ−３３Ｒ株、ＫＲ−３５Ｒ株、ＫＲ−４１Ｒ株、ＫＲ−４３Ｒ株）について、１６ＳｒＤＮＡのＶ３領域をＰＣＲにて増幅し、シーケンス解析を行った。ＢＬＡＳＴデータベースを利用して既知微生物との相同性検索を行った。結果を表５に示す。すなわち、これら６種は、それぞれCupriavidus taiwanensis、Cupriavidus necator、Pseudomonas nitroreducens、Ralstonia pickettii、Ralstonia eutropha、Ralstonia eutrophaと高い相同性を示した。 純粋分離した６種の微生物を、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託した。 各微生物についてグリセロールストックを作製し、以下の試験に用いた。（２）界面活性剤分解能力の評価［１］ 表６に示す栄養培地１００ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに仕込み、オートクレーブで滅菌した。各微生物のグリセロールストック１ｍＬを植菌し、回転振とう培養機にて培養を開始した（２００ｒｐｍ、３０℃）。３６〜４８時間培養後、遠心分離にて各微生物の培養菌体を集めた。生理食塩水で菌体を洗浄後、生理食塩水にて１０ｍＬにメスアップし、菌体濃縮液を得た。 表６に示す界面活性剤含有培地の「培地Ａ」１００ｍＬを３００ｍＬ容三角フラスコに仕込み、オートクレーブで滅菌した。各菌体濃縮液について、接種菌体濃度が乾燥菌体重量換算で９０ｍｇ／Ｌとなるように、界面活性剤含有培地を仕込んだ三角フラスコに植菌した。回転振とう培養機にて培養を開始した（２００ｒｐｍ、３０℃）。培養開始から０時間、８時間、２４時間、および４８時間目に培養液をサンプリングし、ＯＤ660、ｐＨ、及びＴＯＣを測定した。コントロールとして、微生物を植菌しない培地を用いて同様の操作を行った。結果を表７及び図１に示す。図１はＳＤＳ分解曲線を示すグラフであり、曲線の傾きがＳＤＳ分解速度（ＳＤＳ除去速度）となる。各微生物について、ＴＯＣ濃度が急激に減少した時間（ＫＲ−２０Ｒ株、ＫＲ−２６Ｒ株、ＫＲ−３３Ｒ株、及びＫＲ−４３Ｒ株は８〜２４時間、ＫＲ−３５Ｒ株は２４〜４８時間、ＫＲ−４１Ｒ株は０〜８時間）におけるＳＤＳ分解速度（ＴＯＣ除去速度にて表現，単位：ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）を算出した。表７に示すように、いずれの微生物においても、０．５（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）以上の高いＳＤＳ分解速度を達成しており、各微生物が高いＳＤＳ分解能力を有していることが示された。（３）界面活性剤分解能力の評価［２］ 界面活性剤含有培地として表６に示す界面活性剤含有培地の「培地Ｂ」を用いる以外は上記（２）と同様にして、実験を行った。培養液のサンプリングは、培養開始から０時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、および４８時間目とした。結果を表８及び図２に示す。各微生物について、ＴＯＣ濃度が急激に減少した時間（ＫＲ−２０Ｒ株及びＫＲ−２６Ｒは２４〜４８時間、ＫＲ−３３Ｒ株は０〜８時間、ＫＲ−３５Ｒ株は１６〜２０時間、ＫＲ−４１Ｒ株及びＫＲ−４３Ｒは１２〜１６時間）におけるＳＤＳ分解速度を算出した。表８に示すように、いずれの微生物においても、０．３（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）以上のＳＤＳ分解速度を達成しているが、特にＫＲ−３３Ｒ株、ＫＲ−３５Ｒ株、ＫＲ−４１Ｒ株、ＫＲ−４３Ｒ株については１．２（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）以上の高いＳＤＳ分解速度を達成しており、各微生物が高いＳＤＳ分解能力を有していることが示された。〔比較例〕活性汚泥法によるＳＤＳ分解速度評価 容量２Ｌの曝気槽に、ＳＤＳを唯一の炭素源とする合成廃水（１００ｍｇ／Ｌ ＳＤＳ、２．０ｇ／Ｌ無機塩類、３ｍｇ／Ｌシリコン系消泡剤）１Ｌを入れた。この合成廃水に、濃縮活性汚泥をＭＬＳＳが１０００ｍｇ／Ｌの濃度となるように添加し、曝気を開始した。曝気開始後、所定時間ごとにサンプリングし、ＴＯＣとｐＨを測定した。曝気時間２４時間を１サイクルとして、fill＆draw方式により被処理水を交換した。ＴＯＣ除去速度が安定するまで活性汚泥の順養とサンプリングを継続した。処理速度安定後のＴＯＣ除去速度を、標準活性汚泥によるＴＯＳ除去速度とした。 活性汚泥の馴養は５回行った。ＴＯＣの測定結果を表９に、仕込み時のＭＬＳＳ濃度とＴＯＣ分解速度（ＳＤＳ分解速度に相当，単位：ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）を表１０に示す。また図３に、ＳＤＳ分解曲線を示す。図３の曲線の傾きがＳＤＳ分解速度（除去速度）となる。その結果、処理速度が安定した馴養４回目以降の最大分解速度の平均で、０．１７（ｇ−ＴＯＣ／ｇ−ＭＬＳＳ・ｄａｙ）のＳＤＳ分解速度を示した。この値は、上記６種の微生物における値（表７、表８）よりもかなり低く、通常の活性汚泥法ではＳＤＳが分解され難いことを示していた。 以上より、上記６種の微生物は、いずれも高いＳＤＳ分解能力を有していることが示された。 Cupriavidus taiwanensis KR-20R株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２０１３）である微生物。 請求項１に記載の微生物とラウリル硫酸ナトリウムを含有する廃水とを接触させて、廃水中のラウリル硫酸ナトリウムを分解する界面活性剤含有廃水の処理方法。


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