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一ノ瀬 進 角尾 進悟 JP 5646358 特許公報(B2) 20141114 2011015967 20110128 アロマターゼ活性化剤 花王株式会社 000000918 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 一ノ瀬 進 角尾 進悟 20141224 A61K 31/11 20060101AFI20141204BHJP A61P 43/00 20060101ALI20141204BHJP A61P 5/30 20060101ALI20141204BHJP A61P 19/10 20060101ALI20141204BHJP A61P 3/06 20060101ALI20141204BHJP A61P 9/10 20060101ALI20141204BHJP A61P 25/24 20060101ALI20141204BHJP A61P 25/28 20060101ALI20141204BHJP A61P 15/12 20060101ALI20141204BHJP A61P 27/02 20060101ALI20141204BHJP A61P 27/12 20060101ALI20141204BHJP A61P 27/04 20060101ALI20141204BHJP A61P 17/14 20060101ALI20141204BHJP A61P 17/16 20060101ALI20141204BHJP A61K 8/35 20060101ALI20141204BHJP A61Q 7/00 20060101ALI20141204BHJP A61Q 19/00 20060101ALI20141204BHJP A61Q 19/08 20060101ALI20141204BHJP JPA61K31/11A61P43/00 111A61P5/30A61P19/10A61P3/06A61P9/10 101A61P25/24A61P25/28A61P15/12A61P27/02A61P27/12A61P27/04A61P17/14A61P17/16A61K8/35A61Q7/00A61Q19/00A61Q19/08 Ａ６１Ｋ ３１／１１ Ａ６１Ｋ ８／３５ Ａ６１Ｐ ３／０６ Ａ６１Ｐ ５／３０ Ａ６１Ｐ ９／１０ Ａ６１Ｐ １５／１２ Ａ６１Ｐ １７／１４ Ａ６１Ｐ １７／１６ Ａ６１Ｐ １９／１０ Ａ６１Ｐ ２５／２４ Ａ６１Ｐ ２５／２８ Ａ６１Ｐ ２７／０２ Ａ６１Ｐ ２７／０４ Ａ６１Ｐ ２７／１２ Ａ６１Ｐ ４３／００ Ａ６１Ｑ ７／００ Ａ６１Ｑ １９／００ Ａ６１Ｑ １９／０８ ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） 特開２００５−３４３８７３（ＪＰ，Ａ） 特開２０００−１６９３５９（ＪＰ，Ａ） Journal of Organic Chemistry，１９８２年，47(13)，p.2531-2536 Planta Medica，２００１年，67(1)，p.79-81 薬学雑誌，１９９４年，114(12)，p.980-994 8 2012153673 20120816 12 20131220 近藤 政克 本発明は、アンドロゲンからエストロゲンを生合成する酵素であるアロマターゼの活性を増強するアロマターゼ活性化剤に関する。 エストロゲンは、ヒトにおいては主に卵巣で生成され、体内で女性ホルモンとして作用する。エストロゲンとしては、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール等が知られている。 エストロゲンは、子宮内膜の増殖、性機能の調節、骨代謝の調節、脂質代謝の調節等様々な生理機能に関与する。加齢や卵巣機能の低下に伴って体内のエストロゲンが欠乏すると、更年期障害、性機能低下、自律神経失調症、脂質代謝異常、血管運動障害、骨粗鬆症等の症状が現れる。 従って、上記症状を改善するためのホルモン補充療法が試みられている。しかし、症状に応じた適切や量のホルモン剤を外部投与することは容易ではなく、またエストロゲン又はエストロゲン様物質の直接投与には、乳癌、子宮癌等の様々な副作用のリスク伴うことが知られている。生来のホルモン分泌のように、マイルドで、安全に、エストロゲン欠乏を補う方法が求められている。 アロマターゼは、コレステロールから生成されたアンドロゲンをエストロゲン（エストラジオール）に変換する作用を有するエストロゲン合成酵素である。アロマターゼを活性化させる物質としては、従来、アマチャ、アルニカ、ウイキョウ、ウコン、エンゴサク、エンメイソウ、オウゴン、ガジュツ、キササゲ、キジツ、クマザサ、ケイガイ、ケツメイシ、コウボク、ゴシュユ、サイコ、サイシン、サンショウ、ショウズク、ゼニアオイ、センキュウ、トウキ、トマト、ハマボウフウ、ビャクジュツ、ヘチマ、ベニバナ、ガマ、ユリ、リュウタン、ロジン、イリス根、オドリコソウ、オノニス、カンゾウ、クジン、グレープフルーツ、ケイヒ、ゲンチアナ、コウキ、コンズランゴ、サルビア、サンザシ、サンヤク、ショウキョウ、ショウブ、シラカバ、スイカズラ、セイヨウサンザシ、セイヨウノギリソウ、ソウハクヒ、タイム、チョウジ、チンピ、トウヒ、トラガント、ハマメリス、ビャクシ、ブッチャーブルーム、ボウイ、ボウコン、ボウフウ、ホップ、マオウ、ラベンダー、リンゴ、レイシ、レタス、レモン、ローマカミツレ及びワレモコウより選ばれる植物若しくはそれらの抽出物、ならびに酵母エキス、絹タンパク抽出物、乳タンパク質、トレハロース、納豆エキス、ローヤルゼリー、オリザオイル、加水分解コムギエキス、シアバター、及び米発酵エキスが知られている（特許文献１及び２）。特開第2005-343872号公報特開第2005-343873号公報 本発明は、アンドロゲンからエストロゲンを生合成する酵素であるアロマターゼ活性を増強することにより、安全に体内のエストロゲン生成を促進させることのできる、アロマターゼ活性化剤に関する。 本発明者らは、アロマターゼの活性を増強する物質について検討したところ、アロマターゼを活性化する作用を有するトリテルペン型化合物を見出した。 すなわち、本発明は以下を提供する。（１）下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中のａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するアロマターゼ活性化剤。（２）（１）記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するエストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善剤。（３）上記エストロゲン欠乏性疾患又は症状が、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、うつ病、記憶障害、アルツハイマー病、更年期障害、黄斑変性、白内障、ドライアイからなる群より選択される（２）記載の予防及び／又は改善剤。（４）（１）記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する毛成長調節剤。（５）（１）記載の化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する皮膚老化改善剤。（６）アロマターゼ活性化方法であって、下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中のａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を細胞に添加する工程を含む方法。 本発明のアロマターゼ活性化剤は、体内のエストロゲン生成を促進させ、且つ人体に対する安全性が高いことから、エストロゲン欠乏に起因する各種病変の予防、改善又は治療を目的とした医薬又は化粧料等として有用である。 本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。 本明細書において、「改善」とは、疾患又は症状の好転、疾患又は症状の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。 本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。 本明細書において、「皮膚老化」とは、エストロゲン欠乏に起因する表皮・真皮厚の減少、皮膚水分量の減少、血行障害、コラーゲンの減少、弾力性の低下、シワの増加等の状態を含む。 本発明のアロマターゼ活性化剤は、下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中のａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする。 式（Ｉ）化合物の塩としては、医薬又は化粧料に使用され薬理学的に許容される塩が挙げられる。当該塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、エチレンジアミン塩、ｔ−オクチルアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機アミン塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩等のアミノ酸塩が挙げられる。 式（Ｉ）化合物又はその塩の溶剤和物としては、式（Ｉ）化合物を溶媒に溶解させて得られた通常の溶媒和物（例えば水和物）の他、式（Ｉ）化合物又はその塩が、大気中から、又は再結晶により、水分を吸収して形成された水和物が挙げられる。 上記式（Ｉ）化合物は、後記実施例に示すように、アロマターゼ活性を増強する作用を有する。また、式（Ｉ）化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物によれば、アロマターゼが活性化されることにより生体内のエストロゲン合成が促進され、それによって、エストロゲンに起因する以下のような疾患、症状又は状態（からだの科学 No219 2001 日本評論社；女性ホルモンの作用と性差の出現、玉舎輝彦 著、金芳堂、2006年）に対する作用効果を得ることができる。 １）骨代謝に関する作用：副甲状腺ホルモンの働きを抑えて、骨吸収を抑制し、また腎臓でのビタミンＤの活性化を促進し、骨粗鬆化を抑制する。 ２）高脂血症に関する作用：エストロゲンの濃度低下によりＬＰＬ（リポタンパクリパーゼ）活性が亢進されてＬＤＬ受容体数が減少し、血中にＬＤＬが蓄積して粥状硬化に進展することを防ぐ；血管内皮に存在するｍＲＮＡの発現を増加させ、ＮＯ産生を亢進する；抗酸化作用、血管拡張作用を促進し、動脈硬化に対して抑制的に作用する。 ３）脳機能に関する作用：記憶、認知機能、脳血流の変化等の脳機能を改善し、感情や情緒にも影響を与え、うつ病との関連も報告されている。特に、アルツハイマー病に関し、（１）(i)神経細胞に作用し、Ａｃｈ（アセチルコリン）合成酵素（コリンアセチルトランスフェラーゼ）の活性を増加する、(ii)コリン作動性ニューロンでの神経成長因子（ＮＧＦ）や脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の受容体などの発現を刺激する、(iii)海馬においてシナプスを増加する、(iv)アミロイド前駆タンパク（ＡＰＰ）に作用して、β−アミロイドの蓄積を減少させて神経細胞の損傷を軽減する、(ｖ)脳内の糖輸送と糖利用を高める。 ４）更年期障害に関する作用：エストロゲンの減少により視床下部−下垂体−卵巣系でのネガティブフィードバックが作動せず、視床下部、下垂体が機能亢進状態になること、すなわちＬＨ（黄体化ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）が増加することにより引き起こされる自律神経失調症状を改善する。 ５）眼に関する作用：更年期以降の女性に多発する黄斑変性や白内障の発症を抑制する。また、涙腺機能を改善し、ドライアイを抑制する。 ６）毛に関する作用：頭髪に対しては成長期を延長することで毛髪の成長を促し、体毛に対しては発毛を抑制することで、体毛密度を減少させる。 ７）美容効果：表皮・真皮厚の減少、皮膚水分量の減少、あるいは血行障害、コラーゲンの減少、弾力性の低下、シワの増加等の状態を改善する。 従って、上記式（Ｉ）化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物（以下、式（Ｉ）化合物等と称する）は、アロマターゼ活性化のため、生体のエストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善のため、毛成長調節のため、又は皮膚老化改善のための有効成分として使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する組織、器官、細胞における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。 上記エストロゲン欠乏性疾患又は症状としては、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化等の心血管障害、うつ病、アルツハイマー病等の記憶障害、更年期障害、黄斑変性、白内障、ドライアイ等が挙げられ、好ましくは、表皮・真皮厚の減少、皮膚水分量の減少、血行障害、コラーゲンの減少、弾力性の低下、シワの増加等の状態が挙げられる。 本発明によれば、上記式（Ｉ）化合物等を有効成分として含有するアロマターゼ活性化剤、エストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善剤、毛成長調節剤、及び皮膚老化改善剤が提供される。一実施形態において、これらの剤は、上記式（Ｉ）化合物等から本質的に構成される。 上記式（Ｉ）化合物等はまた、アロマターゼ活性化のため、エストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善のため、毛成長調節のため、又は皮膚老化改善のための組成物、医薬、医薬部外品、化粧料等の製造のために使用することができる。 上記組成物、医薬、医薬部外品、化粧料等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。上記式（Ｉ）化合物等は、当該組成物、医薬、医薬部外品、化粧料等に配合され、アロマターゼ活性化のため、エストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善のため、毛成長調節のため、又は皮膚老化改善のための有効成分であり得る。 当該組成物、医薬、医薬部外品、化粧料等もまた、本発明の範囲内である。 上記医薬又は医薬部外品は、上記式（Ｉ）化合物等を有効成分として含有する。当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシロール、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。 上記医薬又は医薬部外品は、上記式（Ｉ）化合物等を単独で含有していてもよく、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、滑沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該医薬や医薬部外品は、式（Ｉ）化合物のアロマターゼ活性化作用が失われない限り、他の有効成分や薬理成分を含有していてもよい。 上記医薬又は医薬部外品は、上記式（Ｉ）化合物等から、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や薬理成分を組みあわせて、常法により製造することができる。当該医薬又は医薬部外品における上記式（Ｉ）化合物等の含有量は、式（Ｉ）化合物に換算して、０．０００１〜５０質量％であればよく、０．００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０１〜１質量％とするのがより好ましい。 上記化粧料は、上記式（Ｉ）化合物等を有効成分として含有する。当該化粧料は、上記式（Ｉ）化合物等を単独で含有していてもよく、又は化粧料として許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、滑沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。また、当該化粧料は、式（Ｉ）化合物のアロマターゼ活性化作用が失われない限り、他の有効成分や化粧成分、例えば、保湿剤、美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）等を含有していてもよい。 化粧料とする場合の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧料に使用され得る任意の形態が挙げられる。 上記化粧料は、上記式（Ｉ）化合物等から、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や化粧成分を組みあわせて、常法により製造することができる。当該化粧料における上記式（Ｉ）化合物等の含有量は、式（Ｉ）化合物に換算して、０．０００１〜５０質量％であればよく、０．００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０１〜１質量％とするのがより好ましい。 また本発明は、アロマターゼを活性化する方法を提供する。当該方法は、アロマターゼ発現能を有し且つアロマターゼを活性化させたい対象に、上記式（Ｉ）化合物等を添加又は投与する工程を含む。投与対象としては、動物由来の組織、器官、細胞、又はそれらの分画物、ならびにアロマターゼ活性化を必要とする動物が挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。 対象が培養細胞の場合、上記方法は、当該細胞を上記式（Ｉ）化合物等の存在下で培養することによって行われ得る。 また本発明によれば、上記式（Ｉ）化合物等は、エストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善のため、それらを必要とする対象に有効量で投与され得る。 投与の対象としては、当該エストロゲン欠乏性疾患又は症状に罹患している動物、その疑いのある動物、又はその危険性の高い動物が挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。 また本発明によれば、上記式（Ｉ）化合物等は、生体の毛成長調節のため、それを必要とする対象に有効量で投与され得る。 また本発明によれば、上記式（Ｉ）化合物等は、生体の皮膚老化改善のため、それを必要とする対象に有効量で投与され得る。 投与対象としては、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物が挙げられ、より好ましくはヒトである。好ましくは、これらの投与は、美容目的での毛成長調節又は皮膚老化を企図して、非治療的に行われる。 式（Ｉ）化合物等を添加又は投与する濃度は、対象が培養細胞の場合は、式（Ｉ）化合物に換算した培養物中の最終濃度として０．０００００００１〜１.０％（ｖ/ｖ）であり、好ましくは０．００００００１〜０.１％（ｖ/ｖ）であり、より好ましくは０．０００００１〜０.０１％（ｖ/ｖ）であり、成人に投与する場合、式（Ｉ）化合物に換算して一日あたり、０．０００００１〜１００００ｍｇ／ｋｇとすればよく、０．００００１〜１０００ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇがより好ましい。 以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。製造例１：化合物１及び２の調製 イリス根（オリスルート：株式会社栃本天海堂）２０００ｇにヘキサン２３Ｌを加え、室温で５日間抽出を行った。抽出液を減圧濃縮し、抽出物２５．７ｇを得た。この抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１→クロロホルム：メタノール＝７：１）により分画し、分画物４．６５ｇを得た。次に、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（メタノール→エタノール→イソプロピルアルコール）により分画し、分画物１．２１ｇを得た。次に、得られた画分１．２１ｇのうち０．１２ｇを用いＯＤＳ分取（水：アセトニトリル＝４：６→０：１０）により分画し、分画物１４．８ｍｇを得た。次に、ＯＤＳリサイクル分取（水：アセトニトリル＝１５：８５）でリサイクル４回目で溶出の９４分および１０２分ピークを分取した。１０２分ピークは、さらにＯＤＳリサイクル分取（水：メタノール＝１０：９０）でリサイクル７回目で溶出の７１分ピークを分取し化合物１を４．４ｍｇ得た。また、９４分ピークは、さらにＯＤＳリサイクル分取（水：メタノール＝１０：９０）でリサイクル７回目で溶出の５２分ピークを分取し化合物２を１．２ｍｇ得た。 化合物１ 1H-NMR (CDCl3,δppm): 0.62(s, 3H), 0.83(d, J=6.7Hz, 3H), 0.86(s, 3H), 1.09(s, 3H), 1.16(s, 3H), 1.54(s, 3H), 1.69(s, 3H), 1.84(br s, 3H), 1.0~2.2(m, 20H), 2.58(m, 2H), 3.31(d, J=9.5Hz, 1H), 3.60(t, J=6.4Hz, 2H), 4.98(m, 1H), 5.31(m, 1H), 10.2(s, 1H) 化合物２ 1H-NMR (CDCl3,δppm): 0.52(s, 3H), 0.82(d, J=6.7Hz, 3H), 0.94(s, 3H), 1.09(s, 3H), 1.17(s, 3H), 1.52(s, 3H), 1.84(br s, 3H), 1.0〜2.2(m, 21H), 2.27(m, 1H), 2.57(m, 2H), 3.31(d, J=9.5Hz, 1H), 3.61(t, J=6.4Hz, 2H), 4.50(br s, 1H), 4.81(br s, 1H), 4.93(t, J=7.0Hz, 1H), 10.2(s, 1H)試験例１：本発明化合物のアロマターゼ活性化効果 Stampfer MJ, Willett WC, Colditz GA, Rosner B, Speizer FE and Hennenkens CH, N. Engl. J. Med., 313, 1044-1049, 1985を参考に、製造例１で調製した化合物１及び２のアロマターゼ活性化効果を調べた。 ２４穴細胞培養プレート(FALCON)に、ヒト皮膚由来線維芽細胞（HDF1616：KURABO）を播種し、コンフルエントになるまで培養した。培地を除き、無血清培地９００μＬを加えて２４時間培養した。その際、ウェルには、本発明化合物の最終濃度が４．６５×１０-6ｍｏｌ／Ｌとなるように９５％エタノール水溶液を用いて調製した化合物１又は化合物２を加えた。また、コントロールとして９５％エタノール水溶液を加えたものと、何も添加しないもの（非添加）を用意した。 アロマターゼの基質である1β-3H-androst-4-ene-3, 17-dione (PerkinElmer)を３７ｋＢｑ／１００μＬとなる様に無血清培地に加え、各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。１ウェルから９００μＬを２ｍＬチューブにとり、１ｍＬのＣＨＣｌ3を加え激しく攪拌した。１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して上層（水層）を別のチューブに移した。Charcoal/Dextran（Charcoal, dextran coated（SIGMA）、５ｇを５０ｍＬのＨ2Ｏに懸濁したもの）２００μＬを加えてよく混ぜ、３０分間室温で放置した。１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を新しいチューブに移した。１ｍＬのＣＨＣｌ3を加え激しく攪拌し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心して上層（水層）をUltimaGold（PerkinElmer）５ｍＬに加え、液体シンチレーションカウンター（PerkinElmer Tricarb 2550）で3Ｈの放射活性を測定した。バックグラウンドとして、細胞を含まない同じ無血清培地を薬剤を加えず同様の時間インキュベートし、その後も同様の操作をして3Ｈの放射活性を測定し、上記測定値から差し引いた。 アロマターゼの反応によって、1β-3H-androst-4-ene-3, 17-dioneは3Ｈ2Ｏを放出して、放射活性のないエストゲロンに変換される。この実験法では放出された3Ｈ2Ｏの放射活性を検出しており、放射活性が高いほどアロマターゼ活性が高いことを示している。 表１に示すように、コントロール（非添加）では基質の分解がほとんどなかったのに対し、本発明化合物を添加した細胞では何れもアロマターゼ基質の分解による高い放射活性が得られたことから、本発明化合物が細胞に存在するアロマターゼを活性化することが示された。 下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中の結合ａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物又はその溶媒和物を有効成分として含有するアロマターゼ活性化剤。 下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中の結合ａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物又はその溶媒和物を有効成分として含有するエストロゲン欠乏性疾患又は症状の予防及び／又は改善剤。 前記エストロゲン欠乏性疾患又は症状が、骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化、うつ病、記憶障害、アルツハイマー病、更年期障害、黄斑変性、白内障、ドライアイからなる群より選択される請求項２記載の予防及び／又は改善剤。 下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中の結合ａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物又はその溶媒和物を有効成分として含有する毛成長調節剤。 前記毛成長調節が、頭髪の成長促進又は体毛の発毛抑制である請求項４記載の毛成長調節剤。 下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中の結合ａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物又はその溶媒和物を有効成分として含有する皮膚老化改善剤。 前記皮膚老化が、表皮・真皮厚の減少、皮膚水分量の減少、血行障害、コラーゲンの減少、弾力性の低下、及びシワの増加からなる群より選択される請求項６記載の皮膚老化改善剤。 下記式（Ｉ）：（式中、破線は二重結合であってもよいことを示す。但し、式中の結合ａ及びｂが同時に二重結合となることはない）で示される化合物又はその溶媒和物を有効成分として含有する皮膚外用剤。

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