生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_高エステル生成蒸留酒用酵母 |
| 出願番号： | 2011006436 |
| 年次： | 2012 |
| IPC分類： | C12N 1/16,C12G 3/02,C12G 3/06,C12G 3/04,C12G 3/12 |
特許情報キャッシュ
稲橋 正明 武藤 貴史 岡崎 直人 石川 雄章 JP 2012147680 公開特許公報(A) 20120809 2011006436 20110114 高エステル生成蒸留酒用酵母 公益財団法人 日本醸造協会 501084042 松本 久紀 100097825 松本 紀一郎 100137925 水野 基樹 100158698 稲橋 正明 武藤 貴史 岡崎 直人 石川 雄章 C12N 1/16 20060101AFI20120713BHJP C12G 3/02 20060101ALI20120713BHJP C12G 3/06 20060101ALI20120713BHJP C12G 3/04 20060101ALI20120713BHJP C12G 3/12 20060101ALI20120713BHJP JPC12N1/16 ZC12G3/02 119GC12G3/06C12G3/04C12G3/12 7 ＯＬ 12 4B015 4B065 4B015LG02 4B015LG03 4B015LH10 4B015LP02 4B015MA03 4B015NB02 4B015NP02 4B065AA80X 4B065AB01 4B065AC02 4B065AC14 4B065AC20 4B065BA01 4B065BA16 4B065BA25 4B065CA12 4B065CA42 本発明は、高エステル生成蒸留酒用酵母及びその育種方法、当該酵母を用いた蒸留酒の製造方法等に関する。 清酒、ビール、焼酎、ワインなどの酒類をはじめとして、酵母を用いて醸造・発酵により製造される食品は数多くある。これらの食品の品質は、用いる酵母の性質（特性）に影響されることが多く、より良い品質の製品を製造する目的のため、既存の酵母より優れた特性を有する優良酵母を育種する試みが盛んに行われている。 そして近年、特に酒類についての多様化の要望が高まり、清酒だけでなく、日本の伝統的蒸留酒である本格焼酎についても、香味の豊かな製品に対する消費者の要望が非常に高くなってきている。 このようなニーズに対応するため、香りの高い新規優良酵母の育種が行われ、例えば、香りの高い酒類を製造できる変異株酵母の取得方法の一つとして、脂肪酸合成酵素を阻害する抗生物質として知られるセルレニン耐性株より取得するカプロン酸エチル高生成酵母の取得方法（特許文献１）が開示されている。 しかし、当該特許文献によるカプロン酸エチル高生成清酒酵母は、カプロン酸エチルを高生産すると同時に不快な臭いの原因となるカプロン酸も多く生産するため、製品化に際してカプロン酸の低減が望まれる。また、当該特許文献には焼酎酵母変異株からセルレニン耐性株を取得することができることも開示されているが、この方法は焼酎酵母自体の特性からカプロン酸エチルを高生成する焼酎酵母変異株の取得が難しい。 なお、カプロン酸エチル高生成清酒酵母をそのまま蒸留酒製造に用いることができないわけではないが、焼酎や泡盛などの製造においては高温や高クエン酸濃度での発酵等が必要な場合が多く、上記のカプロン酸エチル高生成清酒酵母は高温耐性やクエン酸耐性を有していないことから、当該清酒酵母による蒸留酒製造は厳格な条件管理が必要となったりカプロン酸エチルが充分に高生成されない場合があるなど簡便且つ実用的な方法とはいえない。 このような背景技術の中で、蒸留酒製造に簡便且つ実用的に用いることができる、クエン酸耐性や高温耐性という形質を有し且つカプロン酸エチルを高生成する変異酵母の開発が、本格焼酎などを製造する蒸留酒製造業界等から強く望まれていた。特開平８−２３９５４号公報 本発明は、簡便かつ容易に蒸留酒製造に用いることができる、高温耐性、クエン酸耐性、及びカプロン酸エチル高生成能を有し、且つ、香りが華やかで香味の整った蒸留酒を製造する蒸留酒製造用酵母を提供することを目的とする。 上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を行い、カプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑し、カプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する変異酵母を取得することでカプロン酸エチル含有量が高く且つ香りが華やかで香味の整った蒸留酒の簡便な製造が可能となることを見出し、本発明に至った。 すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。（１）清酒用酵母を変異処理し、セルレニン含有培地で生育する菌株からカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成清酒酵母を選択し、当該高エステル生成清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑して得られた、カプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する蒸留酒用変異酵母。（２）きょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）ときょうかいＳ−２号酵母を交雑して得られたものであること、を特徴とする（１）に記載の酵母。（３）（２）に記載の酵母である、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＳ−２−１６株（ＮＩＴＥ Ｐ−１０２１）。（４）（１）〜（３）のいずれか１つに記載の酵母を用いて醸造を行い、且つ、蒸留（減圧蒸留、常圧蒸留など）すること、を特徴とするカプロン酸エチル含有量が高く且つ香りが華やかで香味の整った蒸留酒の製造方法。（５）（４）に記載の方法で製造した蒸留酒を清酒に添加すること、を特徴とする酒類（日本酒リキュールなど）の製造方法。（６）清酒用酵母を変異処理し、セルレニン含有培地で生育する菌株からカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成清酒酵母を選択し、当該高エステル生成清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑すること、を特徴とするカプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する蒸留酒用変異酵母を育種する方法。（７）高エステル生成清酒酵母がきょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）であり、焼酎用酵母がきょうかいＳ−２号酵母であること、を特徴とする（６）に記載の方法。 本発明によれば、高温且つクエン酸濃度が高い製造条件である蒸留酒製造においても簡便に用いることができる高エステル生成酵母を取得できるため、カプロン酸エチル含有量の高い本格焼酎等の蒸留酒を簡易に製造できる。さらに、蒸留工程において不快臭であるカプロン酸が濃縮されないため、カプロン酸エチル含有量が高く（例えば蒸留酒中に８．５ｍｇ／Ｌ以上）且つ香りが華やかで香味の整った（不快臭の少ない）芳香な蒸留酒の製造が可能となる。 本発明においては、目的の蒸留酒用酵母の取得にあたり、まず「清酒用」酵母を変異処理してセルレニン含有培地で生育する菌株からカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成清酒酵母を選択する。なお、当該方法で取得した高エステル生成清酒酵母の代表例としてきょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）が挙げられる。 次に、上述の高エステル生成清酒酵母と焼酎用酵母を交雑する。焼酎用酵母は、蒸留酒製造に必要な高温耐性及びクエン酸耐性を有しているものであればどのような焼酎用酵母でも使用することができ、非限定例としてきょうかいＳ−２号酵母が挙げられる。この交雑により、蒸留酒用酵母を変異処理して選択培地で選択するよりも簡便且つ効率的に高エステル生成蒸留酒用酵母を取得できる。 なお、交雑方法は公知の手法を用いることができ、一倍体（接合型）を用いた接合法、プロトプラスト融合、形質転換、突然変異などの方法が例示される。また、マーカー遺伝子を用いて交雑株の選択を更に容易にすることもできる。 得られる高エステル生成蒸留酒用酵母のクエン酸耐性は１．０ｇ／Ｌ以上のクエン酸濃度の溶液中で耐性を有していれば良く、例えば１．０〜３．０ｇ／Ｌ（発酵液）程度のクエン酸耐性が例示される。また、高温耐性は３０℃以上、例えば３０〜３５℃で醸造（発酵）可能であれば良い。これらはいずれも、蒸留酒製造を簡易に行う上で重要な構成要素である。 本発明では、上述のような手法で目的とする優良蒸留酒用変異酵母を簡便に取得することができる。一例として挙げると、きょうかい１６０１号酵母及びきょうかいＳ−２号酵母を交雑して優良変異酵母を取得するのに成功し、ＮＳ−２−１６株と命名した。この株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２０１０年（平成２２年）１２月１７日付けでＮＩＴＥ Ｐ−１０２１として寄託された。 本発明により取得したサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＳ−２−１６株の主な菌学的性質を例示すると、以下の通りである。（ａ）ＹＭ液体培地で生育させたときの菌の形態 （１）栄養細胞の大きさ：大きさ４〜８μｍ、幅４〜６μｍ （２）栄養細胞の形状：卵形及び楕円形 （３）増殖の形式：出芽（ｂ）胞子形成の有無 胞子形成する（ｃ）生理学的・化学分類学的性質 （１）最適生育条件（ｐＨ）：５．０ （２）生育の範囲（ｐＨ）：２．７〜７．２ （３）硝酸塩の資化：− （４）脂肪の分解：− （５）尿素の分解：− （６）ゼラチンの液化：− （７）カロチノイドの生成：− （８）顕著な有機酸の生成：− （９）デンプン様物質の生成：− （１０）ビタミンの要求性：パントテン酸カルシウムは適応的に要求し（±）、ピリドキシン、イノシトール、ビオチン及びチアミンは要求しない （１１）炭素源資化性：グルコース、ガラクトース、シュクロース、マルトース、ラフィノース、フラクトース、グリセロール及びα−メチルグルコシドは資化し、ラクトース、スターチ、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−ソルビトール、メリビオース、セロビオース及びＤ−マンニトールは資化しない （１２）炭素源発酵性：グルコース、ガラクトース、シュクロース、マルトース、ラフィノース及びフラクトースは発酵し、ラクトース、スターチ、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−ソルビトール、メリビオース、セロビオース、Ｄ−マンニトール、メレジトース、トレハロース及びα−メチルグルコシドは発酵しない そして、上述のような高エステル生成蒸留酒用酵母により製造される蒸留酒中のカプロン酸エチル含量は、８．５ｍｇ／Ｌ以上（例えば、８．５〜１７．０ｍｇ／Ｌ、好適には１０．０〜１７．０ｍｇ／Ｌ、さらに好適には１５．０〜１７．０ｍｇ／Ｌ）であれば好ましい香気のものとなる。そして、本発明においては、例えば０．０１〜０．０２ＭＰａ、４０〜５０℃の減圧蒸留、９０〜１００℃の常圧蒸留などの蒸留工程によって不快臭を発するカプロン酸（ノルマルカプロン酸）と芳香成分のカプロン酸エチル及びエタノールをある程度分離することができるため、カプロン酸が蒸留液で濃縮されず且つカプロン酸エチルは濃縮され（蒸留液のカプロン酸含量はカプロン酸エチル含量より少なくなり）、香りが華やかで香味の整った芳香な蒸留酒を得ることができる。なお、本発明は、従来から不快臭を除くために行われている蒸留を２度以上操り返す操作（連続蒸留）は必ずしも必要なく、１度の蒸留（単式蒸留）でも芳香な蒸留酒を得られることが特徴である。 さらには、上述の芳香な焼酎などの蒸留酒を清酒に添加することで、新規且つ特徴的な香りを有する新規な酒類（例えば日本酒リキュール等）を製造することも可能である。また、清酒以外の酒類と混合する場合も同様である。 以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。（１）きょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）の一倍体株の分離及び接合型の決定 まず、きょうかい１６０１号酵母（高エステル生成清酒酵母）をＢａｌｌｇ．１５°麦汁培地に３０℃、２日間浸とう培養した。そして、酵母菌体を殺菌水で洗浄した後、０．４％酢酸カリウム含有寒天培地（胞子形成培地）に塗布し、３０℃、２日間培養して胞子を形成させた。この形成させた胞子を殺菌水で洗浄し、これに細胞壁溶解酵素（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ １００Ｔ生化学工業）０．０５％を含む２％グルコース−１／５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、３０℃、３０〜６０分作用させて細胞壁を溶解し胞子を遊離させた後、５８℃、２０分加熱し、二倍体株を滅菌処理した。その後、Ｂａｌｌｇ．１０°麹汁寒天平板培地上に塗布し、３０℃、７〜１０日間培養して一倍体株を増殖させた。 生育してきた一倍体株のコロニーをランダムに釣菌してＢａｌｌｇ．１５°麦汁培地で３０℃、３日間培養後、あらかじめ同様に培養しておいたサッカロミセス・セレビシエの標準株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ １０１７５（ＭＡＴａ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＦＯ １０１７６（ＭＡＴα）の酵母とＢａｌｌｇ．１０°麦汁寒天培地上で交叉画線し、３０℃、３日間培養した後、交叉部分の一部を釣菌してＢａｌｌｇ．１０°麦汁培地で、３０℃、２日間培養後、前記同様に胞子形成培地にて胞子を形成させ交雑後の接合子形成の有無によりＫ−１６０１号酵母の一倍体の接合型を決定した。これにより得られた一倍体株を１６０１−Ｈｐ１（接合型（ＭＡＴａ））とした。（２）きょうかい１６０１号酵母の一倍体株１６０１−Ｈｐ１（接合型（ＭＡＴａ））と焼酎酵母きょうかいＳ−２号酵母（Ｓ−２株）の交雑 きょうかいＳ−２号酵母（Ｓ−２株）をＹＰＤ培地に３０℃、２４時間浸とう培養した酵母菌体を殺菌水で洗浄した後、これに細胞壁溶解酵素（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ １００Ｔ生化学工業）０．０５％を含む１／１５Ｍリン酸緩衝液（０．６Ｍ ＫＣｌ含有 ｐＨ７．６）を用いて、３０℃、３０〜６０分作用させて細胞壁を溶解し胞子を遊離させた。その後、５５℃、１０分加熱し、二倍体株を滅菌処理した後、この反応液中の胞子及びきょうかい１６０１号酵母の一倍体株１６０１−Ｈｐ１（接合型（ＭＡＴａ））をＹＰＤ培地にて３０℃、２４時間培養した酵母菌体をＹＡＤ培地５０ｍｌに添加したものを混合させ、２日間静置培養することにより交雑させた。一倍体株（１６０１−Ｈｐ１）、二倍体株（Ｓ−２株）及び交雑二倍体株の菌学的諸性質の比較等により交雑の確認を行い、最終的に小仕込み試験によりＮＳ−２−１６株を選択した。（３）育種株の確認 ＮＳ−２−１６株をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）１０ｍｌに植菌し、３０℃、２日間培養後、セルレニン培地（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｃａｒｂｏｎ Ｂａｓｅ ０．６７％、硫酸アンモニウム０．５％、セルレニン３ｐｐｍ、寒天２．０％）、クエン酸培地（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ０．６７％、クエン酸三ナトリウム二水和物１．５６％、寒天２．０％、ｐＨ４．０）、両培地の組み合わせによるセルレニン０．５〜２．０ｐｐｍ含有クエン酸培地（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ０．６７％、クエン酸三ナトリウム二水和物１．５６％、セルレニン０．５〜２．０ｐｐｍ、寒天２．０％、ｐＨ４．０）の各々の寒天平板培地に１シャーレあたり２００〜３００細胞数になるように塗布し、３０℃、３〜７日間培養した。これらの結果を下記表１に示した。 きょうかい１６０１号酵母の一倍体株１６０１−Ｈｐ１（接合型（ＭＡＴａ））はセルレニン培地において良く生育するのに対し、Ｓ−２株は全く生育できない特性を有する。また、Ｓ−２株はクエン酸培地において良く生育するのに対し、１６０１−Ｈｐ１は全く生育できない特性を有する。それに対し、交雑株ＮＳ−２−１６株は両培地に良く生育し、１６０１−Ｈｐ１とＳ−２株の性質とは異なることから交雑されたことが確認できる。さらに、両培地を組み合わせたセルレニン０．５〜２．０ｐｐｍ含有クエン酸培地を用いることにより１枚のシャーレによる交雑確認が可能となる。このように、各々の培地における生育性を比較した結果、ＮＳ−２−１６株は１６０１−Ｈｐ１とＳ−２株との交雑株であることを確認できた。また、セルレニン耐性が交雑株に受け継がれていることも確認できた。（１）育種株（ＮＳ−２−１６株）とＳ−２株（対照）による小仕込み発酵試験 小仕込み発酵試験は、下記表２の配合で、原料米は精米歩合９０％の白米と白麹菌を用いて、発酵温度は１次及び２次ともに２０℃及び２５℃一定で行った。 育種株（ＮＳ−２−１６株）及び一倍体株（１６０１−Ｈｐ１）の小仕込み発酵試験結果については、育種株は親株のＳ−２株及びＫ−１６０１に比べ、カプロン酸エチルを多く生成した。また、酸生成量が少なくかつ、非常に発酵力の強い株であった。親株（Ｋ−１６０１、Ｓ−２株）も含めた比較結果を表３（米製：２０℃）、表４（米製：２５℃）に示した。また、蒸留によってカプロン酸の割合が低下した、香りが華やかで香味の整った蒸留酒が得られた。この親株（Ｓ−２株）との比較結果を表５（発酵液の一般分析：２０℃）、表６（蒸留液の一般分析：２０℃）に示した。（２）育種株（ＮＳ−２−１６株）とＳ−２株（対照）による蒸留酒製造試験 育種株（ＮＳ−２−１６株）及び親株Ｓ−２株（対照株）の表７の仕込み配合での蒸留酒製造結果では、小仕込み発酵試験同様、育種株は対照株に比べカプロン酸エチルを多く生成した。また、酸生成量が少なくかつ、非常に発酵力の強い株であった。この比較結果を表８に示した。また、蒸留によってカプロン酸の割合が低下した、香りが華やかで香味の整った蒸留酒が得られた。この比較結果を表９（発酵液の一般分析：２３℃）、表１０（蒸留液の一般分析：２３℃）に示した。 なお、結果は示していないが、育種株（ＮＳ−２−１６株）は３０〜３５℃の温度においても上記結果と同様の発酵が可能であり、芳香な焼酎を簡便に製造できることが確認された。 本発明を要約すれば、以下の通りである。 本発明は、簡便かつ容易に蒸留酒製造に用いることができる、高温耐性、クエン酸耐性、及びカプロン酸エチル高生成能を有し、且つ、香りが華やかで香味の整った蒸留酒を製造する蒸留酒製造用酵母を提供することを目的とする。 そして、セルレニン含有培地で選択して得られたカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成変異清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑し、カプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する蒸留酒用変異酵母を取得することで上記課題を解決できる。 本発明において寄託された微生物の受託番号を下記に示す。（１）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＳ−２−１６株（ＮＩＴＥ Ｐ−１０２１）。 清酒用酵母を変異処理し、セルレニン含有培地で生育する菌株からカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成清酒酵母を選択し、当該高エステル生成清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑して得られた、カプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する蒸留酒用変異酵母。 きょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）ときょうかいＳ−２号酵母を交雑して得られたものであること、を特徴とする請求項１に記載の酵母。 請求項２に記載の酵母である、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＳ−２−１６株（ＮＩＴＥ Ｐ−１０２１）。 請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母を用いて醸造を行い、且つ、蒸留すること、を特徴とするカプロン酸エチル含有量が高く且つ香りが華やかで香味の整った蒸留酒の製造方法。 請求項４に記載の方法で製造した蒸留酒を清酒に添加すること、を特徴とする酒類の製造方法。 清酒用酵母を変異処理し、セルレニン含有培地で生育する菌株からカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成清酒酵母を選択し、当該高エステル生成清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑すること、を特徴とするカプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する蒸留酒用変異酵母を育種する方法。 高エステル生成清酒酵母がきょうかい１６０１号酵母（Ｋ−１６０１）であり、焼酎用酵母がきょうかいＳ−２号酵母であること、を特徴とする請求項６に記載の方法。 【課題】簡便かつ容易に蒸留酒製造に用いることができる、高温耐性、クエン酸耐性、及びカプロン酸エチル高生成能を有し、且つ、香りが華やかで香味の整った蒸留酒を製造する蒸留酒製造用酵母を提供する。【解決手段】セルレニン含有培地で選択して得られたカプロン酸エチルを多く生成する高エステル生成変異清酒酵母と焼酎用酵母とを交雑し、カプロン酸エチルを多く生成し、且つ、高温耐性及びクエン酸耐性を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する蒸留酒用変異酵母を取得する。【選択図】なし