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チャポトー，エディ エドワーズ，リチャード スウィルスキー，チェスター ザズラク，ウロディミール JP 2011503632 公表特許公報(A) 20110127 2010535022 20081118 糖化ヘモグロビン検出法 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 507269175 ＳＩＥＭＥＮＳ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＩＮＣ． 津国 肇 100078662 齋藤 房幸 100116919 チャポトー，エディ エドワーズ，リチャード スウィルスキー，チェスター ザズラク，ウロディミール US 60/989,210 20071120 G01N 33/72 20060101AFI20101224BHJP G01N 33/53 20060101ALI20101224BHJP G01N 30/88 20060101ALI20101224BHJP G01N 33/543 20060101ALI20101224BHJP C12Q 1/37 20060101ALI20101224BHJP JPG01N33/72 AG01N33/53 VG01N30/88 QG01N33/543 581AG01N33/543 581HC12Q1/37 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RS,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN,ZA,ZM,ZW US2008083847 20081118 WO2009067421 20090528 19 20100720 2G045 4B063 2G045AA13 2G045CA25 2G045DA45 2G045FB03 2G045FB06 4B063QA01 4B063QA18 4B063QQ03 4B063QQ79 4B063QR16 4B063QR48 4B063QR54 4B063QR66 4B063QR72 4B063QR82 4B063QS15 4B063QS28 4B063QS33 4B063QS36 4B063QS39 4B063QX02 本発明の特定の態様は、血液中のヘモグロビン変異体の存在によって影響されない、たとえばヒト全血中の糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法に関する。発明の背景 赤血球中に存在するヘモグロビンは、ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端へのグルコース分子の非酵素的付加によって糖化されうる。ひとたびヘモグロビン分子が糖化されると、その分子は糖化されたままであり、赤血球内の糖化ヘモグロビンの蓄積が、赤血球がそのライフサイクル中に接触したグルコースの平均レベルを反映する。したがって、個人の血液中に存在する糖化ヘモグロビンのレベルは、血液中のグルコースのレベルに比例し、その個人の直前の４週〜３ヶ月の間の平均１日血中グルコース濃度の指標である。 ヒト血液中の糖化ヘモグロビンのレベルを測定する方法が数多く存在し、その大多数は、ヘモグロビンＡ（HbA）がヒト血液中に存在するヘモグロビンの主要形態であるという事実により、血液中に存在する糖化ヘモグロビンＡ（HbA1c）の相対量を計算することを含む。そのような方法では、血液中に存在するヘモグロビンの他の形態から自らを区別する糖化ヘモグロビンＡの物理的及び／又は化学的性質を利用する、高速液クロマトグラフィー及び免疫親和性選択のような技術が使用される。 しかし、ヘモグロビンβ鎖の６位のアミノ酸残基でヘモグロビンＡとは異なる、ヘモグロビンＳ（HbS）及びヘモグロビンＣ（HbC）のようなヘモグロビンの変異形態が存在する。ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの形態のヘモグロビンは糖化されえ、糖化されたヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣは、糖化ヒトヘモグロビンを定量化する現在の方法の大多数に干渉して、結果において最大４０％の上昇を生じさせることが示されている。したがって、ヘモグロビン変異体によって生じる干渉を受けない、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法の必要性が存在する。発明の概要 特定の実施態様において、本発明は、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料をエンドペプチダーゼと接触させること、エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及びヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを検出することを含む方法に関する。 他の実施態様において、本発明は、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、エンドペプチダーゼと接触させること、エンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及びヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法（凝集阻止免疫学的測定法）によって検出することを含む方法に関する。１４日間にわたり凝集試薬（ヒトヘモグロビンのポリアスパルトアミドコンジュゲートβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド）の様々な調合物によって生じた、マウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックスの凝集の速度を示す。調合物は、凝集試薬をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びプロリン特異的エンドペプチダーゼの両方を有さずに含有するもの、凝集試薬をＥＤＴＡのみとともに含有するもの及び凝集試薬をＥＤＴＡ及びプロリン特異的エンドペプチダーゼの両方とともに含有するものであった。１８日間にわたり凝集試薬（ヒトヘモグロビンのポリアスパルトアミドコンジュゲートβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド）の様々な調合物によって生じた、マウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックスの凝集の速度を示す。調合物は、凝集試薬及びプロリン特異的エンドペプチダーゼをＥＤＴＡ及びＢＳＡの両方とともに含有するもの又は凝集試薬及びプロリン特異的エンドペプチダーゼをＢＳＡのみとともに含有するものであった。ADVIA（登録商標）1650HbA1c法を使用して計算された、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して計算された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して、凝集試薬及び０．０U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応した、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在することが測定された糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して測定された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して、凝集試薬及び０．１U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応した、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在することが測定された糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して測定された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して、凝集試薬及び０．２U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応した、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在することが測定された糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して測定された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して、凝集試薬及び０．３３U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応した、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在することが測定された糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して測定された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して、凝集試薬及び０．４３U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応した、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在することが測定された糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して測定された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して、凝集試薬及び０．５４U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応した、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中に存在することが測定された糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して測定された、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合に対してプロットした相関傾きを示す。プロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度に対してプロットした、図３〜９に示す相関傾きの値を示す。例示的実施態様の詳細な説明 本発明の特定の態様は、ヘモグロビンβ鎖中に存在することができるアミノ酸配列の変異によって影響されない、ヒト血液中に存在する糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法に関する。方法は、試料中のすべての糖化ヘモグロビンを、糖化されたヘモグロビンの形態にかかわりなく検出し、したがって、糖化されたヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを検出する。 ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣは、ヒトヘモグロビンβ鎖の６位に点変異を含む。ヘモグロビンＡのβ鎖の６位のグルタミン酸残基が、ヘモグロビンＣ中ではリシン残基によって置換されており、ヘモグロビンＳ中ではバリン残基によって置換されている。ヒトヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣのβ鎖の糖化アミノ末端１８アミノ酸を以下に示す。 プロリン特異的エンドペプチダーゼ（ＰＳＥ）は、ヒトヘモグロビンβ鎖の５位のプロリン残基のカルボキシ側を選択的に開裂させる。したがって、プロリン特異的エンドペプチダーゼによる、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有する試料の消化は、ヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣそれぞれの場合で同じ糖化ペンタペプチドを生じさせる。 本発明の特定の実施態様は、エンドペプチダーゼ処理されたヒトヘモグロビン含有試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼで消化して、ヒトヘモグロビンβ鎖の糖化又は非糖化アミノ末端ペンタペプチドを解放することを含む方法に関する。そして、試料中の糖化ペンタペプチドのレベルを定量化して、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの量を表示することを提供することができる。 本明細書で使用される語「検出」、「検出すること」及びそのすべての変化形は、試料中に存在する糖化ヒトヘモグロビン又は糖化ヒトヘモグロビンのアミノ末端ペンタペプチドの量にかかわらず、また、そのペプチドが由来する試料中のヘモグロビンの形態にかかわらず、試料中に存在する糖化ヒトヘモグロビン又は糖化ヒトヘモグロビンのアミノ末端ペンタペプチドの存在を定量的に決定するために使用される任意の方法をいう。 本明細書に使用される語「糖化ヒトヘモグロビン」とは、酵素の作用なしでグルコース分子がヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端に結合している、任意の形態のヒトヘモグロビンをいう。語「ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド」とは、酵素の作用なしでグルコース分子がペンタペプチドのアミノ末端に結合している、任意の形態のヒトヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端ペンタペプチドをいう。 本明細書で使用される語「接触すること」、「接触」及びそのすべての変化形は、部分又は成分が互いに物理的に接触するような、部分又は成分の集った配置を直接的又は間接的に生じさせる任意の手段をいう。たとえば、接触は、部分又は成分を容器の中にいっしょに入れる、部分又は成分を結合する、部分又は成分を混合するような物理的行為を含む。 本明細書で使用される語「エンドペプチダーゼ」とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中のペプチド結合を加水分解する任意の酵素をいう。 本明細書で使用される語「酸エンドペプチダーゼ」とは、酸性環境においてペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中のペプチド結合を加水分解する任意の酵素をいう。 本明細書で使用される語「混合すること」、「混合」及び「付加」ならびにそれらのすべての変化形は、部分又は成分が互いに隣接するような、部分又は成分の集った配置を直接的又は間接的に生じさせる任意の手段をいう。これらの語は、部分又は成分を容器の中にいっしょに入れる、部分又は成分を結合する、部分又は成分を接触させる、部分又は成分をいっしょにかく拌する、渦をまかせる、又は振盪するような行為を含む。語「混合物」とは、隣接して集って配置された部分又は成分をいう。 本発明の特定の態様は、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料をエンドペプチダーゼと接触させること、エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及び試料中に存在するヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを検出することを含む方法に関する。 本発明の好ましい実施態様において、試料はヒト全血である。 本発明の特定の実施態様においては、試料中の糖化ヒトヘモグロビンの割合を測定する。そのような方法においては、試料中の糖化ヒトヘモグロビンの濃度を測定し、また、糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビンの両方を含む全ヘモグロビンの濃度を測定する。糖化ヘモグロビンの濃度を全ヘモグロビンの濃度で割ることにより、試料中の糖化ヒトヘモグロビンの割合を計算する。 試料中の全ヘモグロビン濃度は、たとえば、参照により全部が本明細書に組み込まれるWolf, H.U., et al, Clin Chim Acta, 1984, 136, 95-104及びZander R., et al., Clin Chim Acta, 1984, 136, 83-93に記載されているような、非イオン洗浄剤のアルカリ性溶液を用いる処理によって全ヘモグロビン誘導体をアルカリ性ヘマチンに転換することに基づくアッセイ（測定）法をはじめとする、当業者には周知の方法を使用して測定することができる。アルカリ性ヘマチンは６００nmで所定の吸収スペクトルを有し、ヘマチン含量は、６００nmでの吸収を測定することによって計測することができる。 はじめに、任意のエンドペプチダーゼを使用して試料中に存在するヒトヘモグロビンを消化したのち、プロリン特異的エンドペプチダーゼで消化することができる。エンドペプチダーゼ消化は、手作業で実施することもできるし、試料希釈が可能である化学システム上で自動的に実施することもできる。 本発明の特定の実施態様において、エンドペプチダーゼは酸エンドペプチダーゼである。本発明の好ましい実施態様において、酸エンドペプチダーゼは、ペプシン、アスペルギロペプシンII、カテプシンＤ、サッカロペプシン、ムコールペプシン、キモシン、ガストリシン又はphysirolisinである。特に好ましい実施態様において、酸エンドペプチダーゼはペプシンである。本発明の特定の態様においては、試料は、約５U/mL〜約１０，０００U/mLのペプシンで消化される。好ましい実施態様においては、試料は、約４，８００U/mL〜約８，６００U/mLのペプシンで消化される。特に好ましい実施態様においては、試料は、約６，０００U/mL〜約７，０００U/mLのペプシンで消化される。本発明の特定の実施態様において、ペプシン消化は、約１．０〜約５．０の範囲のpHで実施される。本発明の好ましい実施態様において、ペプシン消化は、約２．０〜約４．０の範囲のpHで実施される。本発明の特に好ましい実施態様において、ペプシン消化は、約２．３〜約２．５の範囲のpHで実施される。 本発明の特定の実施態様において、エンドペプチダーゼ消化ののち、試料はプロリン特異的エンドペプチダーゼで消化される。特定の実施態様においては、そのような試料は、約０．１U/mL〜約３０U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼで処理される。好ましい実施態様において、そのような試料は、約０．３U/mL〜約５．０U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼで処理される。特に好ましい実施態様において、そのような試料は、約０．５U/mL〜約０．８U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼで処理される。本発明の特定の実施態様において、そのようなプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化は、約５．０〜約９．０の範囲のpHで実施される。本発明の好ましい実施態様において、そのようなプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化は、約６．０〜約８．０の範囲のpHで実施される。本発明の特に好ましい実施態様において、そのようなプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化は、約６．９〜約７．１の範囲のpHで実施される。 エンドペプチダーゼ及びプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化ののち解放されるヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドは、たとえば、高速液クロマトグラフィーの使用を含む方法又は糖化ペンタペプチドへの少なくとも一つの抗体（ポリクロナール又はモノクロナール）の結合を含む方法をはじめとする任意の方法によって検出することができる。 本発明の好ましい実施態様において、ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドは、たとえば、参照により全部が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８４７，２０９号に記載されているような凝集阻止イムノアッセイ法によって検出される。そのようなアッセイ法の具体的な例においては、ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを含有する試料を凝集試薬、たとえば、ポリアスパルトアミドにコンジュゲートした糖化val-his-leu-thr-tyr-cysセキサペプチドと混合する。また、試料を抗体と混合する。本発明の好ましい実施態様において、抗体は、ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド及び凝集試薬の両方に特異的に結合する。本発明の特定の態様においては、少なくとも一つの抗体分子が一つ以上のラテックス粒子に結合している。好ましい抗体としては、たとえば、ラテックスコートされたマウスモノクロナール抗HbA1c抗体がある。 そのような凝集阻止イムノアッセイ法において、試料中のヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化ペンタペプチドは、抗体結合部位を求めて凝集試薬と競合し、凝集速度を低下させ、この凝集速度の低下は、凝集試薬がラテックスコートされた抗体に結合するときに起こる。試料中に存在するヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化ペンタペプチドが多ければ多いほど、凝集速度は遅くなる。したがって、凝集速度は、試料中に存在するヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化ペンタペプチドの濃度の指標を提供する。 エンドペプチダーゼ消化、プロリン特異的エンドペプチダーゼ消化及び凝集阻止イムノアッセイ法は、様々な方法で実施することができる。たとえば、本発明の特定の実施態様においては、まず、試料をエンドペプチダーゼで消化し、次に、エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと反応させ、その後、試料を凝集試薬と接触させ、次いで抗体と接触させる。本発明の他の実施態様においては、まず、試料をエンドペプチダーゼで消化し、次に、エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物と接触させ、その後、抗体と接触させる。本発明のさらなる実施態様においては、まず、試料をエンドペプチダーゼで消化し、次に、エンドペプチダーゼ処理された試料を凝集試薬と接触させ、その後、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させ、次いで抗体と接触させる。 したがって、本発明の特定の態様は、試料をエンドペプチダーゼと接触させること、及びエンドペプチダーゼ処理された試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることを含む方法に関する。 本発明の好ましい実施態様においては、エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物と接触させる。そのような実施態様の特定の例において、プロリン特異的エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物は、約０．１g/dL〜約５．０g/dLのウシ血清アルブミン及び約０．５mmol/L〜約１０．０mmol/Lのエチレンジアミン四酢酸を含み、約６．０〜約８．０の範囲のpHを有する。そのような実施態様の好ましい例において、プロリン特異的エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物は、約１．０g/dL〜約２．０g/dLのウシ血清アルブミン及び約１．０mmol/L〜約５．０mmol/Lのエチレンジアミン四酢酸を含み、約６．０〜約８．０の範囲のpHを有する。そのような実施態様の特に好ましい例において、プロリン特異的エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物は、約１．４g/dL〜約１．６g/dLのウシ血清アルブミン及び約２．９mmol/L〜約３．１mmol/Lのエチレンジアミン四酢酸を含み、約６．０〜約８．０の範囲のpHを有する。 本発明の特定の実施態様は、試料を、エンドペプチダーゼ及び凝集試薬と接触させたのち、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させる、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法に関する。そのような方法における試料がヒト全血であるならば、場合によっては試料をはじめにたとえば生理食塩水で希釈してもよい。 したがって、本発明の特定の態様は、試料を、エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物と接触させたのち、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させ、次いで抗体と接触させることを含む方法に関する。本発明の他の実施態様は、試料を、エンドペプチダーゼと凝集試薬との混合物と接触させたのち、プロリン特異的エンドペプチダーゼと抗体との混合物と接触させることを含む方法に関する。本発明のさらなる実施態様は、試料を、凝集試薬と接触させたのち、ペプシンと接触させ、その後、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させ、次いで抗体と接触させることを含む方法に関する。本発明のさらなる態様は、試料を、凝集試薬と接触させたのち、ペプシンと接触させ、その後、プロリン特異的エンドペプチダーゼと抗体との混合物と接触させることを含む方法に関する。本発明の他の態様は、試料を、ペプシンと接触させたのち、凝集試薬と接触させ、その後、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させ、その後、抗体と接触させることを含む方法に関する。本発明の特定のさらなる実施態様は、試料を、ペプシンと接触させたのち、凝集試薬と接触させ、その後、プロリン特異的エンドペプチダーゼと抗体との混合物と接触させることを含む方法に関する。 したがって、本発明の態様は、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、エンドペプチダーゼと接触させること、エンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及びヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法によって検出することを含む方法に関する。そのような方法の好ましい実施態様においては、試料を、好ましくは約３U/mL〜約１００U/mLのペプシンを含み、約１．０〜約４．０の範囲のpHを有する、ペプシンと凝集試薬との混合物と接触させる。 本発明のさらなる態様は、糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、エンドペプチダーゼと接触させること、エンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料を、ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド及び凝集試薬の両方に特異的に結合する抗体と接触させると同時に又は接触させる前に、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及びヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法によって検出することを含む方法に関する。そのような方法の好ましい実施態様においては、エンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料を、好ましくは約２．０U/mL〜約３０．０U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼを含み、約７．０〜約８．０の範囲のpHを有する、プロリン特異的エンドペプチダーゼと抗体との混合物と接触させる。 以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を例示するものであるが、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。実施例１：ペプシン及びプロリン特異的エンドペプチダーゼによるヒト全血試料の消化 DCA N（正常対照、DCA（登録商標）2000アナライザ試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）又はDCA AB（異常対照、DCA（登録商標）2000アナライザ試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）７．５μLを、２５０U/mLのペプシンを含有する１５０μLの試料変性試薬（ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）とともに、室温で２０分間インキュベート（培養）した。０．１mol/Lのリン酸緩衝液（pH７．０）中の１５０μLのプロリン特異的エンドペプチダーゼ（３０U/mL）を、ペプシン処理された試料の半分に加え、プロリン特異的エンドペプチダーゼ処理された試料を室温で３０分間インキュベートした。残りのペプシン処理された試料は、プロリン特異的エンドペプチダーゼでは処理せず、０．１mol/Lのリン酸緩衝液（pH７．０）１５０μLをこれらの試料に加えた。 次いで、すべての試料を、マウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックスの混合物（ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キットR1、Siemens Medical Solutions Diagnostics）に加えたのち、ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド（凝集試薬、ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キットR2、Siemens Medical Solutions Diagnostics）を加えることにより、ADVIA（登録商標）1650計器上で、凝集阻止イムノアッセイ法で試験した。試料中のヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化ペンタペプチドは、抗体結合部位を求めて凝集試薬と競合し、凝集速度を低下させ、この凝集速度の低下は、凝集試薬がラテックスコートされた抗体に結合するときに起こる。試料のヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化ペンタペプチドが多ければ多いほど、凝集速度は遅くなる。反応を６９４nmでモニタリング（観測）し、被処理試料と生理食塩水ブランクとの間の凝集速度の差を測定した。実験結果が以下の表１に示され、ペプシンでの処理ののち、プロリン特異的エンドペプチダーゼの付加がより高い凝集阻止を生じさせて、ヘモグロビンのβ鎖末端糖化ペンタペプチドが放出されることを示す。実施例２：プロリン特異的エンドペプチダーゼ含有凝集試薬の調合 実施例１で使用された凝集剤（ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド）及びプロリン特異的エンドペプチダーゼを含有する試薬の安定な調合のためのpH７．０の条件を決定した。 ０．０２mol/Lのモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、０．０５％のＮａＮ3及び０．２％のTween-20を含有する凝集剤（約１．５μg/mL）の溶液（pH７）を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び０．４U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼなしで、１．１mmol/L ＥＤＴＡとともに、又は１．１mmol/L ＥＤＴＡ及び０．４U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼの両方とともに調製した。そして、１４日の期間にわたりマウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックスの凝集を生じさせる、様々な調合物における凝集剤の能力を測定して、凝集剤の安定性を経時的に評価した。まず試料を上記凝集試薬（R1）に加え、次にマウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックス（ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）を試料に加えることにより、試料を、ADVIA（登録商標）1650機器上で、凝集試薬イムノアッセイ法で試験した。試料中のヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチドは、抗体結合部位を求めて凝集試薬と競合し、凝集速度を低下させ、この凝集速度の低下は、凝集試薬がラテックスコートされた抗体に結合するときに起こる。試料中のヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化ペンタペプチドが多ければ多いほど、凝集速度は遅くなる。反応を６９４nmでモニタリングし、凝集速度を測定した。図１は、凝集剤がＥＤＴＡのみの存在でもっとも安定であり、ＥＤＴＡ及びプロリン特異的エンドペプチダーゼの両方の存在でもっとも不安定であったことを示す。 ０．４U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼ、０．０２mol/Lモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、０．０５％のＮａＮ3及び０．２％のTween-20を含有する凝集剤（約１．５μg/mL）のさらなる溶液（pH７）を、１．１mmol/L ＥＤＴＡ及び１％のＢＳＡの両方とともに、又は１％のＢＳＡのみとともに調製した。そして、経時的にマウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックスの凝集を生じさせる、様々な調合物中の凝集剤の能力を再び測定した。図２は、プロリン特異的エンドペプチダーゼの存在における凝集剤が、ＢＳＡのみを含有する溶液よりもウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びＥＤＴＡの両方を含有する溶液中でより安定であったことを示す。図１及び２に提供されたデータは、ＥＤＴＡ及びＢＳＡが相乗的に作用して、プロリン特異的エンドペプチダーゼ含有凝集試薬溶液を安定化させることを示す実施例３：ペプシン消化条件の決定 様々な濃度のHbA1cを含有する凍結乾燥ヒト全血（全血HbA1cカリブレータ、Aalto Scientific）の２μL試料を、２５０U/mLペプシン（試料変性試薬、ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）１４８μLで１０分間、手動で消化させるか、０．０２mmol/Lのシトレート、０．２％のTriton X100、pH２．４溶液中の約６０００U/mLのペプシンで９秒間、自動的に消化させるか、０．０２mmol/Lシトレート、０．２％のTriton X100、pH２．４溶液中の約６０００U/mLのペプシンで１０分間、自動的に消化させるかした。そして、試料を、R1が０．４U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼを含有する凝集試薬である実施例２に記載したように、ADIVA（登録商標）1650計器上で、凝集阻止イムノアッセイ法で評価した。以下の表２で試料ごとに異なる変性条件に関してリストする凝集速度の間変化がないことは、約６０００U/mLを含有するペプシン変性剤の場合には、ヘモグロビンを消化するのに９秒で十分であることを示す。実施例４：糖化ヘモグロビンの割合を計算するときのヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣによって生じる干渉を減少させるヒト全血のペプシン及びプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化：凝集試薬の存在におけるプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化 ヘモグロビンＳ（HbS）又はヘモグロビンＣ（HbC）を含有するヒト全血試料を、実施例２で記載したように、ADIVA（登録商標）1650計器上で、凝集阻止イムノアッセイ法で試験して、試料中の糖化ヘモグロビンの濃度を測定した。エンドペプチダーゼ試薬は、０．０２mol/Lシトレート緩衝液（pH２．４）、０．２％Triton X100中、約６０００U/mLのペプシンを含有するものであった。凝集試薬は、約１．５μg/mL凝集剤（ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド）及び漸増濃度のプロリン特異的エンドペプチダーゼ（０U/mL、０．１U/mL、０．２U/mL、０．３３U/mL、０．４３U/mL及び０．５４U/mL）の混合物を、０．０２mol/LのＭＯＰＳ（pH７．０）、０．０５％ＮａＮ3、０．２％のTween-20、３mmol/LのＥＤＴＡ及び１．５％のＢＳＡの溶液中に含有するものであった。 試料中の、糖化ヘモグロビン及び非糖化ヘモグロビンを含む全ヘモグロビン濃度を、ADVIA（登録商標）全ヘモグロビン試薬（ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）を使用して、非イオン洗浄剤のアルカリ性溶液を用いる処理によって全ヘモグロビン誘導体をアルカリ性ヘマチンに転換することに基づくアッセイ法で測定した。試料を全ヘモグロビン試薬に加え、ヘモグロビン種を、５９６nmで所定の吸収スペクトルを有するアルカリ性ヘマチンに転換した。５９６nmでの吸収を測定することによってヘマチン含量を計測した。 試料ごとに計算された糖化ヒトヘモグロビンの濃度を、その試料に関して測定された全ヘモグロビンの濃度で割ることにより、各試料中に存在する糖化ヒトヘモグロビンの割合を測定した。 また、比較のために、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料中の糖化ヘモグロビンの割合を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法（DCA（登録商標）2000アナライザ及び試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）を使用して測定した。DCA（登録商標）2000アッセイ法は、ヘモグロビンＣ及びヘモグロビンＳ変異体の存在からの干渉を受けないことが知られている。また、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合を、ADVIA（登録商標）1650HbA1c法（Siemens Medical Solutions Diagnostics）を使用して実施される標準的HbA1cアッセイ法を使用して測定した。以下の表３に示すパラメータをADVIA（登録商標）1650計器で使用して、ヘモグロビン変異体干渉に対するプロリン特異的エンドペプチダーゼの効果を評価した。R1は、０．０２mol/L ＭＯＰＳ（pH７．０）、０．０５％ＮａＮ3、０．２％Tween-20、３．０mmol/L ＥＤＴＡ及び１．５％ＢＳＡの溶液中、凝集剤（ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド）及び０．０〜０．５４U/mLプロリン特異的エンドペプチダーゼの混合物であった。R2は、マウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックス（ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）であった。 実験結果を以下の表４に示す。表中、「ＮＶ」は、そのデータ点で値が得られなかったことを示し、「>>>>」は、値が高すぎて計器で計測できなかったことを示す。表の１列目の数値の後の「Ｃ」は、試料がヘモグロビンＣを含有することを示し、１列目の数値の後の「Ｓ」は、試料がヘモグロビンＳを含有することを示す。ADVIA（登録商標）1650HbA1c法を使用して実施されたHbA1cアッセイ法で得られた結果は、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法で得られた結果と比較して、試料中のヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣの存在によって大きく影響されている。異なるプロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度を使用して実施された実験の結果と、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法及びADVIA（登録商標）1650計器を使用して実施された実験の結果との比較は、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣによって生じる糖化ヘモグロビンの計測における干渉が０．５４U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度で排除されることを示す。 異なるプロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度を使用してADVIA（登録商標）1650計器を用いて実施された実験から計算された試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合（表４、３〜８列目）及びADVIA（登録商標）1650HbA1c法を使用して実施された実験から計算された試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合（表４、９列目）を、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ法を使用して計算された糖化ヘモグロビンの割合（表４、２列目）に対してプロットして、プロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度ごとに計算された糖化ヘモグロビン割合及びADVIA（登録商標）1650HbA1c法を使用して計算された割合に関する相関傾きを得た。結果が図３〜９に示され、プロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度が高まるにつれ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣによって生じる、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合の計算における干渉が減少し、最後には排除されるということを示す。 前段落で記載したように測定され、図３〜９に示された相関傾きの値をプロリン特異的エンドペプチダーゼ濃度に対してプロットすると（図１０）、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料のペプシンによる消化、次いで凝集試薬の存在における少なくとも０．４３U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼによる消化が、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合を計算するときの、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣによって生じる干渉を排除するということが示された。実施例５ヒト全血のペプシン及びプロリン特異的エンドペプチダーゼ消化は、糖化ヘモグロビンの割合を計算するときの、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣによって生じる干渉を減少させる。凝集試薬の存在におけるペプシン消化 ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含有するヒト全血試料を、ADVIA（登録商標）1650計器上、表５に示すパラメータを使用して、生理食塩水で希釈した。 次いで、生理食塩水希釈した試料を、０．０２mol/Lのシトレート緩衝剤（pH２．４）中に約１．５μg凝集剤（ポリアスパルトアミドにコンジュゲートしたヒトヘモグロビンのβ鎖アミノ末端糖化セキサペプチド）及び６U/mLのペプシンを含有する凝集試薬と混合し、混合物を５分間インキュベートした。次いで、漸増濃度のプロリン特異的エンドペプチダーゼ（０．０、１．０、２．０、３．０、４．０又は５．０U/mLを含有する、マウスモノクロナール抗HbA1c抗体でコートされたラテックス（ADVIA（登録商標）HbA1c試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics））の溶液（pH７）を凝集試薬／ペプシン溶液に加え、混合物を５分間インキュベートした。ADVIA（登録商標）1650計器を使用して６９４nmでの凝集速度を測定し、その凝集速度を使用して、試料中の糖化ヘモグロビンＳ又はヘモグロビンＣの濃度を計算した。 また、比較のために、DCA（登録商標）2000HbA1cアッセイ（DCA（登録商標）2000アナライザ及び試薬キット、Siemens Medical Solutions Diagnostics）を使用して、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合を測定した。 実施例４に記載した手順にしたがって試料中の全ヘモグロビン濃度を測定し、実施例４に記載したようにして各試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合を測定した。実験の結果が以下の表６に示され、凝集試薬の存在におけるペプシンによるヒト全血試料の消化、次いでプロリン特異的エンドペプチダーゼによる消化が、試料中に存在する糖化ヘモグロビンの割合を計算するときの、試料中に存在するヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣによって生じる干渉を有意に減少させることを示す。 本明細書で引用又は記載される各特許、特許出願及び刊行物の全開示が参照によって本明細書に組み込まれる。 糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、 糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料をエンドペプチダーゼと接触させること、 前記エンドペプチダーゼ処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及び ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを検出することを含む方法。 前記試料がヒト全血である、請求項１記載の方法。 前記試料中の糖化ヒトヘモグロビンの割合を測定することを含む、請求項１記載の方法。 前記エンドペプチダーゼが、ペプシン、アスペルギロペプシンII、カテプシンＤ、サッカロペプシン、ムコールペプシン、キモシン、ガストリシン及びphysirolisinからなる群より選択される酸エンドペプチダーゼである、請求項１記載の方法。 前記酸エンドペプチダーゼがペプシンである、請求項４記載の方法。 前記試料を、約１．０〜約５．０の範囲のpHで約５U/mL〜約１０，０００U/mLペプシンと接触させることを含む、請求項５記載の方法。 前記エンドペプチダーゼ処理された試料を、約５．０〜約９．０の範囲のpHで約０．１U/mL〜約３０U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることを含む、請求項１記載の方法。 前記ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを、高速液クロマトグラフィーの使用を含む方法又は前記糖化ペンタペプチドへの少なくとも一つの抗体の結合を含む方法によって検出することを含む、請求項１記載の方法。 前記ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法によって検出することを含む、請求項１記載の方法。 前記凝集阻止イムノアッセイ法で使用される前記凝集試薬が、ポリアスパルトアミドにコンジュゲートした糖化val-his-leu-thr-tyr-cysセキサペプチドである、請求項９記載の方法。 前記エンドペプチダーゼ処理された試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることを含む、請求項９記載の方法。 前記エンドペプチダーゼ処理された試料を、プロリン特異的エンドペプチダーゼと前記凝集試薬との混合物と接触させることを含む、請求項１１記載の方法。 プロリン特異的エンドペプチダーゼと前記凝集試薬との前記混合物が、約０．１g/dL〜約５．０g/dLウシ血清アルブミン及び約０．５mmol/L〜約１０．０mmol/Lエチレンジアミン四酢酸を含み、約６．０〜約８．０の範囲のpHを有する、請求項１２記載の方法。 前記エンドペプチダーゼ、プロリン特異的エンドペプチダーゼ及び凝集剤で処理された試料を、ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド及び前記凝集試薬の両方に特異的に結合する抗体と接触させることをさらに含む、請求項１１記載の方法。 少なくとも一つの抗体分子が一つ以上のラテックス粒子に結合している、請求項１４記載の方法。 糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法であって、 糖化ヒトヘモグロビンに関して試験される試料を、凝集試薬と接触させると同時に、接触させる前に又は接触させた後に、エンドペプチダーゼと接触させること、 前記エンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料をプロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させること、及び ヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチドを凝集阻止イムノアッセイ法によって検出することを含む方法。 前記エンドペプチダーゼが、ペプシン、アスペルギロペプシンII、カテプシンＤ、サッカロペプシン、ムコールペプシン、キモシン、ガストリシン又はphysirolisinからなる群より選択される酸エンドペプチダーゼである、請求項１６記載の方法。 前記酸エンドペプチダーゼがペプシンである、請求項１７記載の方法。 前記試料をペプシンと前記凝集試薬との混合物と接触させることを含む、請求項１８記載の方法。 ペプシンと前記凝集試薬との前記混合物が、約３U/mL〜約１００U/mLのペプシンを含み、約１．０〜約４．０の範囲のpHを有する、請求項１９記載の方法。 前記のエンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料を、前記試料をヒトヘモグロビンの糖化β鎖アミノ末端ペンタペプチド及び前記凝集試薬の両方に特異的に結合する抗体と接触させると同時に又は接触させる前に、プロリン特異的エンドペプチダーゼと接触させることをさらに含む、請求項１６記載の方法。 前記のエンドペプチダーゼ及び凝集試薬処理された試料を、プロリン特異的エンドペプチダーゼと前記抗体との混合物と接触させることを含む、請求項２１記載の方法。 前記混合物が、約２．０U/mL〜約３０．０U/mLのプロリン特異的エンドペプチダーゼを含み、約７．０〜約８．０の範囲のpHを有する、請求項２２記載の方法。 少なくとも一つの抗体分子が一つ以上のラテックス粒子に結合している、請求項２１記載の方法。 本発明の特定の態様は、ヘモグロビンβ鎖中に存在することができるアミノ酸配列の変異の存在によって影響されない、たとえばヒト全血中の糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法に関する。方法は、試料中のすべての糖化ヘモグロビンを、糖化されたヘモグロビンの形態にかかわりなく検出し、したがって、糖化されたヒトヘモグロビンＡ、ヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＳを検出する。

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