生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_タンパク質の分別方法、タンパク質の溶解方法、非動物性繊維の分別採取方法及び動物性繊維由来のタンパク質 |
| 出願番号： | 2010505683 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C07K 14/435,C07K 1/14 |
特許情報キャッシュ
棚橋 光彦 村手 宏隆 JP 5604294 特許公報(B2) 20140829 2010505683 20090324 タンパク質の分別方法、タンパク質の溶解方法、非動物性繊維の分別採取方法及び動物性繊維由来のタンパク質 倉敷紡績株式会社 000001096 青山 陽 100118706 棚橋 光彦 村手 宏隆 JP 2008080936 20080326 20141008 C07K 14/435 20060101AFI20140918BHJP C07K 1/14 20060101ALI20140918BHJP JPC07K14/435C07K1/14 Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００ ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＰｕｂＭｅｄ 特開２００２−１１４７９８（ＪＰ，Ａ） 特開２０００−２３４２６８（ＪＰ，Ａ） Biomaterials，２００４年，Vol.25，p.4255-4262 Biomaterials，２００４年，Vol.25，p.2265-2272 Journal of Thermal Analysis and Calorimetry，２００７年，Vol.89, No.2，p.601-608 7 JP2009055842 20090324 WO2009119596 20091001 9 20120323 鈴木 崇之 本発明は、羊毛等の獣毛、羽毛、毛髪、絹等の動物性繊維からケラチンやフィブロインタンパク質を採取する方法、タンパク質の溶解方法、及び非動物性繊維の分別採取方法に関する。 毛髪、羊毛等の獣毛や羽毛にはケラチンタンパク質が、絹にはフィブロインとセリシンのタンパク質が含まれている。このため、従来より動物性繊維（本明細書において動物性繊維とは獣毛、毛髪の他、鳥類の羽毛も含むものとする）からケラチンやフィブロイン等を溶液化して取り出し、医薬品やタンパク質試薬等に利用しようとする試みがなされている。 例えば特許文献１では、過酸化水素にアンモニアを添加した水溶液中に、獣毛を常圧下で室温〜５０℃で１０〜３０分浸漬処理し、さらに密閉状態で１３０〜２００℃で３０〜６０分加圧熱処理を行ない、動物性繊維を水可溶化してケラチンを取り出す方法が記載されている。 また、特許文献２では、尿素とチオ尿素との混合溶媒に還元剤を加えた溶液で動物性繊維を処理してケラチンタンパク質を溶出させ、さらに残渣からキューティクル部位を採取する技術が開示されている。 また、特許文献3では、低級脂肪族アルコールと水との混合溶媒に、臭化リチウム等のアルカリ金属塩とアミノ酢酸やＥＤＴＡ等の錯形成剤とを添加した液で絹を溶解する技術が開示されている。この方法によれば、高濃度の絹フィブロイン溶液を短時間で調製することができる。 さらに、特許文献4では、羽毛を加圧下でガラス転移点まで加熱して軟化させ、アルカリを添加しプロテアーゼで部分的に加水分解した後、親水性の置換基で化学修飾したり、尿素やアルコールの水溶液に溶解させたりして、羽毛ケラチン溶液を得る方法が開示されている。この方法で得られるケラチン溶液は、β型ケラチンの分子構造が保持されているという特徴を有している。特開２０００−２３４２６８号公報特開２００２−１１４７９８号公報特開平７−１７３１９２号公報特開２００５−１２０２８６号公報 しかし、上記従来の動物性繊維からタンパク質を採取する方法では、酸化剤、還元剤や界面活性剤等の多くの薬品を用いたり、プロテアーゼ等の酵素を用いたりするため、それら薬剤の除去に長い時間が必要であり、かつ、長時間かけても除去が困難な成分もあるという問題がある。また、タンパク質の採取も複雑な操作が必要で、ひいては製造コストも高いものとなっていた。 本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、動物性繊維からのタンパク質の分別方法において、酸化剤や還元剤や界面活性剤や酵素を使用することなく、操作が簡単で製造コストも低廉な方法を提供することを課題とする。 本発明者らは、従来から動物性繊維の溶解に用いられている尿素に注目した。しかし、従来の尿素を用いたタンパク質の抽出では、尿素水溶液に酸化剤、還元剤や界面活性剤などの薬剤を用いるため、これらの薬剤の除去が困難であるという問題がある。一方、これらの薬剤を用いず、５〜８Ｍの濃厚な尿素水溶液だけで動物性繊維を処理しても、タンパク質の採取は収率が悪かった。そこで、尿素を水溶液ではなく、溶融状態にして動物性繊維を処理したところ、動物性繊維タンパク質を完全に溶解することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明のタンパク質の分別方法は、溶融状態の尿素によって動物性繊維を溶解して動物性繊維溶液とする溶解工程と、該動物性繊維溶液からタンパク質を分離する分離工程とを含むことを特徴とする。 本発明のタンパク質の分別方法では、溶解工程において、尿素水溶液ではなく、溶融した尿素を動物性繊維の溶媒として用いる。発明者らの試験結果によれば、溶融した尿素は動物性繊維を溶解する能力が、尿素水溶液より遥かに高い。このため、特に酸化剤や還元剤や界面活性剤など薬剤を用いなくても、動物性繊維を短時間で充分に溶解することができる。このため、タンパク質採取に要する薬剤の費用を低廉とすることができ、それらの除去も不要となる。さらには、得られるタンパク質の２次構造に関するダメージが少ない。例えば発明者らは、羊毛を溶解する場合、その採取されるタンパク質であるケラチンの分子量は７５０００Ｄａと高く、２次構造が再生されていることを確認している。また、動物性繊維を単に溶融した尿素によって溶解させるだけでタンパク質が抽出できるため、溶解工程の操作が簡単となる。本発明において、尿素を溶融する方法としては特に限定はなく、熱による溶融の他、電磁波による溶融等も含まれる。また、動物性繊維に対する尿素の量は重量比で3〜２０倍が好ましく、７〜１2倍が特に好ましい。尿素の割合が動物性繊維に対して3倍未満では動物性繊維が尿素溶融液に浸しきれず、部分的にしか溶解せず時間がかかる。また、尿素の割合が動物性繊維に対して２０倍以上でも溶解できるが、再沈殿等による回収が困難となり、コストもかかる。 溶解工程における溶融状態の尿素への動物性繊維の溶解機構については、次のように考えられる。すなわち、動物性繊維は、例えば羊毛は水分15％（公定水分率）を除いた絶乾状態で、82%がケラチン（ハードケラチン45.5％、ソフトケラチン36.5％）、16％がケラチン以外のタンパク質、2％が脂質からなる。それらタンパク質は、主にジスルフィド結合と水素結合とで分子間結合をしている。尿素は、その水素結合を切断しタンパク質を変性させると説明される。すなわち、溶融状態の尿素が、溶媒として水素結合を切断するとともに、タンパク質中のフリーのアミノ基やカルボキシル基などと反応して尿素が化学結合し、溶融尿素への溶解性を向上していると考えられる。さらには、尿素の分解で発生したアンモニアがタンパク質の結晶領域に侵入し、タンパク質分子間を広げ、その中へ尿素分子が浸入することを容易にし、タンパク質の溶解を促進することができると推定される。また、動物性繊維が絹の場合には、ケラチンと比較して絹の繊維はフィラメント状であり、フィブロインタンパク質はβ構造で平面的に分子間水素結合を形成しており、結晶性が高く、特に表層は長く結晶が連なったスキン層を形成している。このため、絹を溶解するには、180℃という高い温度と50分という長時間が必要であった。 こうして、溶解工程において得られた動物性繊維溶液を、次の分離工程でタンパク質と尿素とに分離する。その方法は、特に限定はされないが、動物性繊維溶液に尿素の凝固を防止するために少量の水を加えて、有機溶媒(例えばメタノールやエタノール等のアルコール)中に分散させ、尿素はその溶媒に溶解し、それに溶解しないタンパク質を沈殿させ、ろ別やデカンテーションにより採取することができる。 また、溶解工程において得られた動物性繊維溶液から水による透析によって尿素を除去し、高分子であるタンパク質を残すという方法で分離工程を行うこともできる。透析法を用いた分離工程では、尿素しか含まれていないため他の化学薬品を加えた方法に比べて透析時間も短縮できる。その過程で水に溶けにくい一部の非水溶性タンパク質が沈殿し、水溶性タンパク質が水に溶解した状態で残る。このため、非水溶性タンパク質と水溶性タンパク質とをろ別によって分取することができる。また、残った水溶性タンパク質は、そのろ液を凍結乾燥、自然乾燥、加熱乾燥やスプレードライなどの乾燥法を用いて、微粉末状や固体として採取することができる。動物性繊維が毛髪や羊毛等の獣毛や羽毛の場合には、ケラチンタンパク質が主成分として含まれているため、非水溶性タンパク質にはシステイン由来のイオウ分が多いハードケラチンが主成分であると考えられ、水溶性タンパク質には硫黄分が少ないソフトケラチンがその主成分であると考えられる。また、絹繊維である絹糸、絹紡糸等は、フィブロインとセリシンタンパク質とからなり、衣服として用いる場合、希アルカリの精錬工程によってセリシンを除き、光沢があるフィブロインにして用いている。そのセリシンが存在する蚕の繭を用いた場合でも、溶融尿素によって完全に溶解が可能であり、水を加えることによって、水溶性のセリシンと非水溶性のフィフロインに分別が可能となる。セリシンを除去した絹糸または絹織物を使用した場合でも、溶融尿素に溶解することが可能であり、シルクタンパク質の微粉末化が可能となる。 溶解工程における温度としては、動物性繊維の種類に応じて適宜選択すればよいが、尿素を溶融状態となる温度以上とすることが必要である。例えば、毛髪、羊毛や鶏の羽毛では１５０℃程度が好ましく、絹では１８０℃程度が好ましい。ただし、温度が高すぎると、タンパク質の熱変性の原因となったり、尿素の分解が速くなりすぎるため、２００℃以下が好ましく、特に好ましい温度範囲は１４０℃以上１８０℃以下である。 本発明において対象となる動物性繊維としては特に限定はなく、毛髪、羊毛等の獣毛、羽毛、絹等を原料とすることができる。 また、動物性繊維が溶融状態の尿素に溶解することを利用して、動物性繊維と非動物性繊維とからなる繊維素材から非動物性繊維のみを分別採取することができる。すなわち、本発明の非動物性繊維の分別採取方法は、動物性繊維と非動物性繊維とからなる繊維素材を溶融状態の尿素で処理することによって動物性繊維を溶解させ、非動物性繊維のみを分別採取することを特徴とする。 この方法によって、例えば羊毛−ポリエステルの混紡製品を処理すれば、羊毛のみが溶解除去され、ポリエステルのみが残る。このため、混紡製品からポリエステルのみを採取することができ、リサイクル原料等に利用することができる。また、こうして溶出させた羊毛ケラチンを、薬品・化粧品分野、羊毛製品再利用等の分野に利用することができる。また、動物性繊維を含む繊維のブレンド形態はどのようなものであってもよく、混紡、交撚、交織等、繊維の混合状態に依存しない。また、混紡製品は動物性繊維と合成繊維の組み合わせのみならず、動物性繊維と植物性繊維等との分離にも同様に利用することができる。実施例１で得られた水溶性タンパク質及び非水溶性タンパク質及び原料の羊毛の固体13Ｃ-ＮＭＲスペクトルである。 以下、本発明を具体化した実施例を詳細に述べる。−各種動物性繊維から透析法によるケラチンの採取−（実施例１） 実施例１では、原料として羊毛繊維を用いた。＜溶解工程＞ 尿素1０ｇをビーカーに計り採り、油浴上で１５０℃に加熱して溶融する。そして、その中に市販の羊毛繊維（日本毛織株式会社製）1ｇ（公定水分15％含む）を入れ、２０分間の加熱を行い、全てを溶解させて動物性繊維溶液を得た。＜分離工程＞ 溶解工程で得られた動物性繊維溶液に水を５ｍｌ加えて、セルロース製透析チューブ(孔径２．４ｎｍ・分子量１２０００以下カット品)に充填し、水による透析を行なった。約２日間の透析を行なった後、内容物をろ過して沈殿物とろ液とに分けた。そして、沈殿物を水洗し、加熱乾燥をさせることで非水溶性ケラチン（０．１０ｇ）を得た。また、ろ液を凍結乾燥してスポンジ状の水溶性ケラチン（０．５３ｇ）を得た。なお、ろ液を乾燥する時に凍結乾燥のみならず、自然乾燥した場合と加熱乾燥した場合も実施したが、これらは透明薄褐色の膜状物となった。（実施例２） 実施例２では、原料として毛髪（日本人１０歳男子）を用いた。その他の条件は実施例１と同様であり、説明を省略する。（実施例３） 実施例３では、原料としてブロイラーの羽毛を用い、溶解工程の加熱時間を１０分間とした。その他の条件は実施例１と同様であり、説明を省略する。（実施例４） 実施例４では、絹糸（シナノケンシ株式会社製）を希アルカリによって精錬してセリシンを除去したものについて、溶解工程の加熱温度を１８０℃とし、加熱時間を５０分間とした。その他の条件は実施例１と同様であり、説明を省略する。（実施例５） 実施例５では、絹糸（シナノケンシ株式会社製）を精錬処理することなくそのまま試験に供した。その他の条件は実施例４と同様であり、説明を省略する。−評 価−（１）溶解割合 上記のようにして得られた非水溶性タンパク質及び水溶性タンパク質の溶解割合を表１に示す。この表から分かるように、実施例１〜５の動物性繊維をいずれも溶解させることができた。 このように、尿素単独で動物性繊維を溶解することができたのは、尿素がタンパク質分子間の水素結合を切断するためであると考えられる。なお、絹については加熱温度１８０℃と他の実施例よりも高温とし、加熱時間を５０分間と長くしたのは、絹フィブロインは２次構造がβ構造で平面的に分子間水素結合を形成し、強固な構造を形成ししているため、他の動物性繊維よりも温度と時間を必要としたと予想される。（２）固体13Ｃ-ＮＭＲ測定 実施例１で得られた水溶性ケラチン及び非水溶性ケラチンについて、固体13Ｃ-ＮＭＲ測定を行なった。また、比較として原料の羊毛についても測定を行なった。結果を図１に示す。原料の羊毛では１７４ｐｐｍ及び１７６ｐｐｍに２種類のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）の炭素のピークが現れた。そのうち１７４ｐｐｍのピークはケラチンタンパク質の２次構造がβ-シート構造に基づくものであり、１７６ｐｐｍのピークはケラチンタンパク質のα-へリックスに基づくものである。これに対し、水溶性ケラチンでは１７４ｐｐｍのピークと１７６ｐｐｍのピークとがほぼ同等になっていることから、水溶性ケラチンはα-へリックス構造（ソフトケラチンと考えられる）とβ-シートのケラチンタンパク質（ハードケラチンと考えられる）との等量混合物と考えられる。一方、非水溶性ケラチンでは１７４ｐｐｍのピークが顕著に現れており、１７６ｐｐｍのピークは不明確となっている。このことから、非水溶性ケラチンは主にβ-シートのケラチン（ハードケラチンと考えられる）からなっていると考えられる。それら以外のピークについては、２５ｐｐｍのピークがＣＨ2,3−Ｃ、５５ｐｐｍのピークがＣＨ2,3−Ｎ又はＣＨ2,3−Ｓ又はＣＨ2,3−Ｏ、１３０ｐｐｍのピークがＣ＝Ｃにそれぞれ帰属する。 以上の固体13Ｃ-ＮＭＲ測定結果から、実施例１では、変性し溶解したケラチンが、その可逆性により再生され、分子内水素結合等の結合は維持されていることが示された。−各種動物性繊維からアルコール投入法によるタンパク質の採取−（実施例６）＜溶解工程＞ 尿素1０ｇをビーカーに計り採り、油浴上で１５０℃に加熱して溶融する。そして、その中に市販の羊毛繊維（日本毛織株式会社製）１ｇを入れ、２０分間の加熱を行い、全てを溶解させて動物性繊維溶液を得た。＜分離工程＞ 溶解工程で得られた動物性繊維溶液に水を10ｍｌ加えて尿素の固化を防止した後、５０ｍｌのメタノール中に投入してタンパク質を析出させた。その後、ろ別し、沈殿物はメタノール及び水で洗った後、加熱乾燥させ、ろ液は真空乾燥させてタンパク質粉末を得た。−羊毛−ポリエステル混紡織物から羊毛の分別採取−（実施例７） 実施例７では、羊毛−ポリエステル混紡織物について、尿素による溶解試験を行なった。すなわち、尿素２０ｇをビーカーに計り採り、油浴上で１５０℃に加熱して溶融する。そして、その中に、羊毛５０％−ポリエステル５０％混紡織物２ｇを入れ、２０分間の加熱を行い、羊毛を溶解させた。 ろ別により織物残渣とろ液とに分け、ろ液をメタノール中に投入し、タンパク質を沈殿させた。その後、ろ別し、アルコールで洗った後、真空乾燥させてタンパク質粉末を得た。また、ろ別によって分離した織物残渣を水洗し、乾燥させた後、実体顕微鏡で観察したところ、羊毛繊維は消滅し、ポリエステル繊維のみが残っていた。 上述のように、羊毛−ポリエステル混紡（50％・50％）織物を溶融した尿素に浸漬するだけで、ポリエステル混紡繊維からポリエステルのみを採取することができる。また、抽出されたタンパク質も分別回収することができる。したがって、この方法を用いれば、繊維製品廃棄物からタンパク質と非動物繊維とを分離回収することが可能となり、繊維製品のリサイクル利用が可能となる。（実施例８） 綿−絹（80％、20％）との交撚繊維を用いた織物について、尿素による溶解試験を行なった。その他の条件は実施例７と同様である。その結果、実施例７と同様、動物性繊維のみ溶解し、植物性繊維である綿を分離回収することができた。 この発明は、上記発明の実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。 本発明のタンパク質の分別方法によれば、動物性繊維から、溶融させた尿素でタンパク質を採取することができ、純粋なタンパク質が得られる。このため、人工皮膚などのメディカル分野、医薬品・化粧品分野、動物性繊維製品再利用等の分野に適用できる。 酸化剤や還元剤で処理されていない動物性繊維を溶融した尿素によって溶解して動物性繊維溶液とする溶解工程と、 該動物性繊維溶液からタンパク質を分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の分別方法。 前記溶解工程は尿素が溶融状態となる温度以上であって２００℃以下の温度で行なうことを特徴とする請求項１記載のタンパク質の分別方法。 前記分離工程は動物性繊維溶液に水を加えて動物性繊維水溶液とした後、有機溶媒を加えてタンパク質を沈殿させて採取することを特徴とする請求項１又は２記載のタンパク質の分別方法。 前記分離工程は動物性繊維溶液に水を加えてタンパク質を沈殿して採取することを特徴とする請求項１又は２記載のタンパク質の分別方法。 前記分離工程は動物性繊維溶液を水で透析して尿素を除去することにより非水溶性タンパク質と水溶性タンパク質とに分別して採取することを特徴とする請求項１又は２記載のタンパク質の分別方法。 酸化剤や還元剤で処理されていない動物性繊維を溶融状態の尿素によって溶解することを特徴とするタンパク質の溶解方法。 酸化剤や還元剤で処理されていない動物性繊維と、非動物性繊維と、からなる繊維素材を、溶融状態の尿素で処理することによって動物性繊維を溶解させ、非動物性繊維のみを分別採取することを特徴とする非動物性繊維の分別方法。