生命科学関連特許情報
| タイトル： | 公開特許公報(A)_微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具 |
| 出願番号： | 2010236869 |
| 年次： | 2012 |
| IPC分類： | G01N 33/48,A61B 5/15 |
特許情報キャッシュ
松田 武英 大竹 皓子 鴻上 繁 澤田 鎮雄 JP 2012078334 公開特許公報(A) 20120419 2010236869 20101005 微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具 株式会社明日香特殊検査研究所 308001776 株式会社生研 505439831 日本マイクロ株式会社 507404064 松田 武英 大竹 皓子 鴻上 繁 澤田 鎮雄 G01N 33/48 20060101AFI20120323BHJP A61B 5/15 20060101ALI20120323BHJP JPG01N33/48 HA61B5/14 300J 5 1 書面 9 2G045 4C038 2G045BA08 2G045BB10 2G045CA25 2G045CA26 2G045HB02 4C038TA05 4C038UH01 4C038UH03 4C038UH07 血液を採取し、血漿または血清に分離し、それらに含まれている微量成分を測定するための検体採取および血漿または血清の分離方法およびその器具に関する技術分野。 病院や診療所における血液検査用検体採取は、一般的に真空採血管が使われている。近年ベットサイド検査が普及するにつれて患者に苦痛や負担をかけない微量採血が求められている。この超微量採血には特許文献１に示すようなランセットが使われている。このランセットを指や耳朶に刺し出てきた血液を採取する方法は特許文献２などの毛細管が使われている。 一般的に血液検査用の検体は血漿または血清が使われるため採血後遠心分離して血球成分除去しなければならない。普通ランセットによる採血は、遠心分離の不要な電極法による血糖の分析などに使われることが多い。また最近は郵便検診と称し一般人を対象としてランセットの採血を薦めているが、大型のランセットを使うため傷が大きくその取り扱いに問題は多い。このような郵便検診は医療行為ではないとされている。 特許公表２００８−５２１５５１ 特許公表２００２−５２８２４９ 特願２０１０−１７８０５２ 特開２００３−２７０２３９ 特開平６−１２６１９８ 病院や診療所では化学検査の大半は血漿または血清で検査することになっており、最近普及し始めたベットサイド検査と言われるＰＯＣＴも現在は真空採血管による採血と遠心分離で血漿または血清に分離した検体を使用している。検査機器がＰＯＣＴ化されベットサイド検査が出来るようになったが、検体採取と遠心分離作業は旧態依然としたシステムが続いており本来のＰＯＣＴ化が遅れている。これらの解決のため我々はランセット採血で、針を指や踵、耳朶などに刺し微量の血液を吐出させ、その血液を効率よく採取したのち血漿または血清を分離する方法と器具を提供する。 特許文献１にはランセット器具が開示されているが、これは主に血糖検査に広く使用され、糖尿病患者がインシュリン注射のタイミングを図るため自分で採血し検査を行っている。前述したように血糖検査機器は電極法が普及したため血清分離する必要はなかった。この血糖検査にかかわる血液採取量はおおよそ１回２０μＬ程度といわれている。 全血２０μＬの血液から得られる血漿または血清は多くても１０μＬである。この約２０μＬの血液から血漿や血清を得る手段は色々試みられてきたが殆ど成功していない。唯一特許文献４ではランセットで採取した全血を一旦希釈して血球濾過膜で血漿を取り出すことを行っている。血液を血球と血清に分離する前に希釈することは、血液検査としてはマイナーで信頼性が乏しい。マイナーな理由は、血漿と血球成分の比いわゆるヘマトクリット値が個人により異なるため先ず血漿または血清に分離してから希釈すべきである。この分野では、正確な測定値を得るためには全血を予め遠心分離し血漿または血清にしてから検査出来ることが強く求められている。 本願ではランセットにより吐出した微量全血の簡便な採取法、採取した全血の遠心分離方法、分離した血漿または血清の一定量を分取する方法とその器具を提供する。 先ずランセットで吐出させた血液の採取法として、ガラスまたは合成樹脂製の毛細管群またはガラスまたは合成樹脂繊維をストロー状のパイプに長さ方向が一定になるようおよび長さが一定になるよう詰め込みそこに毛細管機能を持たせてなる血液吸収器具を用いる。この血液吸収器具の毛細管側を血液に触れさせるだけで毛細管現象により血液を吸入する。複数の毛細管を用いるのは、少なくとも血液を短時間に３０から６０μＬ程度吸引するためである。血液吸収器具の毛細管の内面または毛細管機能を有する繊維に予め血液抗凝固剤または血液凝固促進剤を個別に塗布させておけば、血漿または血清を選択的に採取できる。 全血の採取が終われば、内径の先端が尖ったマイクロチューブ型遠心管に、毛細管側が底になるよう血液吸収器具を挿入する。マイクロチューブ型遠心管は内径が底に行くにつれ細くなっており、血液吸収器具の先端の外形がぶつかるのでマイクロチューブ型遠心管の先端との間に若干の空隙が出来る。この空隙に採取した血液が溜まる。ただ毛細管や毛細管機能を有するガラス繊維やプラスチック繊維等に吸収されている全血を普通の遠心分離機器にそのまま掛けると、遠心により落下する重力やガラス繊維やプラスチック繊維との摩擦等で血球が溶血する。溶血を防止するための最初例えば１００回転／分の低速回転のプレ遠心操作を行い全血液を血液吸収器具からマイクロチューブ型遠心管にリリースする。血液をリリースした後は通常の血漿分離等の遠心操作を行い血球成分と血漿または血清部分に分離する。プレ遠心操作の時間や回転数は血液吸収器具の毛細管群や繊維の材質によりそれぞれきめられる。なお凝固促進剤を塗布した繊維を使った血液吸収器具で結果的に血清を得るためには、通常の血清分離の遠心操作の前に血液吸収器具を取り出しておくことが望ましい。 分離した血漿または血清は血球成分の上に黄色い透明な液として得られる。得られた微量の血漿または血清を取り出すには、血液吸収器具が邪魔になるので予め取り外す必要がある。一旦血漿または血清に分離したマイクロチューブ型遠心管を揺すると血球成分が血漿または血清に混じることがある。マイクロチューブ型遠心管の先端は血球成分がトラップできる特別の口の細い空間を予め用意しておけば血球成分が血漿または血清に混じることを少なくすることが出来る。 マイクロチューブ型遠心管で遠心分離された血漿または血清を正確に分取するには普通特許文献５に示す定量用マイクロピペットを使用する事が多い。ただこのマイクロピペットは高価であり専門の検査技師が取り扱うことを前提に作られており、看護師や事務員や患者自らこのマイクロピペットを使用して正確に分取するための器具ではない。本願では特許文献３で例えば１から２０μＬ程度の血清または血漿を、検査の素人でも簡単に正確に分取できる方法を使うことにより、発明が解決しようとするＰＯＣＴの課題、１簡単、２正確、３微量、４血漿（血清）、５短時間など全てが解決する。 ＰＯＣＴとは、ベットサイド検査と解釈されているが、要するに患者を目の前にして、今患者がどういう状態かを検査を通して判断することにある。血液検査の場合は、目の前の患者の検査結果そのものが診察中に医師の手元にあるというのが本来の医療の姿であり、その検査結果により診断や治療が成されるべきものである。残念ながら現在殆どの血液検査は緊急検査を除いて１週間前または１月前の検査結果により診断と治療が行われている。言い換えれば、現在血液検査が自動化されたといっても、緊急検査以外の測定結果は当日の診断や治療には間に合わない。臨床検査の全てが当日の診察前に明らかになっていなければならない理由はないが、少なくとも今日の診察にどうしても必要な検査項目少なからず存在する。ＰＯＣＴの目的に合致する検査装置は最近増えてきたが、肝心の採血から検査機器を使用するまでのシステムは、まだ未完成のままであった。本願の実用化により採血を注射器や真空採血管でなく自己採血器具として知られるランセットを用い超微量血液から血漿または血清を分離する方法と器具が提供できるようになる。このシステムの導入により血液検査が、病院内検査に留まらず診療所、検診車内、低開発国等でも実施できかつスピーデイにＰＯＣＴ理念により近づき、医療が一段と進化する。結果的に採血や採血及び検査に掛かる人件費やさらに大型の検査機器の維持管理費が低減されかつ無駄な検査をなくし、患者負担を軽減する意味においてもその効果は大きい。 血漿または血清を分離する器具 ランセットによる全血採取法は、自己血糖検査等に良く使われているが、せいぜい３０〜６０μＬの全血が採れるのが一般的である。近年ナイフ型のランセットで２００〜３００μＬもの血液を採取する方法が宣伝されているが、このランセットによる採血は傷が深く血液をぽたぽたと滴下させ、漏斗をつけた容器に集め、遠心分離器で血漿（血清）を得ようという試みもある。ナイフ型のランセットでの採血は注射器や真空採血管採血より傷が深い上、ワーファリン等を服用している患者等も多く、血が止まり難いなどの問題も指摘され、ＰＯＣＴ用の採血器具としては、少々乱暴と言われている。 一般的に小型のランセットで採れる全血量は、約３０から８０μＬであることから、我々はこのランセットから簡単に微量の血漿または血清を採取する方法を実用化した。図１参照。まずランセットで皮膚を刺した後、吐出した微量の血液を採取する方法として、誰でも簡単に血液を採ることが重要である。本願は、ストロー状の合成樹脂製のパイプにガラスまたは合成樹脂製の毛細管またはガラスまたは合成樹脂繊維を一定方向に寄せ集めストロー状に束ね毛細管機能を持たせた血液吸収器具に触れるだけで毛細管現象で血液を吸入する。この方法は吐出した血液に血液吸収器具を触れるだけで誰でも簡単に血液に触ることなく採取することができる。血液吸収器具（１）はガラスまたはプラスチックの毛細管（２）をストロー状のパイプに一定量詰めたもの、または最初から合成樹脂成型品として作っておくことができる。血液吸収器具（１）に吸収できる血液量は、ガラスまたはプラスチック毛細管の直径および長さにより決めることができる。血液を素早く吸引するためには長い毛細管は１本で吸引するのではなく、何本も寄合わせた毛細管群を構成する。その毛細管の長さは、吸入の操作性簡便性迅速性からせいぜい２０ｍｍ以内が望ましい。血液吸収器具の毛細管の内面または繊維に予め抗凝固剤または凝固促進剤を塗布しておくことができる。さらに、毛細管の内面または繊維に血液を良く吸い込むように予め界面活性剤コーティング処理をしておくことが出来る。 血液吸収器具に採取した患者の血液が満たされており、感染防止のため血液吸収器具に触れることなく、全血を取り出さなければならない。血液で満たされた血液吸収器具を、マイクロチューブ型遠心管（３）に、血液吸収器具の毛細管側が底になるよう挿入する。 マイクロチューブ型遠心管（４）は、内径が先端に行くに従って細くなっており、血液吸収器具（１）を挿入しても、血液吸収器具（１）の先端の外径がマイクロチューブ型遠心管（４）の内径にぶっかって先端に届かない構造になっている。先端との間に出来た空隙、血球溜間隙（４）に血液が溜まるようになっている。血液吸収器具（１）を収容したマイクロチューブ型遠心管（３）を、小型遠心器に設置し遠心すると、血液吸収器具（１）から全血が、マイクロチューブ型遠心管（３）の血球溜間隙（４）にリリースする。 速度制御できる小型卓上遠心機は、最初低速回転で数分間回転させ、血液吸収器具（１）内の全血が全てマイクロチューブ型遠心管（４）の底の血球溜間隙（４）にリリースされる。回転数や遠心時間は予めプログラムしておけば自動的に制御することが出来る。初めから一般的な血清分離用の回転数２５００から３０００回転／分で遠心分離すると、血液吸収器具の毛細管または繊維から全血が血球溜間隙（４）にリリースする際の重力による衝撃で血液が溶血することがある。また、ガラスまたは合成繊維との摩擦により溶血がおこることがある。血液吸収器具から全血がリリースした後は、通常の血漿または血清の遠心分離操作をすることで血漿または血清を分離することができる。 血漿または血清が分離した後、マイクロチューブ型遠心管（３）から血液吸収器具（１）を取り出すと、マイクロチューブ型遠心管（３）の底に微量の血球成分と血球成分の上清に血漿または血清が得られる。この血漿または血清を注意深く特許文献５に示すようなマイクロピペットで取り出す。微量の例えば１〜２０μＬの血漿または血清を一定量採取するにはマイクロピペットの操作に慣れないと中々正確に採取できないが、特許文献３の「毛細管による微量検体採取・希釈・分注方法及び器具」を用いると簡単に一定量の血漿又は血清が採取できる。 血液吸収器具１の実施例おおよそ内径４〜６ｍｍ、長さ４０ｍｍのポリプロピレン（ｐｐ）製の透明なストロー状のパイプにガラスまたはプラスチックの毛細管をパイプに毛細管が平行になる様一定長パイプの先端に詰めたものである。毛細管の長さは１０から１５ｍｍ程度が使い易い。毛細管群の入っていないストロー状のパイプ部分は血液採取時の保持部となる。内蔵する毛細管の数・内径にもよるが、毛細管の長さが１０ｍｍとすれば、約４０〜６０μＬの全血が採取できる。数・内径・長さを選ぶことで採取できる血液量は自在に変化できる。ガラスまたはプラスチック毛細管群に予め抗凝固剤たとえばヘパリンＮａ１単位／μＬまたはＥＤＴＡ２Ｎａｌｍｇ／ｍＬを塗布しておけば血漿が採取できる。また逆に凝固促進剤トロンビン０．０１〜２５ｍｇ／ｍＬを塗布させておけば血清が得られる。ガラスや合成樹脂の毛細管をストロー状パイプに詰めるのではなく、初めから複数の毛細管を一定の長さにストロー状に成型することも出来る。 血液吸収器具２の実施例血液吸収器具において毛細管機能を持たせた繊維を使った例。赤血球膜は少し力を掛けるとすぐ破れ溶血する。毛細管機能を持たせた繊維でも綿花のような繊維は血液を吸着しリリースができない。本願に使用する毛細管機能を持たせた繊維とは、血液を吸着しない合成樹脂、例えばポリプロピレンのような繊維でその表面がなめらかな繊維を、縦にきれいに蜜に並べ、繊維間の間隙を利用すれば結果的に毛細管機能をもたせることになる。また、繊維の表面に予め血液が吸着しないようにシリコーンや界面活性剤を塗布し乾燥しておけば、血液のリリース効果は高まる。 マイクロチューブ型遠心管の実施例マイクロチューブ型遠心管は、血液を採取した血液吸収器具を入れる遠心管で、材質は透明なポリプロプレン製が望ましい。そして、内径は先端に行くに従って尖っている。血液吸収器具（１）の外径がこの内径に引っかかり、先端との間に血球溜間隙（４）ができる。この血球溜間隙に全血が溜まり、その後の遠心操作により血球成分と血漿または血清成分が分けられる。先端に口が小さい個室を作っておけば、血球部分はこの個室に入り、血漿または血清を取り出すとき、血球を混じりにくくすることが出来る。 複数の速度制御できる小型卓上遠心機は、最初１００回転／分で２分間程度が望ましい。但し血液吸収器具（１）に使用する毛細管または毛細管機能を持たせた繊維やその構成状態により１００から１０００回転／分と任意に選択できる。予め回転数と回転時間をプログラムしておけば、回転数や時間を気にすることなく血漿または血清が分離できる。 今後ベットサイド検査（ＰＯＣＴ）は、我が国ばかりでなく全世界の医療検査の中心的役割を果たすであろうと言われている。既にＰＯＣＴ検査機器の方は高性能で簡便な機器が出現しつつある。しかし、検査材料である血清・血漿を得る方法は殆ど進化しておらず相変わらず注射器や真空採血管で採血し遠心分離の後得られる。我々は既に特許文献３に示す超微量検体を精度よく簡便に一定量採る方法を発明し出願した。特許文献３に示す一定量正確に検体を採取する前に、簡単な採血器具であるランセットで採った全血から血清または血漿を分離しなければ、ＰＯＣＴの本格的な普及はおぼつかない。本願の「微量の血液から血漿を分離する方法とその器具」が実用化されれば、全世界の津々浦々の小さな診療所でも、大きな自動分析装置を使うことなく、専門の検査技師を介在させることなく、小さなランセット採血から血漿または血清が得られるので正確な血液検査ができるようになる。 血液吸収器具で採取した全血から血漿または血清を分取することは意外と難しい。血球は直径がおおよそ８μｍと小さくかつ血液１ｍＬｍ中に３００〜５００万個存在する。また圧力をかければ容易に壊れたり、形を変えてピンホールをすり抜ける。細菌濾過用のメンブランフィルターで濾過しようとの試みもされているが、全血中の血球量が多すぎすぐ目詰まりするので、簡単に血漿または血清を分離することはできない。本願は、注射器や真空採血管を使用せず、ランセットで採取した血液から血漿または血清を分離するものであり、採血から血漿分取までの手順に係る方法と器具を提供するものであり、今後のＰＯＣＴの分野では不可欠な器具となる。 （１） 血液吸収器具（２） 毛細管または毛細管機能をもったガラスまたは合成樹脂繊維（３） マイクロチューブ型遠心管（４） 血球溜間隙 ランセット等穿刺器具を指や耳朶などの皮膚に刺し血液を吐出させ、ストロー状のガラスまたは合成樹脂製の複数の毛細管の束を構成または合成樹脂等の繊維をストロー状のパイプの長さ方向に一定量内蔵させることで毛細管機能を持たせた血液吸収器具に触れるだけで血液を吸入採取し、血液側が底になるようマイクロチューブ型遠心管に挿入した後、低速遠心分離用遠心機で血液吸収器具内の血液をマイクロチューブ型遠心管の底にリリースさせた後、普通の血漿または血清分離のための遠心分離をすることにより微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具。 前項血液を吸収するストロー状のガラスまたは合成樹脂製の血液吸収器具は、一定長のガラスまたは合成樹脂製の毛細管を複数個ストロー状の合成樹脂製パイプに詰め込んだ毛細管束で構成されまたは初めから複数の毛細管を組込んだ形に成型したことを特徴とする請求項１の微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具。 マイクロチューブ型遠心管用に用いる遠心機は、最初低速回転で、血液吸収器具から血液をリリースし、血液をリリースした後は血漿又は血清分離用の普通の遠心分離操作が出来るように構成された遠心分離装置を使用する請求項１の微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具。 マイクロチューブ型遠心管は、超微量の血液から血漿または血清を取り出せるよう、内径が先端に行くに従い細くなっている構造を有し、内部に血液吸収器具を挿入したとき、血液吸収器具の先端の直径がマイクロチューブ型遠心管の内径にぶつかり先端との間に僅かな空隙ができるようにしたことを特徴とする請求項１の微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具。 血液吸収器具の毛細管群の内面または毛細管機能を有する繊維に予め血液抗凝固剤または血液凝固促進剤を個別に塗布しておき、血漿または血清を選択的に採取できることを特徴とした請求項１の微量の血液から血漿または血清を分離する方法とその器具。 【課題】ランセットで採取した微量の全血から血漿または血清を簡単に分離する方法と器具を提供する。【解決手段】毛細管群で構成する血液吸収器具１を用い、採取した血液を複数の速度制御できる小型卓上遠心機により、先ず血液吸収器具から全血をリリースさせた後、通常の遠心分離を行い血漿または血清を分離する。【選択図】図１