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芝田 信人 西村 亜佐子 JP 2011162537 公開特許公報(A) 20110825 2010161767 20100716 インスリン製剤 学校法人同志社 503027931 津国 肇 100078662 齋藤 房幸 100116919 鈴木 音哉 100141357 芝田 信人 西村 亜佐子 JP 2010005540 20100114 A61K 38/28 20060101AFI20110729BHJP A61K 47/42 20060101ALI20110729BHJP A61P 3/10 20060101ALI20110729BHJP A61K 9/08 20060101ALI20110729BHJP C07K 7/08 20060101ALN20110729BHJP JPA61K37/26A61K47/42A61P3/10A61K9/08C07K7/08 4 ＯＬ 13 4C076 4C084 4H045 4C076AA12 4C076CC30 4C076EE41M 4C076EE41Q 4C076FF31 4C084AA03 4C084BA44 4C084CA18 4C084DB34 4C084MA05 4C084NA12 4C084ZC352 4H045AA10 4H045AA20 4H045AA30 4H045BA17 4H045EA27 4H045FA10 本発明は、インスリン製剤に関する。 世界保健機関（ＷＨＯ）によると、２００６年の時点で世界には少なくとも1億７１００万人の糖尿病患者がいるという。患者数は急増しており、２０３０年までにこの数は倍増すると推定されている。日本国内の患者数は、この４０年間で約３万人から７００万人程度にまで膨れ上がってきており、境界型糖尿病（糖尿病予備軍）を含めると２０００万人に及ぶともいわれる。 現在、様々な種類の皮下注射用インスリン製剤が、市販されている。これらの製剤は、効果発現の速さによって、超速効型、速攻型、中間型、混合型、時効型に分類することができる。 超速効型には、ヒトインスリンアナログである、インスリンアスパルト、インスリンリスプロなどの水溶性製剤がある。これらは、インスリンの６量体の形成を回避することによって、皮下注射後のインスリンの組織内での拡散吸収性を高めた製剤である。 速効型は、従来の半合成ヒトインスリンが使用された水溶性製剤が主である。一方、中間型、混合型のインスリン製剤では、ヒトインスリンを使用してその６量体からの分解を抑制するように製剤を設計し、白色の懸濁液とした製剤が使用されている。また、持効型製剤では、インスリン６量体からの分解を抑制した、インスリングラルギン、インスリンデテミルなどのヒトインスリンアナログを使用した水溶性製剤が使用されている。 臨床現場では、インスリンの基礎分泌料や変動パターンに応じて、これらのインスリン製剤が単独か又は併用により使用されているのが現状である。 しかし、特に中間型製剤や混合型製剤などに見られるように、白色の懸濁液とした製剤については、使用する前の転倒混和による混合が不十分である場合には、血糖値が十分にコントロールされないケースも報告されている。したがって、インスリン自体の特性や製剤の特性が、治療効果に大きな影響を及ぼしているのが現行の製剤による治療状況である。また、インスリンアナログは、プロトタイプのインスリンよりもコストがかかるという問題もある。 自己組織化ペプチドは、そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己会合体を形成する特性を有する。近年、その物理的、化学的、生物学的性質から、新規マテリアルとして注目を浴びている。 自己組織化ペプチドは、電荷を帯びた親水性アミノ酸と電気的に中性な疎水性アミノ酸が交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布する構造をもち、生理的なｐＨと塩濃度においてβ構造をとる。 親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸、およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシンを使用することができる。 自己組織化ペプチドを含むハイドロゲルは、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことから、細胞の生着や増殖に適している。 ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ）らは、自己組織化ペプチドを含むハイドロゲルが、インスリン等のタンパク質型薬剤の徐放用担体として有用であることを記載している（特許文献１）。しかし、実際に特定の薬剤を徐放用担体は作成されておらず、薬剤の選択や、薬剤の放出時間の最適化はなされていない。米国特許第７０９８０２８号明細書 本発明は、一つの種類のインスリンを用いて、水溶性インスリンを一定に放出することができ、かつ、インスリンの放出量を制御することができる、新規なインスリン製剤を提供する。 本発明は、自己組織化ペプチドを含むインスリン製剤に関する。 本発明のインスリン製剤は、一つの種類のインスリンを用いて、水溶性インスリンを一定に放出することができ、かつ、インスリンの放出量を制御することができる。ＰＭ製剤である処方１〜３および対照をラットに皮下投与したときの血糖濃度の％変化を示す。Ｎ＝６、インスリン濃度：１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）、注射容量は２００μＬ／ｋｇとした。ＰＭ製剤である処方２、処方４および対照をラットに皮下投与したときの血糖値の％変化を示す。Ｎ＝４、インスリン濃度：１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）、注射容量は２００μＬ／ｋｇとした。ＰＭ製剤である処方４〜１０および対照をラットに皮下投与したときの血糖濃度の％変化を示す。Ｎ＝６、インスリン濃度：１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）、注射容量は２００μＬ／ｋｇとした。ＰＭ製剤である処方４〜１０および対照をラットに皮下投与したときの血糖濃度の％変化を示す。Ｎ＝６、インスリン濃度：１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）、注射容量は２００μＬ／ｋｇとした。ＰＭ製剤である処方４〜１０および対照をラットに皮下投与したときの血糖濃度の％変化を示す。Ｎ＝６、インスリン濃度：１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）、注射容量は２００μＬ／ｋｇとした。ＰＭ製剤のヒューマリンＲに対するＲＰＡの比較を示す。 本発明者らは、細胞培養の足場として利用されている自己組織化ペプチドハイドロゲルをＤＤＳに適用することにより、一つの種類のインスリンを用いて、水溶性インスリンを一定に放出することができ、かつ、インスリンの放出量を制御することができることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、下記のとおりである。 ［１］配列番号１の自己組織化ペプチドを含む、インスリン製剤。 ［２］配列番号１の自己組織化ペプチドの濃度が、０．１〜０．２５％（ｗ／ｖ）である、超即効型インスリン製剤。 ［３］配列番号１の自己組織化ペプチドの濃度が、１．０〜２．０％（ｗ／ｖ）である、持効型インスリン製剤。 ［４］インスリンが、野生型のインスリンである、上記［１］〜［３］のいずれか一に記載のインスリン製剤。 本発明における自己組織化ペプチドの好ましい具体例としては、（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＣＯＮＨ２）配列（配列番号：１）を有するペプチドＲＡＤ１６を挙げることができる。ＲＡＤ１６は、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）としてその１％（ｗ／ｖ）水溶液が、株式会社スリー・ディー・マトリックスから製品化されている。ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）には、１％（ｗ／ｖ）の（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＣＯＮＨ２）配列（配列番号：１）を有するペプチドの他、水素イオン、塩化物イオンが含まれる。 本発明の自己組織化ペプチドは、合成により製造することができるため、従来の生体由来材料と比べてウイルス等の感染の危険もないうえ、それ自身は生体吸収性であるため、炎症等を懸念する必要もない。 本発明に用いるインスリンは、皮下注射用に市販されている任意のインスリンを用いることができる。好ましくは、半合成ヒトインスリンのような野生型インスリン、または、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、インスリングラルギン、インスリンデテミルのようなインスリンアナログを用いることができる。より好ましくは、野生型インスリンである。 以下、実施例によって、本発明のインスリン製剤をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。 １％（ｗ／ｖ）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標：ＰＭ）によるインスリン製剤の作製 ＰＭを超純水（ミリＱ）に溶解して１％（ｗ／ｖ）及び３％（ｗ／ｖ）ＰＭを調製した。なお、インスリンにはウシ膵臓由来のインスリン（２９ＩＵ／ｍｇ）を用いた。 以下の処方によるインスリン製剤を作製した。処方１． ０．２％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ１％（ｗ／ｖ）ＰＭ ５８０μＬミリＱ １７４０μＬ全量 ２９００μＬ処方２． ０．５％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ１％（ｗ／ｖ）ＰＭ １４５０μＬミリＱ ８７０μＬ全量 ２９００μＬ処方３． ０．８％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ１％（ｗ／ｖ）ＰＭ ２３２０μＬミリＱ ０μＬ全量 ２９００μＬ処方４． １．５％ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ３％（ｗ／ｖ）ＰＭ １４５０μＬミリＱ ８７０μＬ全量 ２９００μＬ 対象およびポジティブコントロール製剤コントロールには１％（ｗ／ｖ）ＰＭのみを投与した。ポジティブコントロールには現在、市販されている半合成ヒトインシュリンを含有する製剤（速効型水溶性製剤、ヒューマリン（登録商標）Ｒ）を使用した。動物実験 １２時間〜１６時間絶食させたＷｉｓｔａｒ雄性ラット（９〜１０週齢）にウレタン麻酔（１ｇ／ｋｇ）を施し、麻酔下、各種インスリン製剤（処方１〜処方４）、コントロールおよびポジティブコントロール製剤を、腹部に皮下投与した。インスリンの投与量はすべて１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）とした。皮下投与前、皮下投与後３０分、１、２、３、４、５、６、９、１２、２４時間後に頸静脈より全血１００μＬをヘパリン添加の遠心チューブに採血し、血漿を分離した。 血漿中のグルコース濃度の測定は、市販の測定キットを用いて比色法により測定した。インスリン製剤投与前の血糖値をベースライン（１００％）とし、血糖値の変化をベースラインに対する％で表示した。 皮下投与後６時間までの検討 ＰＭの濃度が高くなるにつれて血糖降下度は大きくなった。０．５％（ｗ／ｖ）、０．８％（ｗ／ｖ）ＰＭ処方で、少なくとも６時間に渡る血漿中グルコース濃度の低下を認めた。また、血漿中グルコース濃度の最大低下度は、現在、臨床で使用されている速効型ヒューマリンＲ（Humulin R）と同程度であった。また、ＰＭ自体には血糖降下作用は認められなかった（図１）。 皮下投与後２４時間までの検討 ＰＭ濃度が０．５％（ｗ／ｖ）の場合には、２４時間に渡る血糖値の低下が認められた。ＰＭ濃度を１．５％（ｗ／ｖ）にすると、２４時間を越える血糖値の低下が認められた（図２）。 １％（ｗ／ｖ）ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標：ＰＭ）によるインスリン製剤の作製 ＰＭを超純水（ミリＱ）に溶解して１％（ｗ／ｖ）及び３％（ｗ／ｖ）ＰＭを調製した。なお、インスリンにはウシ膵臓由来のインスリン（２９ＩＵ／ｍｇ）を用いた。 以下の処方によるインスリン製剤を作製した。処方１． ０．１％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ１％（ｗ／ｖ）ＰＭ ２９０μＬミリＱ ２０３０μＬ全量 ２９００μＬ 以下の処方によるインスリン製剤を作製した。処方２． ０．２５％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ１％（ｗ／ｖ）ＰＭ ７２５μＬミリＱ １５９５μＬ全量 ２９００μＬ処方３． ０．５％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ１％（ｗ／ｖ）ＰＭ １４５０μＬミリＱ ８７０μＬ全量 ２９００μＬ処方４． １．０％（ｗ／ｖ）ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ３％（ｗ／ｖ）ＰＭ ９６７μＬミリＱ １３５３μＬ全量 ２９００μＬ処方５． １．５％ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ３％（ｗ／ｖ）ＰＭ １４５０μＬミリＱ ８７０μＬ全量 ２９００μＬ処方６． ２．０％ＰＭインスリン製剤インスリン ５ｍｇ０．０１Ｎ ＨＣＬ ５８０μＬ３％（ｗ／ｖ）ＰＭ １９３３μＬミリＱ ３８７μＬ全量 ２９００μＬ ポジティブコントロール製剤 ポジティブコントロールには現在、市販されている半合成ヒトインシュリンを含有する製剤（速効型水溶性製剤、ヒューマリンＲ）を使用した。動物実験 １２時間〜１６時間絶食させたＷｉｓｔａｒ雄性ラット（９〜１０週齢）にウレタン麻酔（１ｇ／ｋｇ）を施し、麻酔下、各種インスリン製剤（処方１〜処方６）、コントロールおよびポジティブコントロール製剤を、腹部に皮下投与した。インスリンの投与量はすべて１０ＩＵ／ｋｇ（最終濃度）とした。皮下投与前、皮下投与後３０分、１、２、３、４、５、６、９、１２、２４時間後に頸静脈より全血１００μＬをヘパリン添加の遠心チューブに採血し、血漿を分離した。 血漿中のグルコース濃度の測定は、市販の測定キットを用いて比色法により測定した。インスリン製剤投与前の血糖値をベースライン（１００％）とし、血糖値の変化をベースラインに対する％で表示した。 皮下投与後６時間までの検討 ＰＭの濃度が高くなるにつれて血糖降下度は大きくなった。０．５％（ｗ／ｖ）、１．０％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）、２．０％（ｗ／ｖ）ＰＭ処方で、少なくとも６時間に渡る血漿中グルコース濃度の低下を認めた。また、血漿中グルコース濃度の最大低下度は、現在、臨床で使用されている速効型ヒューマリンＲ（Humarin R）と同程度であった（図３）。 皮下投与後１２時間までの検討 ＰＭ濃度が０．５％（ｗ／ｖ）、１．０％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）、２．０％（ｗ／ｖ）の場合には、１２時間を越える血糖値の低下が認められた（図４）。 皮下投与後２４時間までの検討 ＰＭ濃度が１．０％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）、２．０％（ｗ／ｖ）の場合には、２４時間を越える血糖値の低下が認められた（図５）。 ヒューマリンＲに対する相対的な生理学的利用能（relative physiological availability, ＲＰＡ）を求めた。グルコース変化のデータより、６時間、１２時間、２４時間までの区切りで、血漿中グルコース濃度時間曲線上面積（area above plasma glucose concentrations in the percentage change vs. time curves, AAC）をそれぞれの製剤について求め、ヒューマリンＲのそれらに対して比較した（平均データを使用）（図６）。 この図から、２４時間でみたとき、２％ＰｕｒａＭａｔｒｉｘの効果は、ヒューマリンＲの５倍であり、かつ長時間持続していることが分かる。 本発明のインスリン製剤は、糖尿病治療剤として有用である。 配列番号１の自己組織化ペプチドを含む、インスリン製剤。 配列番号１の自己組織化ペプチドの濃度が、０．１〜０．２５％（ｗ／ｖ）である、超即効型インスリン製剤。 配列番号１の自己組織化ペプチドの濃度が、１．０〜２．０％（ｗ／ｖ）である、持効型インスリン製剤。 インスリンが、野生型のインスリンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のインスリン製剤。 【課題】水溶性インスリンを一定に放出することができ、かつ、インスリンの放出量を制御することができるインスリン製剤の提供。【解決手段】特定の１６アミノ酸残基を有し、電荷を帯びた親水性アミノ酸と電気的に中性な疎水性アミノ酸が交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布する構造をもち、生理的なｐＨと塩濃度においてβ構造をとる自己組織化ペプチドを含むインスリン製剤で、該自己組織化ペプチド濃度が０．１〜０．２５％（ｗ／ｖ）である超即効型インスリン製剤、または該自己組織化ペプチドの濃度が１．０〜２．０％（ｗ／ｖ）である持効型インスリン製剤。【選択図】なし配列表

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