生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_アルギニンを欠乏させることによってヒト悪性腫瘍を治療する医薬品及び方法 |
| 出願番号： | 2010007090 |
| 年次： | 2013 |
| IPC分類： | C12N 9/80,A61K 38/46,A61P 35/00,A61K 45/00,C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
ニン・マン・チェン ユン・チュン・レウン ワイ・フン・ロ JP 5307042 特許公報(B2) 20130705 2010007090 20100115 アルギニンを欠乏させることによってヒト悪性腫瘍を治療する医薬品及び方法 バイオ−キャンサー・トリートメント・インターナショナル・リミテッド 504466605 蔵田 昌俊 100108855 河野 哲 100091351 中村 誠 100088683 福原 淑弘 100109830 峰 隆司 100075672 白根 俊郎 100095441 村松 貞男 100084618 野河 信久 100103034 ニン・マン・チェン ユン・チュン・レウン ワイ・フン・ロ US 60/390,757 20020620 CN PCT/CN02/00635 20020909 20131002 C12N 9/80 20060101AFI20130912BHJP A61K 38/46 20060101ALI20130912BHJP A61P 35/00 20060101ALI20130912BHJP A61K 45/00 20060101ALI20130912BHJP C12N 15/09 20060101ALI20130912BHJP JPC12N9/80 ZA61K37/54A61P35/00A61K45/00C12N15/00 A Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０ ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ 国際公開第９８／０２４４７３（ＷＯ，Ａ１） SAVOCA K V，CANCER BIOCHEMISTRY BIOPHYSICS，米国，GORDON AND BREACH SCIENCE PUBLISHER, INC，１９９４年，V7 N3，P261-268 Biochem.J.,Vol.270(1990)p.697-703 PNAS,Vol.84(1987)p.412-415 13 2004530914 20030620 2010148509 20100708 41 20100215 三原 健治発明の分野 本発明は、アルギナーゼを含有する薬学的組成物及びその使用に関する。特に、本発明は、腫瘍患者のアルギニンレベルを低下させることができる薬学的組成物及びヒト悪性腫瘍を治療するためのその使用に関する。本発明は、組換えタンパク質を作製する方法にも関する。発明の背景 アルギナーゼＩ（ＥＣ３．５．３．１、Ｌ−アルギニンアミジノヒドロラーゼ）は、尿素回路において、アルギニンをオルニチンと尿素に変換する尿素生成の最終段階を触媒する重要な哺乳類肝臓の酵素である。ラット肝臓抽出物にはアルギナーゼが豊富に含まれているが、腫瘍細胞培養液に偶然添加した際に、この抽出物がｉｎ ｖｉｔｒｏで抗腫瘍特性を有することが明らかになった(Burton et al., 1967, Cytolytic action of corticosteroids on thymus and lymphoma cells in vitro. Can J. Biochem. 45, 289-297)。その後の実験により、本酵素の抗腫瘍特性が、培養液中の必須アミノ酸であるアルギニンの減少によるものであることが明らかとなった。アルギニン濃度が８μＭ未満では、癌細胞が細胞死を起こし、再生不能となった(Storr & Burton、1974、The effects of arginine deficiency on lymphoma cells. Br. J. Cancer 30, 50-59)。 さらに最近では、強力なシグナル分子であり、神経伝達物質、平滑筋弛緩物質、および血管拡張物質として機能する一酸化窒素（ＮＯ）合成の直接的な前駆体としてのアルギニンの役割に注目が集まっている。ＮＯの生合成には、Ｃａ＋＋、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）により触媒されるＮＡＤＰＨ−依存性反応が関わっている。他に知られているアルギニンの役割としては、オルニチンを介して、細胞増殖及び成長をはじめとする幅広い生理的過程に関与するポリアミン、スペルミジン、及びスペルミンの前駆体として働くことが挙げられる(Wu & Morris, 1998, Arginine metabolism:nitric oxide and beyond. Biochem. J. 336, 1-17)。 アルギニンは、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）を含むいくつかの重要な酵素の基質としての役割も有している。ＮＯＳには、ｎＮＯＳ、ｅＮＯＳ及びｉＮＯＳの３種類があり、全てアルギニンを一酸化窒素及びシトルリンに変換する。例えば、ＮＯにより引き起こされる顔面紅潮は、神経型のＮＯＳであるｎＮＯＳを介して起こる。誘導型ＮＯＳであるｉＮＯＳは、マクロファージにより産生されるが、敗血症の際にアルギニンから産生されたＮＯによって、内毒素性ショックで血管拡張が引き起こされる。内皮型ＮＯＳであるｅＮＯＳは、血管内皮細胞により産生される。これはアルギニンをＮＯに変換し、ｃＧＭＰ機構により内皮表面において血小板凝集抑制を引き起こす。局所的な内皮の裏打ち構造でｅＮＯＳにより産生されるＮＯの半減期はおよそ５秒であり、拡散距離はおよそ２ミクロンである。 これらの酵素の産生は、１２、１７及び７番染色体にそれぞれコードされている様々なＮＯＳ遺伝子（ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＮＯＳ３）により調節されている。これらの遺伝子は、エクソンのサイズ及びスプライスジャンクションの部位が非常に似たゲノム構造を持っている。 アルギニン欠乏によるｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗腫瘍活性が、最近、イギリス、スコットランドのグループ(Scott et al, 2000, Single amino acid (arginine)deprivation:rapid and selective death of cultured transformed and malignanat cells. Br. J. Cancer 83, 800-810;Wheatley et al., 2000, Single amino acid(arginine)restriction: Growth and Death of cultured HeLa and Human Diploid Fibroblasts. Cellular Physiol. Biochem. 10, 37-55)により確認された。乳癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌及び卵巣癌といった代表的な癌を含む２４種類の様々な腫瘍細胞系列に対して試験を行ったところ、何れもアルギニンを欠乏させてから５日以内に死滅した。そのグループをフローサイトメトリーにより観察したところ、正常細胞系列は最長数週間にわたって細胞周期のＧ０期で静止期に入り、明らかな悪影響を受けないことが示された。しかし、腫瘍細胞は、アルギニンが欠乏すると、Ｇ１期の「Ｒ」ポイントを通過し、Ｓ期に入る。必須アミノ酸であるアルギニンが存在しないと、タンパク質合成が異常となる。ある細胞株ではアポトーシスによる細胞死が見られた。さらに興味深いことに、繰り返し欠乏させることで、「耐性」を高めることなく、腫瘍を殺すことが可能になる(Lamb et al., 2000, Single amino acid(arginine)deprivation induces Gl arrest associated with inhibition of Cdk4 expression in cultured human diploid fibroblasts. Experimental Cell Research 225, 238-249)。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでは有効なデータが出ているにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏでアルギニン欠乏によって癌を治療するという試みは成功していなかった。最初に着手したＳｔｏｒｒのグループは、肝臓抽出物を腹腔内に投与して腫瘍を有するラットの治療を試みたが良い結果を得られなかった(Storr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells. Br. J. Cancer 30, 50-59)。正常な生理的条件下では、血漿アルギニンレベルや他のアミノ酸レベルも、主要な制御器官である筋肉により正常範囲（１００−１２０μＭ）に維持されることが現在広く知られている。アミノ酸欠乏に直面すると、細胞内タンパク質分解経路が活性化され（プロテアーゼ及びリソソーム系酵素）、循環系にアミノ酸が放出される(Malumbres & Barbacid, 2001, To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer. Nature Reviews, 1, 222-231)。このアミノ酸ホメオスタシス機構により、様々なアミノ酸レベルが一定の範囲に維持される。従って、様々な物理的方法又はアルギニン分解酵素を用いた以前のアルギニン欠乏実験で期待される結果が得られなかったのは、身体のアミノ酸ホメオスタシス機構によるものである。 生来の身体ホメオスタシス機構による問題を解決するために、米国特許番号６，２６１，５５７号においてＴｅｐｉｃらは、治療用組成物、及び、アルギニン減少分が身体の筋肉により補充されないようインスリンなどのタンパク質分解阻害剤と組み合わせてアルギニン分解酵素を用いる癌治療方法について記載している。 インスリンがタンパク質分解阻害剤として作用しうるにもかかわらず、ヒトの体に対する生理的影響が広範囲にわたるために、患者の血糖値が狭い正常範囲内に厳密に維持されない場合は、致命的な問題を引き起こしうる。従って、本発明の目的は、癌治療に対する治療方法及び組成物を改善することにある。 従って、本発明は、１つの側面において、単離され且つ実質的に精製された純度が８０−１００％の組換えヒトアルギナーゼＩを提供する（簡略化するために、特に明記しない限り、以下、「アルギナーゼ」と言う）。好ましい実施形態において、本アルギナーゼの純度は、９０−１００％である。最も好ましい実施形態においては、本発明のアルギナーゼは少なくとも９９％の純度を有する。下記の実施例において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後のデンシトメトリー測定によるアルギナーゼの純度は９９．９％を超える。 別の好ましい実施形態において、本発明のアルギナーゼは、十分高い酵素活性と安定性を有するように修飾されており、患者の体内で少なくとも３日間、「適切なアルギニン欠乏状態」（以下、「ＡＡＤ」という）を維持させる。ある好ましい修飾方法は、アミノ末端に６個のヒスチジンタグを付加することでる。別の好ましい修飾は、酵素の安定性を向上させ、患者によって引き起こされる免疫反応を最低限に抑えるためにＰＥＧ処理（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を行うことである。下記の実施例において、アルギナーゼの血漿半減期は、少なくともおよそ３日であり、比活性は少なくともおよそ２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇである。 本発明の別の側面において、（ａ）前記タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることと、（ｂ）前記タンパク質を発現させるための組換えＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ株を構築することと、（ｃ）フェドバッチ発酵を用いて前記組換えＢ． ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ細胞を発酵させることと、（ｄ）前記組換えＢ． ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ細胞にヒートショックを与えて、前記組換えタンパク質の発現を刺激することと、（ｅ）前記発酵による産物から前記組換えタンパク質を精製することと、を含む、組換えタンパク質を作製する方法、を提供する。好ましい実施形態において、組換え株としてプロファージが用いられる。ヒト組換えアルギナーゼのクローニング及び発現のために、フェドバッチ発酵法及び上記プロファージを用いることにより、６００ｎｍ（ＯＤ）波長での最大光学密度が４倍を超えて上昇し、次の項の実施例３で示すように、アルギナーゼの収率及び産生率の両方が５倍を超えて向上する。さらなる実施形態において、組換えタンパク質を産生するために発酵過程をスケールアップすることができる。さらなる実施形態において、明確に規定された１８０−３２０ｇ／Ｌのグルコースと、２−４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏと、４５−８０ｇ／Ｌのトリプトンと、７−１２ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４と、３−６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４とを含有する栄養源供給培地を用いて発酵過程を行う。 明確に規定された培養液を用いることにより、本組換えタンパク質と共に不必要な物質が精製されることを防ぎ、医薬品グレードの組換え物質を安全で効果的に産生する方法が確立される。 さらなる別の好ましい実施形態として、アミノ末端に追加された６個のヒスチジンをコードするコード領域が付加されたヒトアルギナーゼ遺伝子と、精製過程にキレートカラムクロマトグラフィー過程を包含する精製方法とを提供する。さらなる好ましい実施形態において、アルギナーゼ酵素はＰＥＧ処理によりさらに修飾され、安定性を向上させる。 本発明の別の側面において、アルギナーゼを含有する薬学的組成物をさらに提供する。好ましい実施形態において、前記アルギナーゼは十分に高い酵素活性及び安定性を有し、患者体内で少なくとも３日間、ＡＡＤを維持させる。最も好ましい実施形態においては、前記アルギナーゼをさらにＰＥＧ処理により修飾して安定性を向上させ、免疫反応を最小限に抑える。 本発明の別の側面によると、アルギナーゼを用いてさらに薬学的組成物を調剤する。 本発明のさらに別の側面において、他のタンパク質分解阻害剤を必要とせずに、調剤された本発明の薬学的組成物を患者に投与して、投与した患者のアルギニンレベルを少なくとも３日間、１０μＭ以下に維持することを含む、疾患の治療方法を提供する。ある好ましい実施形態では、非糖尿病患者に対して体外からのインスリン投与を行わない。 さらに、最も好ましい本発明の治療方法には、患者の血中の血小板数（好ましくは、５０，０００ｘ１０９以上に維持する）及びプロトロンビン時間（正常値の２倍を超えないよう維持する）のモニタリングが含まれる。血小板数及びプロトロンビン時間がこれらのレベルに達しない限り、一酸化窒素産生物質を体外から投与しない。 本発明の本側面における別の好ましい実施形態において、３０分間にわたる短時間投与として、３，０００−５，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇのＰＥＧ化アルギナーゼを投与する。アルギナーゼ投与前、及び、その後毎日、アルギニンレベル及びアルギナーゼ活性を測定する。第２日目に、ＡＡＤが一定の基準に到達しない場合は、次回のアルギナーゼ投与用量は、治療を実施する医師が決定する。ＡＡＤの最大耐性時間とは、血圧が調節され（薬物投与の有無は治療を実施する医師の判断による）、血小板数が５０，０００ｘ１０９以上であり、プロトロンビン時間が正常値の２倍未満の時間として定義される。アルギニンレベルとともに、完全血球算定（ＣＢＣ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）測定を毎日行う。本治療中、少なくとも週に２回、肝臓の化学的指標を測定する。 次の詳細な説明において提供する実験データは、十分に効果的な形で提供される場合は、アルギナーゼが悪性腫瘍の治療に有用であることを示している。組換えヒトアルギナーゼＩは、本開示において使用されるアルギナーゼの具体的な実施形態であるが、他の形態のアルギナーゼ及び／又は他の採取源から得られるアルギナーゼも、本発明に使用できることが明らかである。図１は、ｐＡＢ１０１のプラスミドマップを示す。このプラスミドは、アルギナーゼ（ａｒｇ）をコードする遺伝子を有し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製されるが、B. subtilis中では複製されない。図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、ヒトアルギナーゼＩのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列を示す。図２Ａは、プラスミドｐＡＢ１０１のＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩ部位からＸｂａＩ部位までのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。ヌクレオチド（ｎｔ）１−６はＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩ部位、ｎｔ４８１−４８６はプロモーター１の−３５領域、ｎｔ５０４−５０９はプロモーター１の−１０領域、ｎｔ５４４−５４９はプロモーター２の−３５部位、ｎｔ５６６−５７１はプロモーター２の−１０領域、ｎｔ６００−６０５はリボソーム結合部位、ｎｔ６１４−６１６は開始コドン、ｎｔ６３２−６３７はＮｄｅＩ部位、ｎｔ１６０１−１６０３は停止コドン、ｎｔ１９９７−２００２はＸｂａＩ部位である。図２Ｂは、修飾ヒトアルギナーゼのコーディングヌクレオチド配列（配列番号：２）及びそれに対応するコードアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。図２Ａのヌクレオチド６１４−１６０３は、修飾アルギナーゼのアミノ酸配列に対するコード領域である。Ｎ末端の６ｘＨｉｓ（配列番号：４）タグに下線が付されている。翻訳停止コドンにはアスタリスクが付されている。図２Ｃは、正常ヒトアルギナーゼＩのコーディングヌクレオチド配列（配列番号：８）及びそれに対応するコードアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。図３は、アルギナーゼを発現する、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓのプロファージの構造の模式図である。図４Ａ及び４Ｂは、２リットルの発酵容器における組換えＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＬＬＣ１０１の発酵のタイムコースを示す。図４Ａは、バッチ発酵で得た結果を示す。図４Ｂは、フェドバッチ発酵で得た結果を示す。図５Ａ及び５Ｂは、温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素量等のパラメーターの変化を示す発酵の時間変化プロットを表している。図５Ａは、バッチ発酵における時間変化プロットを示す。図５Ｂは、フェドバッチ発酵における時間変化プロットを示す。図６Ａ及び６Ｂは、ヒートショックから３時間後に最初の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐキレートカラムによって行ったヒトアルギナーゼの生化学的精製の結果を示す。図６Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図６Ｂは、上記カラムから回収した１１−３１の各画分５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図７Ａ及び７Ｂは、ヒートショックから３時間後に２回目の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ キレートカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図７Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図７Ｂは、上記カラムから回収した９−３９の各分画１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図８Ａ及び８Ｂは、ヒートショックから６時間後に最初の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ キレートカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図８Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図８Ｂは、前記カラムから回収した１０−３２の各分画２．５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図９Ａ及び９Ｂは、ヒートショックから６時間後に行った２回目の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ キレートカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図９Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図９Ｂは、前記カラムから回収した８−Ｅ６の各分画２μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図１０は、細胞密度がさらに高い時にヒートショックを行ったバクテリア細胞の増殖タイムコースを示す。培養密度（ＯＤ６００ｎｍ）がおよそ２５になった８時間の時点でヒートショックを行った。図１１は、細胞密度がさらに高い時にヒートショックを行ったフェドバッチ発酵の時間変化プロットである。このプロットは、温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素量等のパラメーターの変化を示す。図１２Ａ及び１２Ｂは、ヒートショック（細胞密度が高い（ＯＤ２５）時に行った）から６時間後に最初の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐキレートカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図１２Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図１２Ｂは、カラムから回収した１６−４５の各分画５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）であり、レーン「未精製」はカラム添加前の未精製細胞抽出液、５μｌである。図１３Ａ及び１３Ｂは、ヒートショック（細胞密度が高い（ＯＤ２５）時に行った）から６時間後に２回目の５ｍｌ ＨｉＴｒａｐキレートカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図１３Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図１３Ｂは、カラムから回収した７−３４の各分画５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図１４Ａ及び１４Ｂは、ヒートショック（細胞密度が高い（ＯＤ２５）時に行った）から６時間後に最初の１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図１４Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図１４Ｂは、カラムから回収したＡ１１−Ｂ７の各分画５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図１５Ａ及び１５Ｂは、ヒートショック（細胞密度が高い（ＯＤ２５）時に行った）から６時間後の、２回目の１ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラムによって行ったヒトアルギナーゼの精製結果を示す。図１５Ａは、ＦＰＬＣの実行パラメーター及びタンパク質溶出プロファイルを示す。図１５Ｂは、カラムから回収したＡ６−Ｂ１２の各分画５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で分析した結果を示す。タンパク質ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色し、脱色してタンパク質バンドが見えるようにした。レーンＭは低分子量の分子量マーカー（バンドあたり１μｇ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、各バンドは９７，４００、６６，２００、４５，０００、３１，０００、２１，５００、１４，４００ ＭＷ（ダルトン）である。図１６Ａ及び１６Ｂは、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０になるようにしてｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ ５，０００）で修飾したヒトアルギナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）分析の結果である。図１６Ａは、反応を氷中で行った際の結果を示す。レーン１：低分子量のタンパク質マーカー、レーン２：アルギナーゼ（５．３５μｇ）ＰＥＧ非添加（コントロール）、レーン３：反応１時間後、レーン４：反応０．５時間後、レーン５：反応２時間後、レーン６：反応３時間後、レーン７：反応４時間後、レーン８：反応５時間後、レーン９：反応２３時間後である。図１６Ｂは、室温で反応を行った際の結果を示す。レーン１：低分子量のタンパク質マーカー、レーン２：アルギナーゼ（５．３５μｇ）ＰＥＧ非添加（コントロール）、レーン３：反応１時間後、レーン４：反応０．５時間後、レーン５：反応２時間後、レーン６：反応３時間後、レーン７：反応４時間後、レーン８：反応５時間後、レーン９：反応２３時間後である。図１７Ａ及び１７Ｂは、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：２０になるようにしてｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ ５，０００）により修飾したヒトアルギナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）分析の結果である。図１７Ａは、反応を氷中で行った際の結果を示す。レーン１：低分子量のタンパク質マーカー、レーン２：アルギナーゼ（５．３５μｇ）ＰＥＧ非添加（コントロール）、レーン３：反応１時間後、レーン４：反応０．５時間後、レーン５：反応２時間後、レーン６：反応３時間後、レーン７：反応４時間後、レーン８：反応５時間後、レーン９：反応２３時間後である。図１７Ｂは、室温で反応を行った際の結果を示す。レーン１：低分子量のタンパク質マーカー、レーン２：アルギナーゼ（５．３５μｇ）ＰＥＧ非添加（コントロール）、レーン３：反応１時間後、レーン４：反応０．５時間後、レーン５：反応２時間後、レーン６：反応３時間後、レーン７：反応４時間後、レーン８：反応５時間後、レーン９：反応２３時間後である。図１８Ａは、ｍＰＥＧ−ＣＣ（ＭＷ ５，０００）により修飾したヒトアルギナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）分析の結果である。反応は氷中で行った。レーン１：低分子量のタンパク質マーカー、レーン２：アルギナーゼ（５．３５μｇ）ＰＥＧ非添加（コントロール）、レーン３：アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０になるようにして反応を行った際の反応２時間後試料、レーン４：サンプルなし、レーン５：アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０になるようにして反応を行った際の反応２３時間後試料、レーン６：アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：２０になるようにして反応を行った際の反応２時間後試料、レーン７：アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：２０になるようにして反応を行った際の反応５時間後試料、レーン８：反応５時間後試料、レーン９：反応２３時間後の試料である。図１８Ｂは、ＰＥＧ処理を行わないアルギナーゼ、及びＰＥＧ処理を行ったことにより高い活性と安定性を有するアルギナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）分析の結果を示す。レーン１：低分子量のタンパク質マーカー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）、レーン２：非処理アルギナーゼ（１μｇ）、レーン３：ＰＥＧ処理を行ったアルギナーゼ（１μｇ）：ＰＥＧのモル比が１：５０になるようにして反応を行った際の反応２時間後試料、レーン４：十分に透析を行った(ultra-dialysis)後のＰＥＧ処理アルギナーゼ（１．５μｇ）。図１９Ａ及び１９Ｂは、単離された組換えヒトアルギナーゼの純度測定結果を示す。図１９Ａにおいて、レーン１：Ｉｋｅｍｏｔｏらの方法(Ikemoto et al., 1990, Biochem. J. 270, 697-703)により得た５μｇの精製Ｅ．ｃｏｌｉ−発現組換えヒトアルギナーゼ試料、レーン２：この報告の方法により得た５μｇの精製B. subtilis−発現組換えヒトアルギナーゼ試料を示す。図１９Ｂは、Lumi-imagerのLumianalyst 32プログラム(Roche Molecular Biochemicals)による、図１９Ａで示されているタンパク質バンドの密度分析結果を示す。上のパネル：図１９Ａ、レーン１の結果、下のパネル：図１９Ａ、レーン２の結果である。図２０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＰＥＧ処理アルギナーゼのヒト血漿中での安定性を示す図表である。図２１及び２２は、実施例８Ａで記述した方法により得たＰＥＧ処理アルギナーゼのｉｎ ｖｉｖｏ測定半減期を示す。図２１は、実施例９Ａにおいて記述した活性測定法を用いて測定した、本発明により産生させたＰＥＧ処理アルギナーゼのｉｎ ｖｉｖｏにおける活性を示す。図２２は、ＰＥＧ処理アルギナーゼの第１の半減期と第２の半減期の算出に用いたプロットである。図２３は、様々な用量のＰＥＧ処理組換えヒトアルギナーゼ（５００Ｉ．Ｕ．、１０００Ｉ．Ｕ．、１５００Ｉ．Ｕ．及び３０００Ｉ．Ｕ．）を腹腔内投与した４群の実験ラットにおけるアルギニン欠乏状態を比較したものである。図２４は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞移植により誘導した腫瘍を有する２群のヌードマウス間の生存率、平均腫瘍サイズ及び腫瘍成長率の比較を示す。このうち１つの群には、５００Ｉ．Ｕ．の用量のアルギナーゼを腹腔内投与し、もう１つのコントロール群にはアルギナーゼ投与を行わなかった。図２５Ａ及び２５Ｂは、ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞移植により誘導した腫瘍を有する２群のヌードマウス間の、平均腫瘍サイズ及び平均腫瘍質量の比較を示す。このうち１つの群には、５００Ｉ．Ｕ．の用量のアルギナーゼを腹腔内投与し、もう１つのコントロール群にはアルギナーゼ投与を行わなかった。図２５Ａ及び２５Ｂは、ＰＬＣ／ＰＲＦ５細胞移植により誘導した腫瘍を有する２群のヌードマウス間の、平均腫瘍サイズ及び平均腫瘍質量の比較を示す。このうち１つの群には、５００Ｉ．Ｕ．の用量のアルギナーゼを腹腔内投与し、もう１つのコントロール群にはアルギナーゼ投与を行わなかった。図２６Ａ及び２６Ｂは、ＨｕＨ−７細胞移植により誘導した腫瘍を有する２群のヌードマウス間の、平均腫瘍サイズ及び平均腫瘍質量の比較を示す。このうち１つの群には、５００Ｉ．Ｕ．の用量のアルギナーゼを腹腔内投与し、もう１つのコントロール群にはアルギナーゼ投与を行わなかった。図２７は、ＭＣＦ−７細胞移植により誘導した腫瘍を有する２群のヌードマウス間の平均腫瘍サイズの比較を示す。このうち１つの群には、５００Ｉ．Ｕ．の用量のアルギナーゼを腹腔内投与し、もう１つのコントロール群にはアルギナーゼ投与を行わなかった。図２８及び図２９は、実施例１２で説明する治療を実施中の患者体のアルギニン及びＣＥＡのインビボ濃度をそれぞれ示す。図２８及び図２９は、実施例１２で説明する治療を実施中の患者体のアルギニン及びＣＥＡのインビボ濃度をそれぞれ示す。発明の詳細な説明 本明細書で使用する「ＰＥＧ処理アルギナーゼ」なる語は、ＰＥＧ処理により修飾されており、酵素安定性が向上され、免疫反応を最小限に抑えた本発明のアルギナーゼＩを指す。 本明細書で使用する「実質的に同様」なる語は、ＤＮＡのヌクレオチド配列、ＲＮＡのリボヌクレオチド配列、又はタンパク質のアミノ酸配列のうち何れについて使用される場合にも、本明細書に開示した実際の配列との違いがわずかであり、重大な変異がない配列を示す。実質的に同様である配列を有する種は、開示した配列と均等であると見なされ、これらは付記された特許請求の範囲に属する。この点において、「わずかであり、重大でない変異」とは、本明細書中に開示及び／又は請求したＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質と実質的に同様の配列が、本明細書中に開示及び／又は請求した配列と機能的に同等であることを意味する。機能的に同等な配列は、本明細書中に開示され、特許請求の範囲に記載されている核酸及びアミノ酸組成と、実質的に同様に機能して実質的に同様の組成を産生する。特に、機能的に同等なＤＮＡは、本明細書中に開示したタンパク質と同様のタンパク質、又は、非極性残基の他の非極性残基への置換あるいは電荷を有する残基の同じような電荷を有する残基への置換等、保存的なアミノ酸変異を有するタンパク質をコードする。これらの変化には、タンパク質の３次元構造が実質的に変化しないことが当業者により公知である変異が含まれる。「十分に高い酵素活性」とは、組換えヒトアルギナーゼの酵素比活性が少なくとも２５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇであることを意味するが、少なくとも３００−３５０Ｉ．Ｕ．／ｍｇであることが好ましく、少なくとも５００Ｉ．Ｕ．／ｍｇであれば尚好ましい。好ましい実施形態において、前記アルギナーゼの比活性は、５００−６００Ｉ．Ｕ．／ｍｇである。「安定性」なる語は、本アルギナーゼのｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性を指す。より好ましくは、安定性とはｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性を指す。酵素活性低下率は、単離及び精製組換えヒトアルギナーゼの血漿中の安定性と反比例する。このようなヒトアルギナーゼの血漿中における半減期を算出する。 本明細書中で使用する場合、「適切なアルギニン欠乏状態」（ＡＡＤ）なる語は、ｉｎ ｖｉｖｏのアルギニン濃度が１０μＭ以下であることを意味する。「疾患」なる語は、肝臓疾患及び癌を含むが、これらに限定されない、あらゆる病理学的状態を意味する。 本明細書中で使用する場合、「半減期（１／２−ｌｉｆｅ）」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血漿中のアルギナーゼ濃度が半分に減少するのに必要な時間を意味する。２００１年の初め、本発明の発明者の１人により、肝細胞癌（ＨＣＣ）が自然に一過性に縮小する現象が３例観察された。３人の患者全てのケースで腹腔内出血を伴いＨＣＣが自然に破裂した。そのうちの１例では、血漿アルギニンが３μＭに、腹水のアルギニン濃度が７μＭに低下していた。これらの患者全員において、肝臓の病巣が破裂した後、薬剤を用いた治療を行わないにもかかわらず、肝臓腫瘍が自然に縮小しα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が正常になった。ある患者では、ＨＣＣの縮小が６ヶ月にわたり継続した。本発明によると、このような縮小が継続したのは、肝臓の破裂により腹腔内に自然に持続的に内因性のアルギナーゼが放出されたことによるアルギニン欠乏が起こったからであると考えられる。従って、本発明者らは、アルギニン欠乏状態を持続することが、ＨＣＣ縮小を誘導する原因となる要素であると推論した。 次に、本発明の発明者らは、経肝動脈塞栓後に内因性肝臓アルギナーゼが肝臓から放出され全身的なアルギニン欠乏を引き起こしうることを示すために一連の実験を計画した。これは現在、本明細書とともに参考文献として援用される米国仮特許出願番号６０／３５１８１６として出願されている。本発明者が計画した実験において、切除不能で転移性のＨＣＣを有する患者に対して一時的な肝臓の血流欠損を引き起こすリピオドール及びゲルフォームを用いた経肝動脈塞栓後、測定可能な中程度量の内因性肝臓アルギナーゼが上記患者の全身の循環系に放出されたことが明らかとなった。高用量のインスリン注入を治療計画に取り入れ、低アミノ酸血症状態を誘導した。一連の６例のＨＣＣ治療において、４例で予想外の肝臓癌の縮小が見られたが、これは治療効果が全身的であったことを示唆している。１例では、その患者の肝臓及び肝外（腹部リンパ節肥大）疾患に対するＣＴ及びＰＥＴによる放射性診断で、完全な寛解状態が持続した。その患者のＡＦＰレベルは、３週間以内に正常値まで低下し、４ヶ月にわたりその状態が持続した。４ヶ月後のインターバルＣＴにより、肝臓及び肝外両方においてはっきりとした腫瘍がなくなったことが示された。塞栓から４週間後のＰＥＴスキャンにより、他の３例の患者全員の肝外疾患（１人は肺疾患、１人は腸間膜／後腹膜／骨、及び１人は後腹膜リンパ節肥大）が縮小したことが明らかとなった。この患者らのアルギナーゼ活性及びアルギニン濃度を試験した結果、全ての例で、２時間から２日間適切なアルギニン欠乏状態が持続していたことが分かった。実際、ＡＡＤの持続時間は、肝臓及び肝外両方の腫瘍縮小持続期間とよく相関した。 高用量のインスリン注入とともに経肝動脈塞栓術を行っていたが、本発明により、発明者らはその後、インスリン投与が必要であるのは、患者の全身で放出されるアルギナーゼ活性が不十分である可能性があるため筋肉由来のタンパク質分解により欠乏しているアルギニンを補充して治療効果が打ち消されるという事実によるものであることに着目した。本発明により、本発明者らは、治療法を改善してアルギニン欠乏療法の際にインスリン投与を行う必要性をなくすため、筋肉由来のタンパク質分解による作用を無効にするように、患者の全身においてアルギナーゼが十分に高い活性を有する状態を実現した。従って、本発明により、本発明者らは、十分に酵素活性が高く安定で、高用量のインスリンを投与せずに患者の体内で１０μＭ以下という、「適切なアルギニン欠乏状態」（以下「ＡＤＤ」と言う）を維持するアルギナーゼ酵素を産生させることについて説明する。 従って、内因性のアルギナーゼを補強することに加え、本発明による高い安定性及び活性を有するアルギナーゼにより、患者に望ましくない副作用を与えるタンパク質分解抑制剤を投与せずにＡＡＤを得られるというさらなる利点を提供する。 全身的なアルギニン欠乏により、一酸化窒素欠乏に関連する他の望ましくない副作用が引き起こされうる。これらには、血管内皮におけるＮＯの血管拡張効果が欠如することによる高血圧、血小板凝集及び、ＮＯ欠如及び一時的な細胞分裂停止に関連する初期の凝固因子欠乏に続いて２次的に起こる血小板減少症が含まれる。しかし、本発明者は、一酸化窒素ノックアウトマウスにおいて、その動物が高血圧ではなく、血小板数は正常で、正常な平均寿命を有していることを認識している。つまり、本発明の別の局面により、及び血小板減少症の患者において、血小板数が５０，０００ｘ１０９を大幅に下回らない限り、顕著な出血傾向は見られない。 次の詳細な実施例により、本発明による、高い安定性及び活性を有するアルギナーゼの産生及び使用方法を教示する。実施例１では、ヒトアルギナーゼＩ遺伝子を含有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＬＬＣ１０１の組換え株の構築を説明する。この実施例の後、組換えＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓの発酵に関する２つの実施例が続く。組換えＬＬＣ１０１細胞の最初の発酵実験では、 バッチ発酵及びフェドバッチ発酵を２Ｌの発酵容器で行った。バッチ条件下では、細胞密度が十分に高くならないことが分かった。本発明によるフェドバッチ条件下で行った場合のみ、細胞密度が１０ＯＤ（光学密度）以上に上昇した。これらの実験及び結果を実施例２Ａ及び２Ｂに示す。２種類の発酵方法の比較を実施例３に示す。従って、単離及び精製組換えヒトアルギナーゼを産生するためにフェドバッチ発酵操作を選択した。フェドバッチ発酵を１００Ｌ発酵容器にスケールアップした。その実験及び結果を実施例２Ｃに示す。 ＬＬＣ１０１株は、５０℃のヒートショックでアルギナーゼ発現を引き起こす熱感受性株である。最初に最適条件を調べる実験を行い、様々な細胞密度でヒートショック処理を施して、アルギナーゼ産生量が最大となる最適条件を確立した。実施例５及び６では、精製過程及び、異なる２種類のＯＤ（６００ｎｍにおける光学密度）、即ち１２．８及び２５でヒートショックを行った際のフェドバッチ発酵で得られた精製アルギナーゼの収率について説明する。実験データから、ヒートショックは全てＬＬＣ１０１の指数関数的増殖期に行われたが、例えば１２．８ＯＤなど、細胞密度が低い状態でヒートショックを導入した方が良い結果が得られることが示された。 ヒートショック後の回収時間を様々に変化させて、ヒートショック後のアルギナーゼ発現が最大になる条件をも最適化した。実施例４では、ヒートショック後３時間で細胞を回収し、またフェドバッチ発酵法を使用した結果を示す。 実施例５では、細胞密度１２．８ＯＤでヒートショックを行ってから６時間後のアルギナーゼ精製に関して説明する。実施例６では、細胞密度が高い（２５ＯＤ）状態でヒートショックを行ってから６時間後のアルギナーゼ精製に関して説明する。実施例７は、様々な回収及び精製条件下でのアルギナーゼ収率を比較するデータ比較である。これらのデータでは、細胞密度が低い、１２．８ＯＤにおいてヒートショックを行ってから６時間後に細胞を回収した場合にアルギナーゼ収率が高く、１６２ｍｇ／Ｌとなったことが示されている。アルギナーゼを修飾して安定性を向上させた。実施例８Ａでは、モル比が１：１４０（アルギナーゼ：ＰＥＧ）となるようにして、架橋剤として塩化シアヌル（ｃｃ）を用いた、アルギナーゼに対するＰＥＧ処理のプロトコールの１例を示す。実施例８Ｂでは、本酵素との反応混合液へ添加する架橋剤の割合が大幅に低い、様々なＰＥＧ処理プロトコールについて説明する。ｃｃ及びプロピオン酸スクシンイミド（ＳＰＡ）両方を、架橋剤として試験した。この実験結果から、実施例８Ｂで説明したＳＰＡを用いた方法により、実施例９及び１０で述べるように、ＰＥＧ処理アルギナーゼの半減期が３日になり、特異的活性がおよそ２２５Ｉ．Ｕ．／ｍｇとなったことが示される。実施例８Ｃでは、特異的活性がおよそ５９２Ｉ．Ｕ．／ｍｇである、高活性のＰＥＧ処理アルギナーゼ調製方法を説明する。 上記の方法を用いて、高い安定性及び活性を有するアルギナーゼが産生された。このアルギナーゼは十分に高い活性及び安定性を有し、全身のアルギナーゼが筋肉によるアルギニンの補充を速やかに打ち消すため、多量のタンパク質分解阻害剤を使用せずに患者の治療を行うことができる。従って、体外から高用量のインスリンを投与せずに、１０μＭ以下という適切なアルギニン欠乏状態を実現することができる。本発明によるアルギナーゼを用いる様々な治療プロトコールを実施例１１で説明する。実施例１２では、アルギナーゼを投与した患者の臨床データについて説明して、実施礼１１で示した治療プロトコールをさらに裏付ける。 実施例１３から１４では、本発明によるアルギナーゼの用量反応及び安全な用量を調べることを目的とした、ラットを用いた２つの動物実験について述べる。 実施例１５から１８では、修飾アルギナーゼの投与により誘導したアルギニン欠乏状態に対する、様々なヒト癌細胞株により誘導した腫瘍の反応を調べることを目的とした、ヌードマウスを用いた別の一連の動物実験について述べる。 先に言及した全ての参考文献は、本明細書中に参考文献として援用する。本発明の実施を以下に掲げる非限定的な実施例において例示する。 本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ規定されるものであり、その内容又は実施例の範囲によって限定されるものではない。[実施例１] 組換え株ＬＬＣ１０１の構築（ａ）ヒトアルギナーゼＩをコードする遺伝子の単離 ヒトアルギナーゼＩ遺伝子配列が１９８７年に公表され（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｙら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，４１２−４１５）、それをもとにプライマーがデザインされた。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を行い、ヒトアルギナーゼをコードする遺伝子を単離した。プライマー、Ａｒｇ１（５‘−ＣＣＡＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡ−３’）（配列番号：５）及びＡｒｇ２（５‘−ＣＣＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣ−３’）（配列番号：６）をそれぞれＧｅｎｓｅｔ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｔｅ Ｌｔｄ．より購入した。両プライマーとも、融解温度（Ｔｍ）は同じ７２℃である。プライマーＡｒｇ１には、ＮｄｅＩ制限酵素認識部位（下線）が含まれており、プライマーＡｒｇ２には、ＸｂａＩ制限酵素認識部位（下線）が含まれている。これらの２種類のプライマー（最終濃度は、各３００ｎＭ）を、５μｌのヒト肝臓５‘−ｓｔｒｅｔｃｈ ｐｌｕｓ ｃＤＮＡ ライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が入った０．２ｍｌマイクロチューブに添加した。ＤＮＡポリメラーゼ（２．６ユニット、０．７５μｌ）と、４種類のデオキシリボヌクレオチド（各４μｌ、最終濃度は各２００μＭ）と、反応バッファー（５μｌ）とｄＨ２Ｏ （１７．７５μｌ）とをさらに添加した。ＰＣＲは、ＰＣＲ前反応（９４℃、５分間）、２５回のＰＣＲサイクル（９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間）、ＰＣＲ後反応（７２℃で７分間）という条件で行った。０．８％アガロースゲルでＰＣＲ産物（５μｌ）を分析し、１本の１．４ｋｂのバンドがあることを確認した。このＤＮＡ断片には、アルギナーゼをコードする遺伝子が含まれる。 （ｂ）プラスミドｐＳＧ１１１３の単離 プラスミドｐＳＧ７０３(Thornewell, S. J. ら、1993, Gene, 133, 47-53)の派生物であるプラスミドｐＳＧ１１１３を、Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Promega)を使用して製造元のマニュアルに従い、ｐＳＧ１１１３を有するＥ．ｃｏｌｉ、ＤＨ５αクローンから単離した。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉでのみ複製しB. subtilis中では複製しないプラスミドで、アルギナーゼ遺伝子のサブクローニング用ベクターとして使用した。 （ｃ）プラスミドｐＡＢ１０１を構築するための、１．４ｋｂのＰＣＲ産物のプラスミドｐＳＧ１１１３へのサブクローニング 上記方法により調製したＰＣＲ産物を、６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴからなる反応液中において制限エンドヌクレアーゼであるＮｄｅＩ及びＸｂａＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、３７℃にて、１．５時間処理を行った。処理終了後、反応混合液に対してアガロースゲル（０．８％）電気泳動を行い、Qiaex II Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて１．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。これとは別に、同じ制限エンドヌクレアーゼ及び同様の方法でプラスミドｐＳＧ１１１３を処理した。処理終了後、反応混合液に対してアガロースゲル（０．８％）電気泳動を行い、３．５ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、このＤＮＡ断片を上記の１．４ｋｂのＤＮＡ断片に連結させた。一般的なカルシウム法(Sambrook, J. ら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)によるＥ．ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅの形質転換にこのライゲーション混合液を使用し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する栄養寒天プレートに播種した。制限酵素反応により、適切なインサートを含有するプラスミドが入ったコロニーのスクリーニングを行った。構築したプラスミドをｐＡＢ１０１（図１）と名付けた。ＯＲＩは、Ｅ．ｃｏｌｉ のｏｒｉ領域、ｂｌａはアンピシリン耐性マーカー遺伝子である。プライマーＡｒｇ１（配列番号：５）、Ａｒｇ２（配列番号：６）及びＡｒｇ６（５‘−ＣＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＣＣＣ−３’）（配列番号：７）を用いてＤＮＡ配列決定を行い、アルギナーゼをコードする遺伝子と同一であることを確認した（図２）。 （ｄ）新規組換えB. subtilis プロファージ株、ＬＬＣ１０１の構築 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Promega)を使用して、プラスミド、ｐＡＢ１０１を有するクローンからｐＡＢ１０１を抽出して精製した。プラスミド、ｐＡＢ１０１（図１）において、０．６ｋｂのＭｕｎＩ−ＮｄｅＩφ１０５ファージＤＮＡ 断片（「φ１０５」として表示）及びｃａｔ遺伝子（図１及び図３）で、アルギナーゼ遺伝子（ａｒｇ）の両脇を挟んだ。このプラスミドを用いて、公知の方法(Anagnostopoulos C. 及びSPIZIZEN J., 1961, J. Bacteriol. 81, 741-746)によりコンピーテントB. subtilis １Ａ３０４（φ１０５ＭＵ３３１）の形質転換を行った。B. subtilis株、１Ａ３０４（φ１０５ＭＵ３３１）をJ. Errington(Thornewell, S. ら、1993, Gene 133, 47-53)より入手した。Thornewell, S. ら、1993, Gene 133, 47-53及びBaillie, L. W. J. ら、1998、FEMS Microbiol. Letters 163, 43-47（本明細書中に参考文献としてその全体を援用する）に従って、この株が作製された。プラスミドｐＡＢ１０１（図３で直線として示す）を、B. subtilis株、１Ａ３０４（φ１０５ＭＵ３３１）に形質転換し、ＣｍＲマーカーにより選択して、形質転換体をＥｒＳ表現型に関してスクリーニングを行った。この形質転換体は図３に示すような二重交差から生じたものと考えられ、強力なファージプロモーターによりアルギナーゼ遺伝子（ａｒｇ）転写が調節されている(Leung及びErington, 1995, Gene 154, 1-6)。太線は、プロファージゲノムを表し、破線はB. subtilisの染色体を、細線はプラスミドＤＮＡを表す。図３において、転写及び翻訳方向を示す影付きの矢印として遺伝子を示す。相同領域は、縦方向の破線で区切り、相同組換えが起こっている位置を「Ｘ」で表す。 クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレートに６００μｌの形質転換細胞を播種して、５２個のクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）コロニーを得た。これらのコロニーのうち１０個を無作為に選択して、エリスロマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレートにストリークしところ、これらのコロニーうち１個は増殖しなかったが、これはそのコロニーがエリスロマイシン感受性（ＥｒＳ）であったことを意味する。クロラムフェニコール耐性であるがエリスロマイシン感受性であるこのコロニーを分離して、ＬＬＣ１０１と名付けた。この新しく構築したプロファージ株の染色体において、エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍＣ）を、相同組換えの際に二重交差によりアルギナーゼ遺伝子（ａｒｇ）に置き換えた。０．６ｋｂのＭｕｎＩ−ＮｄｅＩφ１０５ファージＤＮＡ断片（「φ１０５」として表示）及びｃａｔ遺伝子が相同配列を有しており、これにより組換えが起こった。このようにして、B. subtilis １Ａ３０４（φ１０５ＭＵ３３１）のプロファージＤＮＡの発現部位にアルギナーゼ遺伝子を入れ、アルギナーゼ遺伝子を強力な温度感受性（誘導性）のプロモーター(Leung, Y. C. 及びErrington, J., 1995, Gene 154, 1-6)の制御下に置いた。 Ｂ． ＳＵＢＴＩＬＩＳ ＬＬＣ１０１細胞の発酵[実施例２Ａ] ２リットルの発酵容器でのバッチ発酵 ５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加した栄養寒天（牛肉抽出物 １ｇ／Ｌ、ペプトン １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、及び寒天 ２０ｇ／Ｌ）プレートで B. subtilis ＬＬＣ１０１株を維持する。バッチ及びフェドバッチ発酵用の接種試料を調製するために、グルコース ５ｇ／Ｌ、トリプトン １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物 ３ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム １ｇ／Ｌ、ＫＨ２Ｐ０４ １．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １．５ｇ／Ｌ、及び（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ／Ｌを含有する８０ｍＬの発酵培地が入った２本の１Ｌフラスコに、新しく調製した栄養寒天プレートから上記株の数個のコロニーを移した。２５０ｒ．ｐ．ｍ．のオービタルシェーカー上で、３７℃及びｐＨ７．０にて、細菌の細胞培養を行った。ＯＤ６００ｎｍが５．５−６．０になった時点（培養時間はおよそ９−１１時間）で培養を終了した。次に、１４４０ｍｌの発酵培地（グルコース ５ｇ／Ｌ、トリプトン １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物 ３ｇ／Ｌ、クエン酸ナトリウム １ｇ／Ｌ、ＫＨ２Ｐ０４ １．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １．５ｇ／Ｌ、及び（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３ｇ／Ｌ）が入った２−Ｌの発酵容器に、１６０−ｍＬの培養液を添加した。温度３７℃でバッチ発酵を行った。水酸化ナトリウム及び塩酸を添加してｐＨを７．０に調整した。溶存酸素濃度が２０％の飽和度になるように撹拌速度を調整した。培養密度（ＯＤ６００ｎｍ）がおよそ３．０になった時点（３．２５時間）で、ヒートショックを行った。ヒートショックの間、発酵容器の温度を３７℃から５０℃に上げ、その後すぐに３７℃に下げた。加熱と冷却のサイクルは１サイクルで０．５時間を要した。培養液のＯＤは、ヒートショックからおよそ３．５時間後に最大値（およそ６．４）に到達した。ヒートショックから６時間後に、アルギナーゼを分離及び精製するために細胞を回収した。ヒートショックから６時間後の発酵培地においておよそ３０ｍｇ／Ｌの活性ヒトアルギナーゼを上記株が産生した。発酵のタイムコースは図４Ａでプロットされている。温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素値等のパラメーターの変化を示すこのバッチの時間変化プロットは図５Ａで示す。[実施例２Ｂ] ２リットルの発酵容器でのフェドバッチ発酵 ３７℃、ｐＨ７．０、溶存酸素２０％飽和度にてフェドバッチ発酵を行った。実施例２Ａで説明したバッチ発酵と同様の方法で植菌を行った。まず、増殖培地は実施例２Ａで説明したバッチ発酵の場合と全く同じであった。栄養源供給培地には、２００ｇ／Ｌ グルコース、２．５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｇ／Ｌ トリプトン、７．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、及び３．７５ｇ／Ｌ ＫＨ２Ｐ０４が含有されていた。ｐＨ−スタット制御方式で培地供給を調節した。この方式において、グルコース減少により起こるｐＨ上昇を補正するように培地供給を調整した。発酵時間４．５時間でグルコース濃度が非常に低いレベルまで減少した際、この制御方式を最初に実行した。ｐＨ＞７．１になった際に、４ｍＬの栄養源供給培地を発酵容器に添加した。グルコース添加後すぐに、ｐＨ値は速やかに７．１以下に低下する。およそ１０分後、添加したグルコースが完全に細菌細胞に消化された時にｐＨ値が７．１以上に上昇するが、この時にさらに４ｍＬの栄養源供給培地を発酵容器に添加する。培養密度（ＯＤ６００ｎｍ）が１２．０−１３．０になった時点（５−６時間）で、ヒートショックを行った。ヒートショックの間、発酵容器の温度を３７℃から５０℃に上げ、その後すぐに３７℃に下げた。加熱と冷却のサイクルは１サイクルで０．５時間であった。ヒートショックから３時間及び６時間後に、アルギナーゼを分離及び精製するために細胞を回収した。ヒートショックから６時間後の発酵培地において、少なくともおよそ１６２ｍｇ／Ｌの活性ヒトアルギナーゼを上記株が産生した。発酵のタイムコースは図４Ｂでプロットしている。温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素値等のパラメーターの変化を示すこのフェドバッチ発酵の時間変化プロットは図５Ｂで示す。[実施例２Ｃ] １００−リットルの発酵容器におけるフェドバッチ発酵 フェドバッチ発酵を１００Ｌの発酵容器にスケールアップした。３７℃、ｐＨ７．０、溶存酸素２０％飽和度にて発酵を行った。１０％の接種材料を用いた。まず、増殖培地は実施例２Ａで説明したバッチ発酵の場合と全く同じであった。栄養源供給培地には、３００ｇ／Ｌ グルコース、３．７５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、７５ｇ／Ｌ トリプトン、１１．２５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、及び５．６２５ｇ／Ｌ ＫＨ２Ｐ０４が含有されていた。実施例２Ｂで説明したフェドバッチ発酵で用いた方法と同様のｐＨ−スタット制御方式で培地供給を調節した。培養密度（ＯＤ６００ｎｍ）が１１．５−１２．５になった時点（およそ７．５時間）で、ヒートショックを行った。ヒートショックの間、発酵容器の温度を３７℃から５０℃に上げ、７秒間５０℃のまま維持し、すぐに３７℃まで冷却した。加熱と冷却のサイクルは１サイクルで０．５時間であった。ヒートショックから２時間及び４時間後に、アルギナーゼを分離及び精製するために細胞を回収した。ヒートショックから２時間及び４時間後の発酵培地中でそれぞれ、少なくともおよそ７４ｍｇ及び１２４ｍｇ／Ｌの活性ヒトアルギナーゼを上記株が産生した。これらのデータから、１００−Ｌの発酵容器においては、ヒートショックから４時間後に回収した細胞の方がヒートショックから２時間後に回収した細胞よりもアルギナーゼ産生量が多いことが示される。[実施例３] バッチ発酵とフェドバッチ発酵との比較 下の表１は、バッチ及びフェドバッチ発酵の結果を比較したものである。この比較から、培養液ＯＤ、アルギナーゼ収率および産生能の点で、フェドバッチ発酵の方が顕著に優れていることが明らかである。[実施例４] フェドバッチ発酵後の低細胞密度におけるヒートショックから３時間後に回収したアルギナーゼの精製 実施例２Ｂで説明したようにして、２−Ｌの発酵容器におけるフェドバッチ発酵を行った。フェドバッチ培養の細胞密度を３０分又は６０分間隔でモニターして、発酵開始から５．５時間後（培養液のＯＤが１２．８に到達した時）に培養温度を５０℃に上げた（図４Ｂ及び図５Ｂ参照）。 ヒートショックから３時間後に回収した細胞培養液（４７０ｍｌ）を、５，０００ｒｐｍで２０分間、４℃にて遠心し、細胞を沈殿させた。細胞の湿重量は１５．１ｇであった。培養上清液を捨て、細胞沈殿物を−８０℃で保存した。この細胞はこの温度で数日安定である。細胞内タンパク質を抽出するために、１４０ｍｌの可溶化バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＳＯ４、ライソザイム（７５μｇ／ｍｌ）］で細胞沈殿物を再懸濁した。３０℃にて１５分間インキュベーションを行った後、Soniprep 150 Apparatus(MSE)を用いて、各回持続時間１０秒、２分間隔で、混合液に対して８回（合計時間は８０秒）、超音波破砕を行った。およそ５００ユニットのデオキシリボヌクレアーゼＩ(Sigma D4527)を添加し、混合液を３７℃にて１０分間インキュベーションして染色体ＤＮＡを消化した。４℃にて１０，０００ｒｐｍ、２０分間遠心を行った後、未精製タンパク質抽出物を含有する上清におけるアルギナーゼ活性の有無を調べ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685)で分析した。 ５ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラム(Pharmacia)を、５カラム体積分の０．１Ｍ ＮｉＣｌ２（ｄＨ２Ｏに溶解）で平衡化した。未精製タンパク質抽出液（１４０ ｍｌ）をカラムに添加した。次の条件下で、流速５ｍｌ／分で１５カラム体積分を流し、直線的な勾配（０−１００％）により溶出を行った。条件は、バッファーＡ＝開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］、バッファーＢ＝０．５Ｍ イミダゾール含有開始バッファーであった。溶出プロファイルを図６Ａに、タンパク質ゲルを図６Ｂに示す。分画１３−２０を集め（１６ｍｌ）、開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］で１０倍に希釈した。この試料を第２の５ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラム(Pharmacia)に添加し、上記手順を繰り返した。溶出プロファイルを図７Ａに、タンパク質ゲルを図７Ｂに示す。アルギナーゼを含有する、分画１２−３０を集め（３８ｍｌ）、５０ｍｌのＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム(Pharmacia)を用いて、次の条件下で脱塩した。条件とは、流速＝１０ｍｌ／分、バッファー＝１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、及び、溶出に用いるバッファー量＝１．５カラム体積であった。ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８−２５４）でタンパク質濃度を測定した。４７０ｍｌの細胞培養液から合計５６．３２ｍｇのアルギナーゼを精製した。精製アルギナーゼの収率は、１１９．８ｍｇ／ｌ（細胞培養）、又は３．７３ｍｇ／ｇ（細胞湿重量）と推定された。[実施例５] フェドバッチ発酵後の低細胞密度におけるヒートショックから６時間後に回収したアルギナーゼの精製 ２Ｌの発酵容器によるフェドバッチ発酵は、実施例４で説明したようにして行った。ヒートショックから６時間後（ＯＤ１２．８）に回収した細胞培養液（６５０ｍｌ）を、５，０００ｒｐｍで２０分間、４℃にて遠心し、細胞を沈殿させた。細胞の湿重量は２４ｇであった。培養上清液を捨て、細胞沈殿物を−８０℃で保存した。この細胞はこの温度で数日安定である。細胞内タンパク質を抽出するために、１４０ｍｌの可溶化バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＳＯ４、ライソザイム（７５μｇ／ｍｌ）］で細胞沈殿物を再懸濁した。３０℃にて１５分間インキュベーションを行った後、Soniprep 150 Apparatus(MSE)を用いて、各回持続時間１０秒、２分間隔で、混合液に対して８回（合計時間は８０秒）、超音波破砕を行った。およそ５００ユニットのデオキシリボヌクレアーゼＩ(Sigma D4527)を添加し、混合液を３７℃にて１０分間インキュベーションして染色体ＤＮＡを消化した。４℃にて１０，０００ｒｐｍ、２０分間遠心を行った後、未精製タンパク質抽出物を含有する上清におけるアルギナーゼ活性の有無を調べ、SDS-PAGE(Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685)で分析した。 ５ｍｌのＨｉＴｒａｐ キレートカラム(Pharmacia)を、５カラム体積分の０．１Ｍ ＮｉＣｌ２（ｄＨ２Ｏに溶解）で平衡化した。未精製タンパク質抽出液（１４０ ｍｌ）をカラムに添加した。次の条件下で、流速５ｍｌ／分で１５カラム体積分を流し、直線的な勾配（０−１００％）により溶出を行った。条件は、バッファーＡ＝開始バッファー［０．０２ Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］、バッファーＢ＝０．５Ｍ イミダゾール含有開始バッファーであった。溶出プロファイルを図８Ａに、タンパク質ゲルを図８Ｂに示す。分画１３−２４を集め（２４ｍｌ）、開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］で１０倍に希釈した。この試料を第２の５ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラム(Pharmacia)に添加し、上記手順を繰り返した。溶出プロファイルを図９Ａに、タンパク質ゲルを図９Ｂに示す。アルギナーゼを含有する分画１２−２４を集め（２６ｍｌ）、５０ｍｌのＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム(Pharmacia)を用いて、次の条件下で脱塩した。条件とは、流速＝１０ｍｌ／分、バッファー＝１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、及び溶出に用いるバッファー量＝１．５カラム体積であった。ブラッドフォード法(Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)でタンパク質濃度を測定した。６５０ｍｌの細胞培養液から合計８５．７３ｍｇのアルギナーゼを精製した。精製アルギナーゼの収率は、１３２ｍｇ／ｌ（細胞培養）、又は３．５７ｍｇ／ｇ（細胞湿重量）と推定された。[実施例６] フェドバッチ 発酵後の高細胞密度におけるヒートショックから６時間後に回収したアルギナーゼの精製 この特別なフェドバッチ発酵は、８時間の時点（培養密度（ＯＤ６００ｎｍ）がおよそ２５）でヒートショックを行うことを除き、上記の実施例と同様の手順で行った。ヒートショックの間、発酵容器の温度を３７℃から５０℃に上げ、その後すぐに３７℃に下げた。加熱と冷却のサイクルは１サイクルで０．５時間であった。ヒートショックから６時間後に、アルギナーゼを分離及び精製するために細胞培養液の一部（７６０ｍｌ）を回収した。この発酵での細菌細胞増殖のタイムコースは図１０でプロットしている。温度、撹拌速度、ｐＨ及び溶存酸素値等のパラメーターの変化を示すこのフェドバッチ発酵の時間変化プロットは図１１で示す。 ヒートショックから６時間後に回収した細胞培養液（７６０ｍｌ）を５，０００ｒｐｍで２０分間、４℃にて遠心し、細胞を沈殿させた。細胞の湿重量は３２ｇであった。培養上清液を捨て、細胞沈殿物を−８０℃で保存した。この細胞はこの温度で数日安定である。細胞内タンパク質を抽出するために、２８０ｍｌの可溶化バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＳＯ４、ライソザイム（７５μｇ／ｍｌ）］で細胞沈殿物を再懸濁した。３０℃にて１５分間インキュベーションを行った後、Soniprep 150 Apparatus(MSE)を用いて、各回持続時間１０秒、２分間隔で、混合液に対して８回（合計時間は８０秒）、超音波破砕を行った。およそ５００ユニットのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ｄ４５２７）を添加し、混合液を３７℃にて１０分間インキュベーションして染色体ＤＮＡを消化した。４℃にて１０，０００ｒｐｍ、２０分間遠心を行った後、未精製タンパク質抽出物を含有する上清におけるアルギナーゼ活性の有無を調べ、SDS-PAGE(Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685)で分析した。 ５ｍｌのＨｉＴｒａｐ キレートカラム(Pharmacia)を、５カラム体積分の０．１Ｍ ＮｉＣｌ２（ｄＨ２Ｏに溶解）で平衡化した。未精製タンパク質抽出液（２８０ｍｌ）をカラムに添加した。次の条件下で、流速５ｍｌ／分で１５カラム体積分を流し、直線的な勾配（０−１００％）により溶出を行った。条件は、バッファーＡ＝開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］、バッファーＢ＝０．５Ｍ イミダゾール含有開始バッファーであった。溶出プロファイルを図１２Ａに、タンパク質ゲルを図１２Ｂに示す。分画１７−３１を集め（３０ｍｌ）、開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］で１０倍に希釈した。この試料を第２の５ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラム(Pharmacia)に添加し、上記手順を繰り返した。溶出プロファイルを図１３Ａに、タンパク質ゲルを図１３Ｂに示す。アルギナーゼを含有する分画１０−２０を集め（２２ｍｌ）、５０ｍｌのＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム(Pharmacia)を用いて、次の条件下で脱塩した。条件とは、流速＝１０ｍｌ／分、バッファー＝１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、及び溶出に用いるバッファー量＝１．５カラム体積であった。次に、その試料を１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム(Pharmacia)に添加した。次の条件で溶出を行った。条件とは、流速＝１ｍｌ／分、バッファー＝１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、バッファーＢ＝１Ｍ ＮＡＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、直線的勾配（０−１００％）、溶出に用いるバッファー量＝３０カラム体積であった。溶出プロファイルを図１４Ａに、タンパク質ゲルを図１４Ｂに示す。分画Ａ１２−Ｂ７を集め（７ｍｌ）、開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］で１０倍に希釈した。この試料を第２の１ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム(Pharmacia)に添加し、溶出を段階的勾配により行ったこと以外は上記手順を繰り返した。溶出プロファイルを図１５Ａに、タンパク質ゲルを図１５Ｂに示す。分画Ａ７−Ｂ１２を集め（７ｍｌ）、上記で用いた５０ｍｌのＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム(Pharmacia)を用いて脱塩した。ブラッドフォード法(Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)でタンパク質濃度を測定した。７６０ｍｌの細胞培養液から合計４１．６１ｍｇのアルギナーゼを精製した。精製アルギナーゼの収率は、５５．５ｍｇ／ｌ（細胞培養）、又は１．３ｍｇ／ｇ（細胞湿重量）と推定された。[実施例７] 様々な回収及び精製条件によるアルギナーゼ収率の比較 下の表２で、様々な回収及び精製条件下で産生されたアルギナーゼの収率を比較する。これらのデータは、１２．８という低い細胞密度におけるヒートショックから６時間後に回収する条件の場合、精製後、１３２ｍｇ／Ｌという高いアルギナーゼ回収率が得られることを示す。[実施例８Ａ] 塩化シアヌル（ＣＣ）で活性化したメトキシポリエチレングリコールを用いたＰＥＧ処理酵素の調製 ５０ｍｇのアルギナーゼを２０ｍｌのＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で溶解して、最終濃度を２．５ｍｇ／ｍｌとした。６０℃で１０分間、アルギナーゼの熱活性化を行った。活性化後、酵素の温度を室温に戻した。塩化シアヌルで活性化した１ｇのメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＣＣ）（ＭＷ＝５０００、Ｓｉｇｍａ）を、モル比が１：１４０（アルギナーゼ：ＰＥＧ）になるように、アルギナーゼに添加した。マグネチック撹拌棒を使用して、全てのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が溶解するまで混合液を撹拌した。 全てのＰＥＧが溶解したら、ＰＥＧ−アルギナーゼ混合液のｐＨを０．１Ｎ ＮａＯＨで９．０に調整し、さらにＮａＯＨを添加してその後３０分間、９．０に維持した。１ＮのＨＣｌを添加してｐＨを７．２に戻るように調整し、ＰＥＧ処理を停止させた。 Hemoflow F40S キャピラリーダイアライザー(Fresenius Medical Car, Germany)を用いて、２−３ＬのＰＢＳバッファー溶液に対して、ＰＥＧ処理アルギナーゼを４℃、ｐＨ７．４にて透析して過剰なＰＥＧを除去した。透析後、ＰＥＧ処理アルギナーゼを回収し、最終濃度を再調整した。 ＰＥＧ処理アルギナーゼを０．２μｍのフィルターを用いてろ過して滅菌容器に移し、４℃にて保存した。ヒト患者におけるこの酵素の半減期を測定したところ、およそ６時間であった（図２１参照）。[実施例８Ｂ] 低ＰＥＧ比でＣＣ又はＳＰＡのいずれかを使用する条件下での、Ｂ．ＳＵＢＴＩＬＩＳ発現アルギナーゼの精製 ＰＥＧ処理は、最初にＤａｖｉｓ，Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及び共同研究者(Davis, F. F. ら、1978, Enzyme Eng. 4, 169-173)により１９７０年代に開発された。薬物剤形の修飾と比べ、治療用タンパク質に対するポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ部分の化学的付加（「ＰＥＧ」処理として知られている過程）は、重要な薬効を強化しうる新しいアプローチと言える(Harris, J. M. ら、2001, Clin. pharmacokinet. 40, 539-551)。 １９７９年に、Ｓａｖｏｃａらは、２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル）を架橋剤として用いて、５，０００ダルトンのメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を共有結合でウシ肝臓アルギナーゼに結合させた(Savoca, K. Vら、1979, Biochimica et Biophysica Acta 578, 47-53)。結合物（ＰＥＧ−アルギナーゼ）は、元の酵素活性の６５％に相当する活性しか示さなかった。マウスにおけるＰＥＧ−アルギナーゼの血液循環寿命がウシアルギナーゼの寿命より延長されたと、彼らは報告した。注入したウシアルギナーゼの半減期は１時間に満たないが、一方ＰＥＧ−酵素の半減期は１２時間であった。これらのデータからまた、ＰＥＧで修飾されたウシアルギナーゼが、マウスで試験を行った際に免疫原性及び抗原性の両方を示さなかったことも示された。 組換えヒトアルギナーゼ（１．０６８ｍｇ）を１２５ｍＭのホウ酸バッファー溶液（ｐＨ８．３）に、氷中又は室温で溶解した。活性化ｍＰＥＧ、ｍＰＥＧプロピオン酸スクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ＭＷ ５，０００、Shearwater Corporation）又は塩化シアヌルで活性化したｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＣＣ、ＭＷ ５，０００、Ｓｉｇｍａ）、を、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０又は１：２０になるように上記溶液に添加した。２段階でこの操作を行った。第一段階では、半量のＰＥＧをアルギナーゼ溶液に少量ずつ添加して氷中で穏やかに３０分間混合し、推奨されるｐＨ範囲である８．０−８．５から外れないようにした。この溶液に残り半分のＰＥＧを添加して、０．５−２３時間、穏やかにさらに混合した。次に、分画分子量が１０，０００以下である透析膜を用いて、最低３回ｄＨ２Ｏを交換し、４℃にてこの混合液を透析した。ＰＥＧ−ＳＰＡ及びＭＰＥＧ−ＣＣ両方が、修飾部位としてリジンのアミノ基及びタンパク質のＮ−末端を使用する。 氷中又は室温にてｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ ５，０００）を用いて、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０になるようにしてアルギナーゼを修飾した際、反応１時間後には殆どの酵素分子が修飾された（図１６）。反応２３時間後でも試料の状態は同様であった。アルギナーゼ分子を様々な数のＰＥＧ分子と結合させて、様々な分子量の分子を生成させた。予想したように、１：２０のように低いモル比でＰＥＧ反応を行うと、ＰＥＧ修飾されないアルギナーゼの割合が高くなった（図１７）。しかし、どちらのアルギナーゼ：ＰＥＧのモル比の場合も、反応時間を延長し、氷中ではなく室温で反応を行っても、ＰＥＧ処理の進行具合に影響が見られなかった。ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ ５，０００）を用いて１：５０のモル比で１時間反応を行った場合、アルギナーゼは元の酵素活性の７２−７６％を保持した（下の表３参照）が、それはウシアルギナーゼに対して報告された値(65%、Savoca, K. V. ら、1979、Biochimica et Biophysica Acta 578, 47-53)より高かった。 アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０になるようにして、ｍＰＥＧ−ＣＣ（ＭＷ ５０００）を用いてアルギナーゼを氷中で修飾すると、反応は極めてゆっくりと進行し、ＰＥＧ処理が完了するまでに２３時間を要した（図１８Ａ）。さらに、殆どの酵素分子が非常に高分子量の狭い範囲の分子量に変換された。図１８Ａで示すように、１：２０といったより低いモル比で反応を行うと、反応の進行が著しく遅くなった。[実施例８Ｃ] 高活性ＰＥＧ処理アルギナーゼの精製 １５ＬのＢ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ のステンレス製発酵容器におけるフェドバッチ発酵を実施例４で記述したようにして行った。ＯＤ１２−１３で行ったヒートショックから４．５時間後に回収した細胞培養液（８．４Ｌ）を５，０００ｒｐｍで２０分間、４℃にて遠心して細胞を沈殿させた。培養上清液を捨て、細胞沈殿物を−８０℃で保存した。この細胞はこの温度で数日安定である。細胞内タンパク質を抽出するために、１２５０ｍｌの可溶化バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＳＯ４、ライソザイム（７５μｇ／ｍｌ）］で細胞沈殿物を再懸濁した。３０℃にて２０分間インキュベーションを行った後、その混合液をビーカーに３００ｍｌずつ分け、各ビーカーの混合液をＳｏｎｉｐｒｅｐ １５０ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（ＭＳＥ）を用いて、各回持続時間１０秒、２分間隔で１２回（合計時間は１２０秒）、超音波破砕を行った。およそ５０００ユニットのデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ Ｄ４５２７）を添加し、混合液を３７℃にて１５分間インキュベーションして染色体ＤＮＡを消化した。４℃にて９，０００ｒｐｍ、３０分間ずつ２回遠心を行った後、未精製タンパク質抽出物を含有する上清におけるアルギナーゼ活性の有無を調べ、SDS-PAGE(Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685)で分析した。 未精製タンパク質抽出液（１１９５ｍｌ）をろ過し、５９７．５ｍｌずつ２つに分注した。次に、各分注液を１３０−ｍｌのNi-NTA superflow(Qiagen)カラム(Pharmacia)に添加した。次の条件下で、流速５ｍｌ／分にて直線的な勾配（０−１００％）により溶出を行った。条件は、バッファーＡ＝開始バッファー［０．０２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ７．４）、０．５Ｍ ＮＡＣｌ］、バッファーＢ＝０．５Ｍ イミダゾール含有開始バッファーであった。純粋なアルギナーゼを含有する分画を集め、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ装置（ポリエーテル−スルホン膜、分画分子量＝８ｋＤａ）及び実験室スケールのクロスフローろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４により、３５ｍｌ／分の速度で４℃にてバッファー交換を行った。ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８−２５４）でタンパク質濃度を測定した。８．４Ｌの細胞培養液から合計７８８ｍｇのアルギナーゼを精製した。精製アルギナーゼの収率は、９４ｍｇ／ｌ（細胞培養液）と推定された。特異的活性の測定値は、５１８Ｉ．Ｕ．／ｍｇであった。 高い特異的活性を有するＰＥＧ処理アルギナーゼをＰＢＳバッファーで調製した。ＰＥＧ処理を行う前に精製アルギナーゼ（特異的活性＝５１８Ｉ．Ｕ．／ｍｇ）をＰＢＳで調製した。ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ＭＷ ５，０００（５．８２ ｇ）を、１Ｌビーカーに入った５５５ｍｌの精製アルギナーゼ（８１３．６４ｍｇ、１．４６６ｍｇ／ｍｌ）溶液にゆっくりと添加し、その後２時間４０分、室温で撹拌した（アルギナーゼ：ＰＥＧ−ＳＰＡモル比＝１：５０）。次に、Ｆ５０（Ｓ）キャピラリーダイアライザー(Fresenius Medical Care)を用いて、１５ＬのＰＢＳバッファーに対するultra-dialysisにより混合物を十分に透析して、導入されなかったＰＥＧを全て除去した。ＰＥＧ−ＳＰＡは、リジンのアミノ基及びタンパク質のＮ−末端を修飾部位として使用する。ＰＥＧ処理アルギナーゼの特異的活性の測定値は、５９２Ｉ．Ｕ．／ｍｇに及んだ。非ＰＥＧ処理アルギナーゼ及びＰＥＧ処理アルギナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１８Ｂに示す。ＰＢＳバッファー中で、１ｍｇ／ｍｌの濃度で保存した場合、アルギナーゼ活性及びタンパク質濃度の点から見て、ＰＥＧ処理アルギナーゼは、室温にて少なくとも３週間、高い安定性を示した。ＰＢＳバッファー中で、１ｍｇ／ｍｌの濃度で４℃にて保存した場合、特異的活性が低下することなく最低６ヶ月は安定である。[実施例９Ａ] 実施例８Ａで得たアルギナーゼのｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期測定 ＰＥＧ処理アルギナーゼを患者に投与した。３ｍｌの血液試料を患者から毎日採取してＥＤＴＡを添加した。血液採取用試験管は水を加えシャーベット状にした氷中で前もって４℃に冷却しｅｘ−ｖｉｖｏでの酵素反応が起こらないようにした。次に、１４０００ｒｐｍで２分間、血液をすぐにスピンダウンして赤血球を除去した。１．５ｍｌの上清（血漿）をピペットで取り新しいエッペンドルフチューブに移した。次に、血漿を３７℃にて３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、基質として１００μＭの濃度でアルギニンを添加した。３７℃にて、０、１０、３０、６０分間、酵素反応を行った。各時間間隔において、反応試料を３００μｌずつ採取して、３００μｌの１０％トリクロロ酢酸を含有する新しいエッペンドルフチューブに移し、その採取試料の反応を停止させた。試料を採取し最大速度（１４０００ｒｐｍ）で１０分間遠心した。上清をピペットで採取し０．４５μｍフィルターでろ過した。最後に、アミノ酸分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｌ８８００）で様々な時間間隔で採取した試料を分析した。その結果を図２１に示す。 実施例８Ａで説明したようにして実験２回分のＰＥＧ処理アルギナーゼを調製した。第１のＰＥＧ処理アルギナーゼを、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：１４０になるようにして調製した。第２のＰＥＧ処理アルギナーゼを、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：７０になるようにして調製した。この２回分の試料調製で用いたＰＥＧ処理方法及び条件は同じものである（実施例８Ａ参照）。 時間０において、５０ｍｇの第１のＰＥＧ処理アルギナーゼ試料を投与した。１２時間後に、さらに５０ｍｇの第１のＰＥＧ処理アルギナーゼ試料を投与した。２４時間後に、さらに５０ｍｇの第１のＰＥＧ処理アルギナーゼ試料の第３回目の投与を行った。 ２６時間から７２時間後まで、断続投与（５０ｍｇ／回）ではなく、第１のＰＥＧ処理アルギナーゼ試料を継続投与した（１００ｍｇ／日）。７２時間から１４４時間まで、第２のＰＥＧ処理アルギナーゼ試料を１００ｍｇ／日で継続投与した。１４４時間後に継続投与を停止し、この時点から半減期測定を開始した。半減期測定の結果を図２２に示す。図２２における時間０は、図２１の１４４時間に相当する。 この結果から、アルギナーゼ活性の半減期が２つのフェーズに分かれうることが示唆された。ＰＥＧ処理酵素の第１の半減期はおよそ６時間である。つまり相対的活性が１００％から５０％に減少するまでにおよそ６時間を要した（図２２参照）。しかし、第２の半減期はおよそ２１日間であった。つまり相対的活性が５０％から２５％に減少するまでにおよそ２１日間を要した。このように半減期が２段階になっているのは、ＰＥＧ処理においてより多量のｍＰＥＧ−ＣＣを使用したことや特別な投与プロトコールを使用したことをはじめとした多くの要因によるものであると考えられる。[実施例９Ｂ] ヒト血漿での測定方法を用いた、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＥＧ処理アルギナーゼの半減期測定 精製アルギナーゼ（１ｍｇ）を１ｍｌの１２５ｍＭのホウ酸バッファー溶液（ｐＨ８．３）に氷中で溶解した。活性化ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ＭＷ ５，０００）（７．１４ｍｇ）を、アルギナーゼ：ＰＥＧのモル比が１：５０になるように上記タンパク質溶液にゆっくりと添加した。実施例８Ｂで説明した方法に従いこの混合液を氷中で２．５時間撹拌した。 濃度が１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ処理アルギナーゼ（３０５．６Ｕ．Ｌ）をヒト血漿（１ｍｌ）に添加した。ＰＥＧ処理アルギナーゼの最終濃度が０．２４ｍｇ／ｍｌになるようにした。この混合液を２０本のエッペンドルフチューブに等量ずつ分注し（各エッペンドルフチューブに混合液６５μｌ）、次に、３７℃にてインキュベーションを行った。各エッペンドルフチューブから混合液を１−２μｌずつ採取してアルギナーゼ活性測定に使用した。その結果を図２０に示す。測定の結果、半減期はおよそ３日であった。つまり相対的活性が１００％から５０％に減少するまでにおよそ３日を要した（図２２参照）。これは、図２０の反応曲線を用いて算出されている。[実施例１０] Ｂ．ＳＵＢＴＩＬＩＳ発現ヒトアルギナーゼ及びＰＥＧ処理、単離及び精製組換えヒトアルギナーゼの特性 （ａ）ＳＤＳ−ＰＥＧＥ及び発光イメージングによるアルギナーゼ純度の測定 Ikemotoら(Ikemotoら、1990, Biochem. J. 270, 697-703)が記述した方法により得た精製Ｅ．ｃｏｌｉ−発現アルギナーゼと、本発明による方法により得た精製B. subtilis−発現アルギナーゼとを比較した（図１９Ａ及び１９Ｂ）。Ｌｕｍｉ−ｉｍａｇｅｒ（登録商標）のＬｕｍｉａｎａｌｙｓｔ ３２プログラム(Roche Molecular Biochemicals)を用いた、図１９Ａで示す全タンパク質バンドの密度分析から、本発明で開発した工程により純度が９９．９％を超えるアルギナーゼが産生されたことが示された（図１９Ｂ）。しかし、純度が８０−１００％の間のアルギナーゼでも、薬学的組成物を調製するために活性成分として使用しうる。好ましい実施形態において、純度８０−１００％の組換えアルギナーゼを使用する。さらに好ましい実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びその後にルミイメージングを用いた測定で、本発明による組換えアルギナーゼの純度が９０−１００％である。 （ｂ）共役反応による特異的活性の測定 ウレアーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤＰＨを使用するシステム(Ozer, N., 1985, Biochem. Med. 33, 367-371)において、Ｌ−アルギニンからの尿素放出度をモニターした。まとめて反応用混合液を調製するために、０．６０５ｇ Ｔｒｉｓ、０．０７３１ｇ α−ケトグルタル酸、及び０．４３５５ｇのアルギニンを４０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解した。１ＭのＨＣｌでｐＨを８．５に調整し、０．０６７ｇのウレアーゼを上記混合溶液に添加した。０．０３３５ｇのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び０．０１２５ｇのＮＡＤＰＨを添加する前に、ＨＣｌでｐＨをさらに８．３に調整した。ｄＨ２Ｏにより最終体積を５０ｍｌにして、反応用混合液を調製した。この反応用混合液（１ｍｌ）をピペットで石英キュベットに移した。アルギナーゼ活性を測定するために、１−５μｇのアルギナーゼを添加し、３４０ｎｍ（Ａ３４０）での吸収減少を、３０℃にて１−３分間追跡した。アルギナーゼの１Ｉ．Ｕ．は、ある一定の条件下で１分間に１μｍｏｌの尿素を放出する酵素量として定義した。本発明の精製組換えヒトアルギナーゼ特異的活性を測定したところ、５１８Ｉ．Ｕ．／ｍｇタンパク質であったが、これは精製ヒト赤血球アルギナーゼ（２０４ Ｉ．Ｕ．／ｍｇタンパク質、Ikemotoら、1989, Ann. Clin. Biochem. 26, 547-553）及びＥ．ｃｏｌｉ−発現単離精製組換えヒトアルギナーゼ（３８９Ｉ．Ｕ．／ｍｇタンパク質、Ｉｋｅｍｏｔｏら、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７０，６９７−７０３）よりも顕著に高かった。 ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ ５，０００）を用いた、１：５０のモル比での２時間４０分の反応で、ＰＥＧ処理アルギナーゼは元の酵素活性（実施例８Ｃ参照）の１１４％の活性を持つようになった。これは即ち、このＰＥＧ処理ヒトアルギナーゼの特異的活性が５９２Ｉ．Ｕ．／ｍｇであったということである。 ｍＰＥＧ−ＣＣ（ＭＷ ５，０００）を用いた場合、ＰＥＧ処理アルギナーゼは元の酵素活性の６４−６８％の活性となった（表３）が、これはＰＥＧ処理ウシアルギナーゼと同程度である(Savoca, K. V. ら、1979、Biochimica et Biophysica Acta 578, 47-53)。 （ｃ）エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳによる非処理アルギナーゼの構造特性分析 図２Ｂで示すアミノ酸配列によると、B. subtilis−発現及び精製組換えヒトアルギナーゼには、３２９アミノ酸残基が含有され、分子量の理論値は３５，６４７．７Ｄａである。非処理アルギナーゼに対するＨＰＬＣ／ＵＶ及びマススペクトル分析の同時測定により、分子量が３５，６３４Ｄａであることが分かった。非処理アルギナーゼの分子量の実測値は、６ｘＨｉｓタグ付加ヒトアルギナーゼの推定アミノ酸配列（図２Ｂ）から計算した理論値である３５，６４７．７Ｄａとほぼ一致した。ＬＣ／ＭＳを基にしたＨＰＬＣ／ＵＶから純度が９８％であることが、また２１５ｎｍの相対反応におけるＨＰＬＣ／ＵＶ検出を基にしたＬＣ／ＭＳからは純度が１００％であることが分かった。 （ｄ）ゲルろ過クロマトグラフィーによる非処理アルギナーゼ及びＰＥＧ処理アルギナーゼの構造特性決定 ＨｉＬｏａｄ１６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘゲルろ過カラム(Pharmacia)を用いて、タンパク質濃度およそ２．８ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳバッファー中）にてゲルろ過クロマトグラフィーによる実験を行ったところ、非処理アルギナーゼの分子量がおよそ７８ｋＤａであり、ＰＥＧ処理アルギナーゼ（実施例８Ｃで調製）の分子量がおよそ６８８ｋＤａであることが分かった。モノマーのアルギナーゼ分子量がおよそ３６ｋＤａであることから、この結果により、ＰＢＳバッファー中で非処理アルギナーゼが二量体として存在することが示唆された。 （ｅ）二次構造 ＪＡＳＣＯ ｍｏｄｅｌ Ｊ８１０ ＣＤ スペクトロメーターを用いた円偏光二色性（ＣＤ）測定により、精製アルギナーゼの二次構造を分析した。１０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）中で同じタンパク質濃度において１９５ｎｍから２４０ｎｍまでスキャンしたところ、非処理アルギナーゼのＣＤスペクトルは、ＰＥＧ処理アルギナーゼ（実施例８Ｃで調製）と非常に近い値であることが分かったが、この結果からアルギナーゼの処理前の形態及びＰＥＧ処理後の形態が二次構造の面でほぼ同じであるということが示された。 （Ｆ）ｐＩの測定 Bio-Rad Model 111 mini IEF cellを用いた測定により、非処理アルギナーゼ（実施例８Ｃで調製）の等電点（ＰＬ）が９．０であることが分かったが、これは文献(Christopher及びWayne、1996, Comp. Biochem. Physiol. 114B, 107-132)における、９．１という値と矛盾しない。 （ｇ）機能特性及び速度論的性質の決定 Ikemotoら(1990, Biochem. J. 270, 697-703)が報告したアルギナーゼ活性測定方法を用いて、非処理アルギナーゼのＫｍ値が１．９±０．７ｍＭ、Ｖｍａｘが５１８μｍｏｌ尿素／分／ｍＭ、ｋｃａｔが２．０±０．５／秒、及びｋｃａｔ ／Ｋｍが１．３±０．４／ｍＭ／秒であることが分かった。精製した非処理アルギナーゼのＫｍ値 は、ヒト肝臓アルギナーゼに対して論文で発表されている値（２．６ｍＭ）(Carvajal, N. ら、1999)と同等であることが分かった。また、非処理アルギナーゼが最大活性に到達するためにはおよそ１ｍＭのＭｎ２＋イオン及び３０−５０℃の温度が必要である。 ＰＥＧ処理アルギナーゼのＫｍ値は、２．９±０．３ｍＭ、及びＶｍａｘが３６０μｍｏｌ尿素／分／ｍＭであることが分かった。ＰＥＧ処理アルギナーゼのＫｍ値 は、非処理アルギナーゼの値とほぼ同等であり、この結果からアルギニンに対する結合アフィニティーがＰＥＧ処理後も保持されていることが示唆された。また、ＰＥＧ処理アルギナーゼが最大活性に到達するためにはおよそ１ｍＭのＭｎ２＋イオン、４０−５０℃の温度及びｐＨ１０という条件が必要である。 ＰＥＧ処理前後のアルギナーゼの機能特性は同等であり、この結果からＰＥＧ−ＳＰＡ分子がアルギナーゼに共有結合することで全体として性能が向上することが示される。[実施例１１] 体外からのアルギナーゼ投与を用いた治療プロトコール 治療中、患者の血液試料を毎日採取して、アルギニン濃度、アルギナーゼ活性、完全血液像、及び全ての凝固機能検査を行った。少なくとも隔日で腎臓及び肝臓機能を測定し、必要とみなされる場合はすぐに検査した。 アルギナーゼ注入を開始してから１時間の間、バイタルサイン（ＢＰ、脈拍、呼吸数、酸素濃度計の記録）を１５分間隔でチェックし、安定するまで１時間ごとにチェックした。その後は治療担当医師の裁量に委ねた。 新しいアルギナーゼを注入する度に、アルギナーゼ注入の２０分前に、ジフェネラミン、１０ｍｇ ｉ．ｖ．及びヒドロコルチゾン、１００ｍｇ ｉ．ｖ．を前もって投薬するか、あるいは治療担当医師の裁量に委ねた。 第１日目に、３０分間にわたりアルギナーゼを投与した。その後、アルギナーゼを毎週最低８週間にわたり投与した。抗−腫瘍活性が観察された場合は継続してもよい。[実施例１２] 体外からのアルギナーゼ注入を行う治療プロトコールの例 広範囲の肺転移を伴う転移性直腸癌の患者で、全ての標準的治療が奏効しなかった５４歳の中国人女性に対して、２００１年８月初旬にＰＥＧ処理組換えアルギナーゼを用いた治療を行った。上記患者の主症状は、咳、食欲不振及び便秘であった。上記患者の腫瘍マーカーＣＥＡは、１１００Ｕ／ｍｌであった。治療前に、ＰＥＧ処理組換えアルギナーゼを用いた治療に関するインフォームドコンセントが得られた。 治療方法 ８５０ｍｇの凍結乾燥組換えアルギナーゼＩを投与した。上記凍結乾燥品をＰＢＳで溶解しＰＥＧ処理を行った。このＰＥＧ処理酵素の活性が減少していないことを確認した。 結果 結果を図２８及び２９に示す。図２８では、５日間、１−５μＭまでアルギニンが十分に減少していたことを示す（図２１も参照のこと）。図２９は、４週間後までに、ＣＥＡレベルが１１００から８００まで低下したことを示す。 １）化学療法とは異なり、この治療では、骨髄抑制作用又は脱毛は見られなかった。 ２）調整のもと、アルギニンを減少させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータから最適な腫瘍抑制効果を示すのに必要とされる期間である５日間、アルギニン濃度を治療に必要な範囲（１−８μＭ）に維持することができる。 ３）大きな副作用はなく、本治療が直接原因ではないと考えられる軽い頭痛を訴える程度で、患者は治療に耐えた。 ４）治療後、生化学及び放射線医学的検査において疾患状態の改善が観察され、また、ＣＥＡが３０％低下し、胸部Ｘ線での上部の病巣が消失した。[実施例１３] アルギナーゼを投与した実験用ラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのアルギニン欠乏 この実施例において、４群のラット（各群２匹、オス１匹、メス１匹）に対して、第０日に、実施例８Ｃで得た様々な用量のアルギナーゼを投与した。第０日に組換えヒトアルギナーゼを腹腔内投与する前及び、第１日から第６日まで２日ごとに血液試料を尾部静脈から採取した。 図２３で示すように、全群で検出不可能なレベルまでアルギニン濃度が低下したが、５００Ｉ．Ｕ．を投与した場合はアルギニン欠乏が１日しか継続せず、効果は用量依存的であると思われた。１０００Ｉ．Ｕ．（午前中に５００Ｉ．Ｕ．を投与し、午後に残りの５００Ｉ．Ｕ．を投与）では、４日間にわたり、完全なアルギニン低下が見られた。１回の投与量が１５００Ｉ．Ｕ．である場合は、６日間にわたり、アルギニン低下が見られた。この用量を倍にして３０００Ｉ．Ｕ．にしても、完全なアルギニン低下期間は延長されなかった。 従って、アルギニンが検出不可能なレベルまで低下し６日間継続するようなアルギニン欠乏状態を誘導するには、１５００Ｉ．Ｕ．のＰＥＧ処理アルギナーゼを腹腔内投与するという条件が最適であると思われる。[実施例１４] 正常ラットと、アルギナーゼによりアルギニン０の状態を誘導されたラットとの間の、第１日から第５日における血中の成分濃度変化の比較 アルギナーゼ投与前、第０日に、５匹のラット群から心臓の動脈血試料を採取した。第０日の試料を非処理コントロールとした。Pathlab Medical Laboratory Ltd, 2ND Floor Henan Building, 90-92 Jaffe Road, Wanchai, Hong Kongにより、全タンパク質、アルブミン、グロブリン、ＳＧＯＴ／ＡＳＴ、ＳＧＰＴ／ＡＬＴ、ヘモグロビン、フィブリノーゲン Ａ．Ｐ．Ｔ．Ｔ／秒、プロトロンビン／秒、白血球数（ＷＢＣ）及び血小板数測定が行われた。次に、ラットに単回投与で１５００Ｉ．Ｕ．のアルギナーゼを腹腔内投与した。全ラットにおいてアルギニン０の状態が誘導された。第１日から第５日まで、各日１匹ずつ屠殺して心臓の動脈血を採取し、PathLab Medical Laboratoryが測定を行った。この結果から、PathLab Medical Laboratoryにより言及されているように、全タンパク質が正常範囲であることが示された。[実施例１５] Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍を有するヌードマウスにおけるアルギニン欠乏に対する反応 ６匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に、ヒトヘパトーマ（肝臓癌）細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７）を皮下に接種して、腫瘍の成長を誘導した。無作為に選択した３匹のマウスに対して、実施例８Ｃで説明した方法により得られた５００Ｉ．Ｕ．のＰＥＧ処理アルギナーゼを週に１回、腹腔内投与し、一方で他のマウスにはアルギナーゼ処理を行わず、コントロール動物とした。２日に１回、ｉｎ ｓｉｔｕで、移植を行ったマウスの固形腫瘍の成長をデジタルキャリパー測定により観察し、腫瘍サイズを算出した。 式：腫瘍サイズ（ｍｍ）＝２本の垂直径及び１本の対角径の平均値 各群で死亡したマウス数も毎日記録した。 図２４で示すように、実験開始後最初の２０日間におけるコントロール群の１日あたりの腫瘍サイズ増大率は、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処理した群のおよそ６倍であった。コントロール群の２匹のマウスは２４時間以内に死亡したが、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処置を行ったマウスは少なくとも７５日間生存した。[実施例１６] ＰＬＣ／ＰＲＦ／５腫瘍を有するヌードマウスにおけるアルギニン欠乏に対する反応 この実施例では、１０匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背中に、ヒトヘパトーマの固形腫瘍（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）を皮下移植して、腫瘍の成長を誘導した。無作為に選択した５匹のマウスに対して、実施例８Ｃで説明した方法により得られた５００Ｉ．Ｕ．のＰＥＧ処理アルギナーゼを週に１回、腹腔内投与し、他の５匹のマウスには２００μｌのリン酸バッファー塩類溶液（ＰＢＳ）を腹腔内投与してコントロール動物とした。２日に１回、ｉｎ ｓｉｔｕで、移植を行ったマウスの固形腫瘍の成長をデジタルキャリパー測定により観察し、腫瘍サイズ及び質量を算出した。 腫瘍サイズは実施例１５で説明したようにして測定し、重量は次の式により算出した。式：腫瘍質量（ｍｇ）＝ 長さｘ幅２／２（比重を１．０ｇ／ｃｍ３と仮定）（ここで長さとは、最長の垂直径であり、幅とは最短の垂直径である。） 図２５Ａで示すように、実験開始から３９日間におけるコントロール群の１日あたりの腫瘍サイズ増大速度は、コントロール群でおよそ６．５ｍｍ／日、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処理した群ではおよそ５．３ｍｍ／日であった。図２５Ｂで示すように、コントロール群の１日あたりの腫瘍質量増加速度は、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処理した群のおよそ１．８倍の高値を示した。[実施例１７] ＨｕＨ−７腫瘍を有するヌードマウスにおけるアルギニン欠乏に対する反応 この実施例では、１０匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背中に、ヒトヘパトーマ固形腫瘍（ＨｕＨ−７）を皮下移植して腫瘍の成長を誘導した。無作為に選択した５匹のマウスに対して、実施例８Ｃで説明した方法により得られた５００Ｉ．Ｕ．のＰＥＧ処理アルギナーゼを週に１回、腹腔内投与し、他の５匹のマウスには２００μｌのリン酸バッファー塩類溶液（ＰＢＳ）を腹腔内投与してコントロール動物とした。２日に１回、ｉｎ ｓｉｔｕで、移植を行ったマウスの固形腫瘍の成長をデジタルキャリパー測定により観察し、実施例１５及び１６で説明したようにして腫瘍サイズ及び質量を算出した。 図２６Ａで示すように、実験開始から１８日間で、１日あたりの腫瘍サイズ増大速度は、コントロール群でおよそ６．０ｍｍ／日、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処理した群ではおよそ５．６ｍｍ／日であった。図２６Ｂで示すように、コントロール群において１日あたりの腫瘍質量増加速度は、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処理した群のおよそ１．４倍の高値を示した。[実施例１８] ＭＣＦ−７腫瘍を有するヌードマウスにおけるアルギニン欠乏に対する反応 本実施例では、４匹のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹にヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）を皮下接種して、腫瘍の成長を誘導した。無作為に選択した３匹のマウスに対して、実施例８Ｃで説明した方法により得られた５００Ｉ．Ｕ．のＰＥＧ処理アルギナーゼを週に１回、腹腔内投与し、残りの１匹のマウスにはアルギナーゼ処理を行わず、コントロール動物とした。２日に１回、ｉｎ ｓｉｔｕで、移植を行ったマウスの固形腫瘍の成長をデジタルキャリパー測定により観察し、実施例１５で説明したようにして腫瘍サイズを算出した。 図２７で示すように、ＰＥＧ処理アルギナーゼで処理を行ったマウスに接種した腫瘍は実験開始から２０日以内に消失した。 本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用しているように、文脈において別段に明記されていない限り、単数形である「a」、「and」、及び「the」には、複数形の意味が含まれる。 従って、例えば、「a pharmaceutical preparation（１つの医薬品）」に言及した場合、様々な「preparations（複数の調製物）」の混合物が含まれ、「the method of treatment（１つの治療方法）」に言及した場合は、当業者その他にとって公知の同等な工程及び方法にも言及することとなる。 特に定義しない限り、本明細書中で使用する専門用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で説明したものと類似又は同等のいかなる方法及び物質をも本発明の実施又は試験に使用しうるが、好ましい方法及び物質は本明細書に記述されているものである。本明細書中に言及した公表物は全て、一緒に参考を引用するために具体的な情報を記述し開示することを目的として本明細書中で参考文献として援用する。本発明は完全に記述されているものであり、本発明の範囲に属する変更は、当業者にとって自明であろう。このような変更は全て、本発明の範囲に属する。 本発明の薬学的組成物は、固形、溶液、乳剤、分散剤、ミセル、リポソーム等の形態の剤型で使用することができ、得られた処方中に、経口ないし非経口での適用に適切な無機ないし有機担体又は賦形剤と混合された状態で、本発明の実施における１つ又は複数の修飾ヒトアルギナーゼが活性成分として含有される。活性成分はアルギナーゼでありうるが、例えば、固形、半固形又は液体で、タブレット、ペレット、カプセル、坐剤、溶液、乳剤、懸濁液、及び医薬品製造での使用に適したその他の形態のための医薬的に許容可能な通常の無毒性担体を伴うアルギナーゼでありうる。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、着色剤、及び香料を使用しうる。目的とする過程、状態又は疾患に対して必要な効果を与えるのに十分な量の、１つ又は複数のアルギナーゼの活性成分が医薬処方に含まれる。 本明細書中で意図する活性成分を含有する医薬処方は、例えば、タブレット、トローチ、薬用ドロップ、水性ないし油性懸濁液、拡散性粉末又は顆粒、乳剤、硬カプセルないし軟カプセル、又はシロップないしエリキシル剤として、経口での使用に適した形態でありうる。医薬品の製造に関する分野で公知のあらゆる方法により、経口での使用を対象とした剤型を調製しうる。タブレットは、被覆されていないもの、又は、消化管における分解及び吸収を遅延させ、それによってより長時間にわたり活性を持続させるために公知の技術により被覆されているものでありうる。これらのタブレットを被覆して、放出を調節できる浸透性の治療用タブレットを形成してもよい。 ある場合には、経口用の処方が、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン等の不活性固形希釈剤と活性成分とを混合した硬ゼラチンカプセルの形態でありうる。経口用の処方が、水溶媒又は、例えばピーナツ油、液体パラフィン、又はオリーブオイル等の油性溶媒と活性成分とを混合した軟ゼラチンカプセルの形態でありうる。 薬学的製剤は、注射可能な滅菌溶液ないし懸濁液の形態でもありうる。適切な分散剤ないし加湿剤、及び懸濁化剤を使用する公知の方法により、この懸濁液を調製しうる。注射可能な滅菌製剤はまた、例えば、１，４−ブタンジオール溶液として、非経口で使用可能な無毒性希釈剤又は溶剤を用いた注射可能な滅菌溶液又は懸濁液でもありうる。従来、滅菌不揮発性油が溶剤又は懸濁化剤として用いられている。この目的のために、合成モノ−ないしジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、ゴマ油、ココナツ油、ピーナツ油、綿実油等の天然植物油、又はオレイン酸エチル等の合成脂肪性賦形剤等を含む、あらゆるブランドの不揮発性油を使用することができる。必要に応じて可溶性酵素を溶解するために溶質として、緩衝液、デキストロース溶液保存剤、抗酸化剤等を導入又は使用しうる。 本医薬処方はまた、他の化学療法剤と組み合わせた補助的な治療剤でありうる。 特許請求の範囲において、配列番号９で示した配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するアルギナーゼとは、配列番号９で示した配列とその配列が少なくとも３０％一致しているか、又は、本明細書中で説明したアルギナーゼ活性分析を用いて測定した場合に、配列番号９の酵素と、実質的に同様の酵素との間で、酵素活性に著しい違いがないことを意味する。精製を簡便にするために６個のヒスチジンが付加されており、そのアミノ末端に付加されたメチオニンにより翻訳が開始されることになる。他の形態の精製法もまた使用可能であり、従って「実質的に同様」のアルギナーゼが、配列番号３のＭＨＨＨＨＨＨ配列とホモロジーを有する必要がないことは当業者にとって明らかである。細菌株の中には、配列番号９と少なくとも４０％のホモロジーを持つものがありうる。また、哺乳類アルギナーゼの中には、配列番号９と７０％のホモロジーを持つものがありうる。 配列表SEQ ID NO: 1（図２Ａ）SEQ ID NO: 2 & 3（図２Ｂ：核酸配列(SEQ ID NO: 2)；及びアミノ酸配列(SEQ ID NO: 3)）SEQ ID NO: 4：6xHis Tag MHHHHHHSEQ ID NO: 5：5'-CCAAACCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATA-3'(Arg 1)SEQ ID NO: 6：5'-CCAAACTCTAGAATCACATTTTTTGAATGACATGGACAC-3'(Arg 2)SEQ ID NO: 7：5'-CTCTGGCCATGCCAGGGTCCACCC-3'(Arg 6)SEQ ID NO: 8 & 9：（図２Ｃ：核酸配列(SEQ ID NO: 8)；及びアミノ酸配列(SEQ ID NO: 9)）。 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｔｉｌｉｓを宿主に用いた遺伝子組換え技術により得られ、５００−６００Ｉ．Ｕ．／ｍｇの比活性を生じる修飾を含んでなる、配列番号９のアミノ酸配列を有する単離された組換えヒトアルギナーゼＩ。 ヒトアルギナーゼＩのアミノ末端にさらに６個のヒスチジンが付加されている、請求項１に記載の組換えヒトアルギナーゼＩ。 少なくとも３日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿濃度半減期を与える修飾を有する、請求項１に記載の組換えヒトアルギナーゼＩ。 少なくとも純度が９０％である、請求項１に記載の単離された組換えヒトアルギナーゼＩ。 前記修飾がＰＥＧ処理を含んでなる、請求項３に記載の組換えヒトアルギナーゼＩ。 カップリング剤を用いて少なくとも１個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が前記アルギナーゼに共有結合されることによって前記ＰＥＧ処理が与えられる、請求項５に記載の組換えヒトアルギナーゼＩ。 ２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（塩化シアヌル、ＣＣ）及びプロピオン酸スクシンイミド（ＳＰＡ）からなる群から前記カップリング剤が選択される、請求項６に記載の組換えヒトアルギナーゼＩ。 請求項１に記載の単離された組換えヒトアルギナーゼＩおよび薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる薬学的組成物。 前記ヒトアルギナーゼＩが、そのアミノ末端に付加された６個のヒスチジンを含んでいる、請求項８に記載の薬学的組成物。 前記ヒトアルギナーゼＩの患者血漿中の半減期が少なくとも３日である、請求項８に記載の薬学的組成物。 医薬を調製するための請求項１に記載のヒトアルギナーゼＩの使用。 ヒト悪性腫瘍を治療するために前記医薬が使用される、請求項１１に記載の使用。 前記ヒト悪性腫瘍が肝臓腫瘍、乳癌、結腸癌、又は直腸癌である、請求項１２に記載の使用。配列表