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| タイトル： | 特許公報(B2)_ペプチドの製造方法 |
| 出願番号： | 2009524509 |
| 年次： | 2013 |
| IPC分類： | C07K 1/02,C07K 1/06,C07K 1/08 |
特許情報キャッシュ
高橋 大輔 JP 5212371 特許公報(B2) 20130308 2009524509 20080724 ペプチドの製造方法 味の素株式会社 000000066 高島 一 100080791 土井 京子 100125070 鎌田 光宜 100136629 田村 弥栄子 100121212 山本 健二 100122688 村田 美由紀 100117743 高橋 大輔 JP 2007193331 20070725 20130619 C07K 1/02 20060101AFI20130530BHJP C07K 1/06 20060101ALI20130530BHJP C07K 1/08 20060101ALI20130530BHJP JPC07K1/02C07K1/06C07K1/08 Ｃ０７Ｋ １／００−１／３６ ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） Tetrahedron Letters, 1974, No.19, pp.1785-1786 Organic Process Research & Development, 2003, Vol.7, pp.28-37 11 JP2008063280 20080724 WO2009014176 20090129 20 20110217 名和 大輔 本発明は、ペプチドの液相合成法、特にワンポット合成可能な方法に関する。 ペプチドの有機化学的合成法は、Ｎ−保護アミノ酸とＣ−保護ペプチド（ジペプチド形成反応時には、Ｃ−保護アミノ酸）とのカップリング反応とそれに引き続くＮ末端脱保護反応とからなるペプチド伸長反応の繰り返しから構成され、Ｃ−保護ペプチド（またはＣ−保護アミノ酸）の態様により固相法と液相法が挙げられる。 固相法では、ペプチド（またはアミノ酸）のＣ末端を固体支持体に結合した状態でペプチド伸長を行ない、最終段階で目的のペプチドは固体から切り離される。したがって，過剰または未反応により残留した試薬や副生成物は固体支持体の洗浄により容易に淘汰することができる。しかしながら、反応が固体表面に限定されるためスケールアップや反応性などに課題がある。 それに対して、液相法はスケールアップが容易であり、反応性も相対的に良好となるため、ペプチド医薬品などの工業的製造に利用されている。しかし液相法は、カップリング反応および脱保護の各工程において、残留試薬や副生成物を除去するために結晶化などの単離操作が必要であり、製造工程が複雑化し、製造期間が増大するという問題があった。 かかる状況から、液相法の各工程において種々の手段で残留試薬や副生成物を淘汰し、結晶化などの単離操作をすることなく次工程のペプチド伸長反応を行うことによって、ワンポットで目的とするペプチドまで合成する試みがなされている。 非特許文献１および２では、カップリング反応の後に希塩酸および炭酸ナトリウム水溶液による洗浄、および脱保護の後に炭酸ナトリウム水溶液および中性水溶液による洗浄を行うことにより、酸性および塩基性の残留試薬や副生成物を淘汰する方法が記載されている。しかしこの方法では、中性残留物であるＮ−保護アミノ酸活性エステルを淘汰することが出来ず、それが次工程以降で不純物ペプチド副成の原因となってしまうという問題がある。 特許文献１および非特許文献３には、Ｎ−Ｚアミノ酸やＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸を用いてカップリング反応を行い、反応混合物中に残留するＮ−保護アミノ酸活性エステルをβ−アラニンエステル（ベンジルエステルまたはフルオレニルメチルエステル）でクエンチングさせ、次いでＮ−末端保護基の脱保護反応を行うことにより、クエンチングにより生成したＮ−保護アミノ酸−β−アラニンエステルのＺ基又はＦｍｏｃ基などのＮ−保護基、およびベンジル又はフルオレニルメチルなどのカルボン酸保護基を同時に脱保護して水溶性物質に導いて水層に淘汰する方法が記載されている。この方法では、脱保護した後でなければ淘汰性のある水溶性物質には導くことはできず、脱保護させた後に塩基性の高い炭酸ナトリウム水溶液で洗浄して、淘汰している。しかしながら、炭酸ナトリウム水溶液など比較的塩基性の強い条件で処理すると、ペプチドのＣ末端、又はＣ末端より２番目のアミノ酸残基がプロリンのペプチドである場合には、ジケトピペラジン環が生成する副反応が進行したり、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルなどである場合は加水分解を受けたり、あるいはＣ末端がシステインの場合はエピメリ化しやすいなど、好ましくない副反応が生じるという問題があった。 非特許文献４には、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルをカップリング反応で用い、残留したＮ−Ｂｏｃアミノ酸活性ペンタフルオロフェニルエステルをＮ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミド（ＤＭＰＤＡ）などのポリアミンとカップリングさせて塩基性物質に導いた後に酸性水溶液洗浄で水層に淘汰する方法が記載されている。この方法では、Ｂｏｃ基をトリフルオロ酢酸などの強酸で脱保護した後、使用した酸を除くため炭酸ナトリウム水溶液などで洗浄する必要があり、塩基処理における上記と同様の問題がある。 また、Ｎ末端保護基としてＺ基（ベンジルオキシカルボニル）を使用した場合も、脱保護での接触還元反応が酸性条件下で行われ、後処理で塩基を用いて酸を中和する必要があるため、塩基処理における上記と同様の問題がある。米国公開特許第２００３／００１８１６４号明細書Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． １５，ｐ． ６１-６６， １９９７Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．，ｖｏｌ． ５５， ２１６５，１９８２Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ．１１， ｐ． ６６３−６４１， ２００５Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ， ｖｏｌ． １９，ｐ． １７８５-１７８６， １９７４Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ６４， ｐ． ４３２５-４３３８， １９９９Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． ７， ｐ． ２８−３７， ２００７ 本発明の目的は、Ｂｏｃ−ＮＨ基又はＺ−ＮＨ基の脱保護を含むペプチドの液相合成法において、工業的製造に適したペプチドの液相合成法、特にワンポット合成を可能とする方法を提供することである。 本発明者は上記課題を解決するため、特にＣ末端付近にプロリン残基やシステイン残基を有したり、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルの場合のペプチド合成において問題となる副反応を回避すべく鋭意検討した結果、意外なことに、脱保護の後、反応混合物のｐＨを一定範囲に制御するという簡便な操作により、脱保護で用いた酸を除去し、又、ジケトピペラジン生成などの副反応を回避し、かつ目的のＣ−保護ペプチドを効率よく抽出できることを見出した。かかる知見に基づき、従来、ワンポット合成が困難であったこのようなペプチドに本法を適用したところ、ワンポットで高収率に合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。 すなわち、本発明は以下に示される内容を包含する。［１］液相合成法によるペプチドの製造方法において、（Ｉ）Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチドを酸と反応させることにより脱保護した後、または（ＩＩ）Ｚ−ＮＨ基を含むペプチドを酸性条件下で接触還元に付すことにより脱保護した後に、反応混合物のｐＨを４〜７に調整する工程を含むことを特徴とする方法。［２］ｐＨを５〜６に調整する、上記［１］に記載の方法。［３］ペプチドのＣ末端アミノ酸残基がプロリンもしくはシステイン、および／またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンである、上記［１］または［２］に記載の方法。［４］ペプチドのＣ末端がメチルエステル又はエチルエステルで保護されている、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。［５］（１）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸と、縮合剤の存在下縮合させる工程、および／または（２）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルと縮合させる工程を含む、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。［６］上記［５］の（１）の縮合工程において、活性化剤をさらに存在させる、上記［５］記載の方法。［７］上記［５］記載の縮合工程の後、反応混合物を酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄する工程をさらに含む、上記［５］または［６］記載の方法。［８］上記［５］記載の縮合工程の後、反応混合物をクエンチ剤で処理する、上記［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。［９］クエンチ剤がＤＭＰＤＡである、上記［８］記載の方法。［１０］上記［１］記載の工程で得られた中間体ペプチドを固体として単離せずに上記［５］記載の工程に供することを含む、上記［５］〜［９］のいずれか一項に記載の方法。［１１］ワンポット合成で行う、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。 本発明によれば、Ｂｏｃ−ＮＨ基又はＺ−ＮＨ基の脱保護を含むペプチドの液相合成法において、工業的製造に適したペプチドの液相合成法が提供される。特に従来ワンポット合成が困難であったＣ末端またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンであるペプチド、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルであるペプチド、Ｃ末端アミノ酸がシステインであるペプチドをワンポットで合成できる方法が提供される。 本発明の方法は、Ｎ末端保護基としてＢｏｃ、Ｃ末端保護基としてメチルエステルなどの安価かつ脱保護が容易な保護基のみにてペプチド合成を行いうるので、接触還元によるベンジルの脱保護が困難である含硫アミノ酸を含むペプチドのワンポット合成に好適に適用できる。 本明細書において使用される記号、略号の意味を以下に示す。（１）Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（２）Ｚ：ベンジルオキシカルボニル（３）Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル（４）Ｂｓｍｏｃ：１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメトキシカルボニル（５）Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル（６）Ａｃ：アセチル（７）Ｍｅ：メチル（８）Ｅｔ：エチル（９）ｉＰｒ：イソプロピル（１０）ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル（１１）Ｂｚｌ：ベンジル（１２）Ｔｒｔ：トリチル（１３）Ｆｍ：９−フルオレニルメチル（１４）ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１５）ＨＯＣｔ：６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１６）ＨＯＡｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（１７）ＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１．２．３−ベンゾトリアジン（１８）ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１９）ＨＯＰｈｔ：Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（２０）ＨＯＮｂ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド（２１）Ｂｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−１−イル（２２）Ｃｔ：１−ヒドロキシ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル（２３）Ａｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル（２４）ＯＢｔ：３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１．２．３−ベンゾトリアジン−３−イル（２５）Ｓｕ：スクシンイミドイル（２６）Ｐｈｔ：フタルイミドイル（２７）Ｎｂ：５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドイル（２８）ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２９）ＥＤＣ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（３０）ＥＤＣ．ＨＣｌ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（３１）ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（３２）ＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス(ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（３３）ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（３４）ＰｙＢｒｏＰ：ブロモトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（３５）ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（３６）ＨＣＴＵ：Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（３７）ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（３８）ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（３９）ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール（４０）ＤＭＴ−ＭＭ：４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホニウム クロリド（４１）ＡＡｎ：アミノ酸残基（下付のｎは１以上の任意の整数であり、ペプチドＣ末端からの順番を示す。）（４２）ＰＧ０：ペプチドのＣ末端カルボキシル基の保護基（４３）ＰＧｎ：アミノ基の保護基（下付のｎは１以上の任意の整数であり、ＡＡｎのアミノ基の保護基であることを示す。）（４４）ＨＯＥ：活性化剤（４５）Ｅ：活性エステル基（４６）Ｇｌｙ：グリシン（４７）Ａｌａ：アラニン（４８）Ｖａｌ：バリン（４９）Ｌｅｕ：ロイシン（５０）Ｉｌｅ：イソロイシン（５１）Ｍｅｔ：メチオニン（５２）Ｐｈｅ：フェニルアラニン（５３）Ｔｙｒ：チロシン（５４）Ｔｒｐ：トリプトファン（５５）Ｈｉｓ：ヒスチジン（５６）Ｌｙｓ：リジン（５７）Ａｒｇ：アルギニン（５８）Ｓｅｒ：セリン（５９）Ｔｈｒ：トレオニン（６０）Ａｓｐ：アスパラギン酸（６１）Ｇｌｕ：グルタミン酸（６２）Ａｓｎ：アスパラギン（６３）Ｇｌｎ：グルタミン（６４）Ｃｙｓ：システイン（６５）Ｐｒｏ：プロリン（６６）Ｏｒｎ：オルニチン（６７）Ｓａｒ：サルコシン（６８）β−Ａｌａ：β−アラニン（６９）ＧＡＢＡ：γ−アミノ酪酸（７０）Ｐａｌ：３−ピリジルアラニン（７１）Ｃｐａ：４−クロロフェニルアラニン（７２）Ｎａｌ：２−ナフチルアラニン（７３）ＤＭＰＤＡ：Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン ＰＧ０で示されるＣ末端カルボキシル基の保護基としては、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉＰｒ、ｔＢｕなどのアルキル基、Ｂｚｌ、Ｆｍ、Ｔｒｔ、ジフェニルメチル、１，１−ジメチルベンジル等のアラルキル基、ジメチルフェニル等が挙げられる。 ＰＧｎで示されるアミノ基の保護基としては、Ｂｏｃ、Ｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｓｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ａｃ等が挙げられる。 Ｅで示される活性エステル基とは、アミノ基による求核攻撃を受けて「ＥＯ−」として容易に脱離し、アミド結合を生成させうる基を意味し、Ｂｔ、Ｃｔ，Ａｔ、ＯＢｔ、Ｓｕ、Ｐｈｔ、Ｎｂ、ペンタフルオロフェニル等が挙げられる。 本明細書においてアミノ酸を「Ｈ−ＡＡ−ＯＨ」と表示した場合は、左側がアミノ基、右側がカルボキシル基であることを意味し、アミノ基およびカルボキシル基がそれぞれ保護されていないことを意味する。 この場合において、例えば、カルボキシル基が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ−ＯＰＧ０」と表示され、アミノ基が保護されている場合は、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。 アミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基が活性エステル化されている場合は、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。 ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＨの対称酸無水物は、「（ＰＧｎ−ＡＡ）２−Ｏ」と表示される。 アミノ酸が側鎖官能基を有する場合に、該官能基が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ（ＰＧ）−ＯＨ」（ＰＧは側鎖官能基の保護基を示す）と表示される。 本明細書においてペプチドを「Ｈ−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＨ」（下付けのｎ’は２以上の任意の整数を示す。）と表示した場合は、左側がＮ末端、右側がＣ末端であり、Ｎ末端およびＣ末端がそれぞれ保護されていないアミノ酸残基をｎ’個有するペプチドであることを意味する。ここで、Ｎ末端とはアミノ酸残基のα位アミノ基に限定されず、ペプチド伸長が側鎖アミノ基（例えば、Ｌｙｓのεアミノ基）を介して行われる場合は、当該側鎖アミノ基もＮ末端に含まれる。以下、同様。 この場合において、例えば、Ｃ末端が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」と表示し、さらにＮ末端が保護されている場合は、「ＰＧｎ’−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」と表示するものとする。 本発明方法により合成されるペプチドの構成単位となるアミノ酸残基としては、天然アミノ酸または非天然アミノ酸が特に限定されることなく含まれ、また、それらのＬ体あるいはラセミ体も包含される。 天然アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｏｒｎ、Ｓａｒ、β−Ａｌａ、ＧＡＢＡ等が挙げられる。 非天然アミノ酸としては、上記の天然アミノ酸のＤ体、Ｐａｌ、Ｎａｌ、Ｃｐａ等が挙げられる。 また、当該アミノ酸が側鎖に官能基を有する場合に、該官能基を保護基により保護したアミノ酸とすることもできる。かかる側鎖保護アミノ酸としては、例えば、Ｇｌｕのγ位又はＡｓｐのβ位のカルボキシル基をベンジル基で保護したγ-Ｂｚｌ−Ｇｌｕ又はβ−Ｂｚｌ−Ａｓｐ；、Ｇｌｕのγ位又はＡｓｐのβ位のカルボキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したγ−ｔＢｕ−Ｇｌｕ又はβ−ｔＢｕ−Ａｓｐ；Ｌｙｓのεアミノ基を保護したε−Ｚ−Ｌｙｓ、ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、ε−ｉＰｒ−ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ；ＣｙｓのＳＨ基をフェニルカルバモイル基で保護したＳ−フェニルカルバモイル−Ｃｙｓ；ＣｙｓのＳＨ基をトリチル基で保護したＳ−Ｔｒｔ−Ｃｙｓ；Ｔｙｒ及びＳｅｒの水酸基の酸素をＢｚｌで保護した誘導体等が挙げられる。 本発明において「Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチド」とは、該ペプチドが有するアミノ基の一つ以上がＢｏｃで保護されたペプチドを意味し、該アミノ基はＮ末端アミノ基であってもよいし、側鎖のアミノ基であってもよい。 本発明において「Ｚ−ＮＨ基を含むペプチド」とは、該ペプチドが有するアミノ基の一つ以上がＺで保護されたペプチドを意味し、該アミノ基はＮ末端アミノ基であってもよいし、側鎖のアミノ基であってもよい。 「Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチド」または「Ｚ−ＮＨ基を含むペプチド」の脱保護は、ペプチドの液相合成法に含まれるアミノ基の脱保護であれば、特に限定されない。例えば、後掲のＮ末端脱保護工程であってもよいし、最終脱保護における側鎖アミノ基の脱保護であってもよい。好ましくは、後掲のペプチド伸長反応において、次工程のカップリングの対象となるアミノ基を生成させる脱保護である。 本発明において「Ｎ−保護アミノ酸」とは、アミノ基が保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。 本発明において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル」とは、アミノ基が保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化されたアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。 なお、Ｎ−保護アミノ酸活性エステルとして単離可能なものは、Ｅがペンタフルオロフェニル、ＳｕまたはＮｂであるものであり、その他のＮ−保護アミノ酸活性エステルは、Ｎ−保護アミノ酸を縮合剤（例えば、ＥＤＣ）および活性化剤（例えば、ＨＯＢｔ）と反応させることにより、反応系中で生成される。 本発明において「Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸」とは、アミノ基がＢｏｃで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｂｏｃ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。 本発明において「Ｎ−Ｚアミノ酸」とは、アミノ基がＺで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｚ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。 本発明において、例えば、「（Ｂｏｃ ｏｒ Ｚ）−ＡＡ−ＯＨ」と表示した場合は、アミノ基がＢｏｃまたはＺで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味する。 本発明において「Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステル」とは、アミノ基がＢｏｃで保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化された任意のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｂｏｃ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。 本発明において「Ｎ−Ｚアミノ酸活性エステル」とは、アミノ基がＺで保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化された任意のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｚ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。 本発明において、例えば、「（Ｂｏｃ ｏｒ Ｚ）−ＡＡ−ＯＥ」と表示した場合は、アミノ基がＢｏｃまたはＺで保護されており、カルボキシル基が活性エステル化されているアミノ酸を意味する。 Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルとして単離可能なものは、Ｅがペンタフルオロフェニル、ＳｕまたはＮｂであるものであり、その他のＮ−保護アミノ酸活性エステルは、Ｎ−保護アミノ酸を縮合剤（例えば、ＥＤＣ）および活性化剤（例えば、ＨＯＢｔ）と反応させることにより、反応系中で生成される。 本発明において「Ｃ−保護ペプチド」とは、Ｃ末端が保護されており、Ｎ末端が保護されていない任意の個数のアミノ酸残基を有するペプチドを意味し、上記表記法によれば、「Ｈ−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」（ｎ’は２以上の整数を示す）と表示される。 本発明において「Ｃ−保護アミノ酸」とは、カルボキシル基が保護されており、アミノ基が保護されていないアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｈ−ＡＡ１−ＯＰＧ０」と表示される。 本発明において「Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド」とは、Ｎ末端とＣ末端の両方が保護されている任意の個数のアミノ酸残基を有するペプチドを意味し、上記表記法によれば、「ＰＧｎ’−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」（ｎ’は２以上の整数を示す）と表示される。また、例えば、Ｎ末端がＢｏｃで保護されていて、Ｃ末端がＥｔで保護されているＮ，Ｃ−ジ保護ペプチドは「Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−Ｅｔペプチド」と表示するものとする。 本発明において「中間体ペプチド」とは、ペプチド液相合成における各工程で得られる合成中間体であるペプチドであって、最終的に目的とするペプチドよりアミノ酸残基数が少ないものを意味する。好ましい中間体ペプチドは、後掲のＮ末端脱保護後に得られるＣ−保護ペプチドである。 本発明において「縮合剤」としては、ＤＣＣ、ＥＤＣ（塩酸塩およびフリー体を含む。）、ＤＩＣ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏＰ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＣＤＩ、ＤＭＴ−ＭＭ等が挙げられる。 本発明において「活性化剤」とは、縮合剤との共存化でカルボキシル基を活性エステル、対称酸無水物などに導いてアミド結合を形成させやすくする試薬であり、「ＨＯＥ」で示される。具体的には、ＨＯＢｔ、ＨＯＣｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＳｕ、ＨＯＰｈｔ、ＨＯＮｂ、ペンタフルオロフェノール等が挙げられる。 本発明において「クエンチ剤」とは、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル、Ｎ−保護アミノ酸のアシルイソウレア、Ｎ−保護アミノ酸の対称酸無水物などのアミン成分と縮合しうる反応混合物中の残留物や副生成物（以下、本明細書において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等」と総称する。）と反応して、塩基性、酸性または水溶性のＮ−保護アミノ酸誘導体に変換させ、酸性洗浄、塩基性洗浄または水洗によって該誘導体を容易に水層に移行させうる試薬または当該「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等」と反応して捕捉する樹脂などを意味し、例えば、ＤＭＰＤＡ、ジエチルプロパンジアミン、プロパンジアミン、エチレンジアミン、プトレッシン、アミノメチルピリジンなどの多価アミン類、Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノメチルポリスチレンなどの固体に担持された求核性除去剤、β−Ａｌａエステル（例えば、β−Ａｌａ−ＯＢｚｌ、β−Ａｌａ−ＯＦｍ等）等が挙げられる。Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等と多価アミン類との反応により、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等を塩基性のＮ−保護アミノ酸アミド誘導体に導くことができ、これを酸性水溶液洗浄で水層に淘汰することができる。 Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等とβ−Ａｌａエステルとの反応により、Ｎ−保護アミノ酸−β−Ａｌａエステルに導き、さらにこれを脱保護することにより酸性の（Ｎ−保護）アミノ酸−β−Ａｌａ誘導体に導くことができる。これは、塩基性水溶液洗浄で水層に淘汰することができる。 Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等を固体に担持された求核性除去剤と反応させることにより、Ｎ−保護アミノ酸と固体の間にアミド結合が形成され、Ｎ−保護アミノ酸を固体表面上に捕捉することができる。 本発明において「ワンポット合成」とは、ペプチドの液相合成法において、各工程で得られる中間体ペプチドを反応容器から取り出さずに目的とするペプチドまで合成することを意味する。 本発明の方法により最終的に合成されるペプチドは特に限定されるものはないが、合成医薬ペプチド、化粧品、電子材料（有機ＥＬなど）、食品などの合成に好適に利用可能である。 該ペプチドの構成アミノ酸残基数は特に限定されないが、一般的な合成ペプチドにみられる３〜１５個程度が好適である。 また、本発明の方法は、ジケトピペラジン副成の問題があるＣ末端、またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンである場合や、エピメリ化の問題があるシステインがＣ末端に位置する場合、又、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルの場合に適している。 本発明は、ペプチドの液相合成法に適用されるものである。ここで、「ペプチドの液相合成法」とは、固相法ではないことを意味し、全ての試薬が溶媒に溶解している場合の他、試薬の全部または一部が溶媒に溶解せず、懸濁などしているいわゆる不均一反応も本発明の方法に含まれる。 本発明のペプチドの液相合成法は、ペプチド合成化学で常用される一般的な方法を特に制限なく採用することができる。 具体的には、下記スキームに示す方法、すなわち、（１）Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ’）（ｎ’は、２以上の任意の整数を示し、アミノ酸残基がｎ’個のペプチドであることを意味する。以下、同様。）または一回目のペプチド伸長においてはＣ−保護アミノ酸（Ａ１）（以下、本明細書において「Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等」（ｎは、１以上の任意の整数を示し、ｎが１の場合は、Ｃ−保護アミノ酸（Ａ１）を意味する。以下、同様。）と総称する。）を、Ｎ−保護アミノ酸（ＰＡｎ＋１）と、縮合剤（および好ましくは活性化剤）の存在下、縮合させるか、あるいは（２）Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等を、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（ＰＡＥｎ＋１）と縮合させて、アミノ酸残基が一つ伸長したＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（ＰＰｎ＋１）を得る工程（以下、本明細書においてそれぞれ「カップリング工程（１）」および「カップリング工程（２）」という。）、得られたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（ＰＰｎ＋１）のアミノ保護基を脱保護してＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を得る工程（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程」という。）を１サイクルとする反応（以下、本明細書において「ペプチド伸長反応」という。）の繰り返しからなる方法であり、最終段階で、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｍ）のカルボキシ保護基および側鎖官能基が保護されている場合は当該保護基を脱保護することにより（以下、本明細書において「最終脱保護工程」という。）、目的のペプチド（Ｐ）が得られる。 本発明のペプチド合成法において、ｎ番目のペプチド伸長反応を「ペプチド伸長反応（ｎ）」、ペプチド伸長反応（ｎ）を構成する各工程をそれぞれ「カップリング工程（１−ｎ）」、「カップリング工程（２−ｎ）」および「Ｎ末端脱保護工程（ｎ）」と表示するものとする。（式中、ｍは目的とするペプチドのアミノ酸残基数を示し、他の記号は上記で定義した通りである。） 本発明は、一連のペプチド伸長反応の少なくとも一回で、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸を使用してカップリング工程（１）を行うか、またはＮ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルを使用してカップリング工程（２）を行い、続くＮ末端脱保護工程で（Ｉ）Ｂｏｃ基を酸と反応させることにより脱保護した後（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程（Ｉ）」といい、ペプチド伸長反応（ｎ）においては「Ｎ末端脱保護工程（Ｉ−ｎ）」と表示する。）、または（ＩＩ）Ｚ基を酸性条件下で接触還元に付すことにより脱保護した後（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ）」といい、ペプチド伸長反応（ｎ）においては「Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ−ｎ）」と表示する。）のワークアップにおいて、反応混合物のｐＨを４〜７に調整する工程を含むことを特徴とする（以下、「本発明のペプチド伸長反応」といい、ｎ回目のペプチド伸長反応においては「本発明のペプチド伸長反応（ｎ）」と表示する。）。 本発明のペプチド合成において、少なくとも１回、本発明のペプチド伸長反応が含まれていればよいが、全ての工程を本発明のペプチド伸長反応で行うことが好ましく、それにより目的のペプチドまでワンポットで合成することができる。 以下に、本発明のペプチド伸長反応（ｎ）のスキームを示す。（式中、各記号は上記で定義した通りである。） Ｂｏｃ基またはＺ基のＮ末端脱保護工程のワークアップで、反応混合物のｐＨを４〜７という範囲に調整することにより、意外なことに塩基性にしなくとも酸を効率的に除去でき、さらに意外なことには反応混合物のｐＨが酸性域にあるにも係わらず遊離アミノ基を有するＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を効率よく抽出できることが見出された。このような弱酸性条件でワークアップが可能となることにより、ジケトピペラジン生成、エステル加水分解、エピメリ化などの副反応を回避し、洗浄のみで残留物などを淘汰することができるので、単離操作をすることなく得られたＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を次のペプチド伸長反応に供することができ、ワンポット合成に繋げることができる。 この場合、ｐＨが４より低いと酸が除去されにくく、またＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）が水層に淘汰されてしまう虞がある。また、ｐＨが７より高いと、ジケトピペラジン生成、エステル加水分解、エピメリ化などの副反応が進行してしまう虞がある。かかるｐＨの範囲内であれば如何なる値も採用されうるが、より好ましくはｐＨ５〜６であり、ｐＨ５．５が特に好ましい。 なお、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ６４， ｐ． ４３２５−４３３８, １９９９およびＯｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． ７， ｐ． ２８−３７， ２００７には、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｂｓｍｏｃアミノ酸活性エステルを用いてカップリング工程を行い、続くＮ末端脱保護工程において４−（アミノメチル）ピペラジン（４−ＡＭＰ）、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＡＥＡ）などの多価アミン類を用いることにより副成するジベンゾフルベンなどを塩基性誘導体に導いた後に、当該誘導体を水層に淘汰するために反応混合物をｐＨ５．５に調整していることが記載されている。しかし、上記文献はＦｍｏｃまたはＢｓｍｏｃの脱保護後の処理であり、本発明とは構成を異にし、また、脱保護の結果副成するジベンゾフルベン誘導体などを除去することを目的としており、本発明とは趣旨が全く異なる。さらには、上記文献は、脱保護後に反応混合物を塩基性から弱酸性に調整するものであり、酸性領域から弱酸性に調整することにより作用効果を奏する本発明の方法を示唆するものではない。 以下に、本発明のペプチド伸長反応について説明する。１．カップリング工程１−１．カップリング工程（１） 本発明のペプチド伸長反応のカップリング工程（１）においては、例えば、溶媒中において、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸（以下、本明細書において「Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）」と総称する。）、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等および縮合剤を（好ましくは、活性化剤と共に）混合することによって一つアミノ酸残基が伸長したＮ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチドまたはＮ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（以下、本明細書において「Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）」と総称する。）が得られる。添加順序は特に限定はないが、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が一つ前のペプチド伸長反応（ｎ−１）によって得られたものである場合は、反応容器中のＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等の溶液にＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）および縮合剤を添加すればよい。 Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対して、通常０．９〜２．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。この範囲より少ないと、未反応のＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が残りやすく、多いと過剰のＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）を除去しにくくなる。 Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等を酸付加塩として使用した場合には中和するため、塩基が添加される。該塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどが挙げられる。該塩基の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対して、通常０．８〜２．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。塩基の使用量がこの範囲より少ないと中和が不十分となり反応が進行しにくくなり、多い場合はジケトピペラジン生成やエピメリ化などの副反応が進行する虞がある。 縮合剤は上記で例示したものを特に制限なく使用することができ、ＥＤＣ（フリー体または塩酸塩）、ＤＩＣ（フリー体または塩酸塩）が、残留した縮合剤や縮合剤の分解物を洗浄により淘汰することが容易であるため好ましい。特に、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が本発明のペプチド伸長反応で得られたものである場合は、ＥＤＣのフリー体が好ましい。本発明のペプチド伸長反応で得られるＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等はｐＨ４〜７で処理されているため酸付加塩で得られるが、当該縮合剤のフリー体を使用することにより、中和と活性化を同時に行うことができる。この場合、上記の塩基を使用する必要がなく、反応混合物が塩基性になる虞がないので、ジケトピペラジン生成などの副反応を回避することができる。縮合剤の使用量は、Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）に対して通常０．８〜３．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。 カップリング工程（１）において、反応を促進し、ラセミ化などの副反応を抑制するために、好ましくは、活性化剤が添加される。活性化剤を存在させた場合は、反応系中で一時的にＮ−保護アミノ酸の活性エステルなどが生成する。 活性化剤は上記で例示したものを制限無く使用することができ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＣｔ、ＨＯＮｂ等が好ましい。活性化剤の使用量は、Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）に対して通常、０．０１〜１．２当量、好ましくは０．０５〜０．５当量である。 溶媒としては、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリルなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、酢酸エチルまたはＤＭＦが好ましい。溶媒の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対して、通常３〜５０倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。 反応温度は、通常−２０〜４０℃、好ましくは０〜２０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜２４時間である。 カップリング工程（１）反応終了後のワークアップは、カップリング工程（２）と同様であるので、後掲の１−３においてまとめて説明する。１−２．カップリング工程（２） 本発明のペプチド伸長反応のカップリング工程（２）においては、例えば、溶媒中において、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステル（以下、本明細書において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）」と総称する。）およびＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等を混合することによってＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）が得られる。添加順序は特に限定はないが、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が一つ前のペプチド伸長反応（ｎ−１）によって得られたものである場合は、反応容器中のＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等の溶液にＮ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）を添加すればよい。 Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）の使用量はカップリング工程（１）におけるＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）と同様である。 また、塩基、溶媒およびその使用量、反応温度、反応時間等のその他の反応条件は、カップリング工程（１）と同様である。１−３．カップリング工程（１）および（２）のワークアップ カップリング工程（１）およびカップリング工程（２）の反応終了後、「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等」を洗浄により淘汰し得る誘導体に導くため、または捕捉するために、好ましくは反応混合物にクエンチ剤が添加される。 クエンチ剤は上記で例示したものを制限無く使用することができ、ＤＭＰＤＡなどが好ましい。クエンチ剤の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対するＮ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）またはＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）の使用量の過剰使用量を考慮して決定すればよい。クエンチ剤の使用量は、当該過剰使用量に対して通常０．５〜５．０当量、好ましくは１．０〜３．０当量である。 クエンチ剤とＮ−保護アミノ酸活性エステル等との反応は、通常−２０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内で、１０〜６０分行えばよい。 カップリング工程（１）および（２）のワークアップでは、好ましくは、酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄が行われる。酸性水溶液洗浄により、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等とクエンチ剤との反応により生成する塩基性誘導体、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等、残留した縮合剤またはその分解物、塩基などを水層に淘汰することができる。塩基性水溶液洗浄により、活性化剤、残留したＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）などを水層に淘汰することができる。 酸性水溶液洗浄は、例えば、反応混合物を希塩酸水溶液（例えば、１Ｎ塩酸水溶液）、クエン酸水溶液、リン酸水溶液、硫酸水溶液などと攪拌後、分液して水層を除去することにより行われる。 塩基性水溶液洗浄は、エステル加水分解などの副反応を回避するため、あまり長時間かけて行わないようにするのが好ましい。なお、Ｎ末端が保護された状態のＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）の塩基性水溶液洗浄では、ジケトピペラジン生成の副反応はほとんど進行しない。 具体的には、反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液（例えば、５％炭酸水素ナトリウム水溶液）、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液などと攪拌後、分液して水層を除去することにより行われる。 必要に応じてさらに水洗し、有機層を濃縮することにより、Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）を得ることができ、そのまま容器から取り出すことなく、続くＮ末端脱保護工程に供することができる。また、濃縮することなく、Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）の溶液としてＮ末端脱保護工程に用いてもよい。 本発明のペプチド合成において、Ｂｏｃ、Ｚ以外のアミノ保護基を使用するカップリング工程が含まれる場合も、上記と同様に行えばよい。２．Ｎ末端脱保護工程２−１．Ｎ末端脱保護工程（Ｉ） 本発明のペプチド伸長反応におけるＮ末端脱保護工程（Ｉ）においては、Ｎ末端がＢｏｃで保護されたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）（以下、本明細書において「Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）」と称す。）を、溶媒中または無溶媒で、酸と反応させることによりＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）が得られる。具体的には、カップリング工程で得られたＮ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）の濃縮残査に酸を添加すればよい。 酸としては、トリフルオロ酢酸、塩酸、ギ酸、メタンスルホン酸、トシル酸などが挙げられ、トリフルオロ酢酸、ギ酸、塩酸が好ましい。 酸の使用量は、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）に対して、通常５〜１００当量、好ましくは１０〜５０当量である。この範囲より少ないと、未反応のＮ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）が残りやすく、多いと酸の除去操作に時間を要することとなる。 溶媒を使用する場合、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、ジオキサンなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチルが好ましい。溶媒の使用量は、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）に対して、通常３〜５０倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。トリフルオロ酢酸を酸として使用する場合は、無溶媒が好ましい。 反応温度は、通常−１０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜１５時間である。 反応終了後のワークアップでのｐＨ調整は、Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ）と同様であるので、後掲の２−３でまとめて説明する。２−２．Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ） 本発明のペプチド伸長反応におけるＮ末端脱保護工程（ＩＩ）においては、Ｎ末端がＺで保護されたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）（以下、「Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）」と称す。）を、酸性条件下、接触還元に付すことによりＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）が得られる。具体的には、カップリング工程で得られたＮ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）を、溶媒中、触媒存在下、水素還元条件又はギ酸等を添加する水素移動型還元条件にて脱保護させる。水素還元条件の場合、酸を添加しなくても反応は進行するが、酸を添加したほうが効率的である。 添加する酸としては塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、トシル酸などが挙げられる。酸の量は脱保護されて、遊離するアミノ基と等量以上になるように添加すればよい。 触媒としては、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、酸化白金、ルテニウム炭素、ロジウム炭素、ラネーニッケルなどが挙げられる。触媒の使用量は、Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）に対して、０．０１〜２００重量％の範囲から適宜選択すればよい。 溶媒としては、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、酢酸エチルが好ましい。溶媒の使用量は、Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）に対して、通常３〜５０倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。 水素還元条件の場合は、具体的には、水素雰囲気下、反応混合物を攪拌すればよい。水素圧は常圧〜１０気圧の範囲から適宜選択される。 水素移動型還元条件の場合は、ギ酸、ギ酸アンモニウム、シクロヘキサジエン、シクロヘキセン、トリイソプロピルシランなどの水素源が添加される。水素源の使用量は、Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）に対して、通常１〜１００当量であり、好ましくは１．５〜１０当量である。 反応温度は、通常−１０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜１５時間である。反応終了後、濾過により触媒を除去した後に、濾液をｐＨ調整に付せばよい。２−３．Ｎ末端脱保護後のワークアップでのｐＨ調整 Ｎ末端脱保護工程（Ｉ）または（ＩＩ）のワークアップでのｐＨ調整法としては特に限定はない。例えば、必要に応じて酸を減圧蒸留などによりある程度除去した後に、反応混合物のｐＨをモニターしながら、塩基（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなど）の水溶液を滴下して、所望のｐＨに調整する方法、予めｐＨを調整した緩衝液を加える方法、反応混合物を緩衝液中に加える方法またはそれらを組み合わせた方法などが挙げられる。好ましいｐＨ調製方法として、Ｎ末端脱保護工程後の反応混合物と塩基とを、ｐＨをモニターしながら同時に反応容器に添加する方法が挙げられる。反応容器には予め酢酸エチルと水との混合溶媒などの溶媒を加えておき、該溶媒中に反応混合物と塩基を加えてもよい。 また、ｐＨをモニターする必要がなく、簡便にｐＨを調整することができるので、緩衝液を加える方法も好ましい。反応混合物に酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸ブチルなどの溶媒を加えた後に、上記緩衝液で洗浄してもよい。使用する緩衝液としては、リン酸（リン酸２水素ナトリウム＋リン酸水素２ナトリウム）、トリス塩酸緩衝液（塩酸＋（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、酢酸緩衝液（酢酸＋ 酢酸ナトリウム）などが挙げられる。緩衝液の濃度は特に限定されず、０．５〜５Ｍの範囲から適宜選択すればよい。 ｐＨ調整後、反応混合物を攪拌し、液相を分離後、水層を除去する。有機層は必要に応じてさらに水洗し、濃縮することにより、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を得ることができ、そのまま容器から取り出すことなく、次のペプチド伸長反応に供することができる。また、濃縮することなく、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）の溶液として次のペプチド伸長反応に用いてもよい。 本発明のペプチド合成において、ＢｏｃおよびＺ以外のＮ末端保護基を使用したＮ末端脱保護工程が含まれる場合は、ペプチド合成化学で常用されるアミノ基保護基の種類に応じた一般的なＮ−末端脱保護方法により行えばよい。 以上のように、カップリング工程後に、反応混合物にクエンチ剤が添加されることで、酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄により簡便に不純物が除去され、さらにＮ末端脱保護工程の後に、反応混合物がｐＨ調整されることで、抽出により簡便に不純物等が除去されるため、ペプチドの液相合成法において、次の縮合工程、すなわち次のペプチド伸長反応を、中間体ペプチドを反応容器から取り出すことなく行うことができる。すなわち、得られた中間体ペプチドを晶析等により固体として単離せずに次の縮合工程を行うことができる。このように本発明の方法によれば、ペプチドの液相合成法により、目的とする最終ペプチドをワンポット合成することが可能である。３．最終脱保護工程 本発明のペプチド合成で、目的のペプチドまで構築されたＣ−保護ペプチド（Ｐｍ）のＰＧ０や側鎖保護基を脱保護することにより、目的のペプチド（Ｐ）を得ることができる。 最終脱保護工程は、ＰＧ０または側鎖保護基の種類に応じた自体公知の脱保護法を特に制限なく採用することができる。 例えば、Ｍｅ、Ｅｔなどの低級アルキル基の場合は、水性有機溶媒や極性有機溶媒などの溶媒中、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基と、０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。 ｔＢｕの場合は、クロロホルム、酢酸エチルなどの溶媒中、トリフルオロ酢酸、塩酸などの酸と、０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。 Ｂｚｌの場合は、メタノールやＤＭＦなどの溶媒中、パラジウム炭素などの触媒を用いて、０〜５０℃で、１〜５０時間、水素化反応させるか、あるいは、フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸、ＨＢｒなどの強酸と、−２０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。 最終脱保護工程において、Ｂｏｃ基またはＺ基で保護された側鎖アミノ基を脱保護する場合も、Ｎ末端脱保護工程と同様にワークアップにおいて反応混合物のｐＨを調整して行うことができる。 本発明の方法により、合成されたペプチド（Ｐ）は、ペプチド化学で常用される方法に従って単離精製することができる。例えば、最終脱保護工程のワークアップにおいて、反応混合物を濃縮、沈殿化、イオン交換、ＨＰＬＣ精製などのクロマト精製などによって、ペプチド（Ｐ）を単離精製することができる。 以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。 ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った。カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ-Ａ−３０２ １５０×４．６ｍｍ １２ｎｍ， １５μｍ溶離液：Ａ液 ０．１％ＴＦＡ水 Ｂ液 ０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮカラム温度：４０℃流速 １ｍｌ／ｍｉｎ波長：２２０ｎｍ参考例１ Ｈ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ．ＴｓＯＨ（１０．０ ｇ， ２８．４６ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（６．７４ ｇ， ３１．３０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．４３ ｇ， ３．１３ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（５．３５ ｇ， ３４．４６ｍｍｏｌ）を加えて３時間攪拌した。 酢酸エチル（１５０ ｍｌ）を加え、混合物を５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し有機層を濃縮した。残渣にヘキサンを加えて攪拌して析出物を濾取し減圧乾燥させて、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ（９．３８ｇ， ２４．９１ｍｍｏｌ）を得た。比較例１ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ （２．５０ ｇ， ６．６４ ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（２１ ｍｌ）を氷冷下で加えて１．５時間攪拌させた。反応液を減圧濃縮して、残渣油状物に酢酸エチル（３３ ｍｌ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層にＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ （１．７５ ｇ， ７．３０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１０ ｇ， ０．７４ ｍｍｏｌ）を溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５４ ｇ， ８．０３ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して２時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析したところ、目的物であるＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌは痕跡量しか認められなかった。比較例２ Ｈ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅ．２ＨＣｌ(Ｄ−３−ピリジルアラニンメチルエステル塩酸塩)（１．０ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｐａ−ＯＨ（Ｂｏｃ−Ｄ−４−クロロフェニルアラニン）（１．１９ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０５３ ｇ， ０．４０ ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（６ ｍｌ）と水 （０．６ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（０．６８ ｇ， ４．３７ ｍｍｏｌ）を加え、１６時間攪拌させた。反応液に酢酸エチル（３０ ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮した。残渣にトリフルオロ酢酸 （１０ ｍｌ）を加え、２時間攪拌させ、減圧濃縮した。残渣油状物に酢酸エチル（２０ ｍｌ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を濃縮したところ、Ｈ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅが得られたが、ＨＰＬＣ分析したところ、加水分解したＨ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＨが含まれていた。実施例１ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ （２．５０ ｇ， ６．６４ ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（２１ ｍｌ）を氷冷下で加えて１．５時間攪拌させ、反応液を減圧濃縮して残査油状物に酢酸エチル（３３ ｍｌ）を加え、ｐＨ５．５の２Ｍリン酸バッファーにて洗浄した。水層を酢酸エチル（２０ ｍｌ）で抽出し、有機層に混ぜ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ （１．７５ ｇ，７．３０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１０ｇ， ０．７４ｍｍｏｌ）を加えて、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５４ ｇ， ８．０３ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して２時間攪拌した。反応液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸及び飽和食塩水にて順次洗浄し、得られた有機層を濃縮し、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌを収率９４％で得た。実施例２ Ｈ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ．ＴｓＯＨ（２．２８ ｇ， ６．５０ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ （１．５４ ｇ， ７．１５ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１ ｇ， ０．７４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル （３５ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（１．２２ ｇ， ７．８７ ｍｍｏｌ）を加えて３時間攪拌した。 反応液に ＤＭＰＤＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン）（０．１６ ｍｌ， １．５８ｍｍｏｌ）を加えて３０分間攪拌し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮した。得られた残査にトリフルオロ酢酸 （１１ ｍｌ）を加えて氷冷下で１時間攪拌して、濃縮乾固した。残渣に酢酸エチル（３５ ｍｌ）を加え、混合物をｐＨ５．５のリン酸バッファーにて洗浄した。水層を酢酸エチル（２０ ｍｌ）で抽出し、最初の有機層と混ぜて、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ （１．５６ ｇ， ６．５０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０８ ｇ ０．７４ ｍｍｏｌ）を加えて、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．１１ ｇ， ７．１５ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して１６時間攪拌した。反応液にＤＭＰＤＡ（０．１６ ｍｌ， １．５８ｍｍｏｌ）を加えて３０分間攪拌し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸及び飽和食塩水にて順次洗浄し、得られた有機層を濃縮し、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌを収率８８％(ｖｓ Ｈ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ)で得た。実施例３ Ｈ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅ．２ＨＣｌ（Ｄ−３−ピリジルアラニンメチルエステル塩酸塩）（１．０ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｐａ−ＯＨ （Ｂｏｃ−Ｄ−４−クロロフェニルアラニン）（１．１９ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０５３ ｇ， ０．４０ ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（６ ｍｌ）と水（０．６ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（０．６８ ｇ， ４．３７ ｍｍｏｌ）を加え、１６時間攪拌させた。反応液に酢酸エチル（３０ ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し有機層を濃縮した。残渣にトリフルオロ酢酸 （１０ ｍｌ）を加え、２時間攪拌させ、減圧濃縮した。残渣油状物に酢酸エチル（２０ ｍｌ）を加え、ｐＨ５．５のリン酸バッファーで洗浄し、有機層をＨＰＬＣ分析したところ、加水分解体のＨ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＨは検出されなかった。濃縮してＤＭＦ（６ ｍｌ）、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−ＯＨ（アセチル−Ｄ−ナフチルアラニン）（０．９２ ｇ， ３．５６ ｍｍｏｌ）及びＨＯＯＢｔ（ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン）（０．５８ ｇ， ３．５６ ｍｍｏｌ）を加えて、氷冷下にてＥＤＣ（０．６１ ｇ， ３．９１ ｍｍｏｌ）を滴下して、１６時間室温で攪拌した。反応液に水（３０ ｍｌ）を加え炭酸ナトリウムにてｐＨ８に調整して析出物を濾過して減圧乾燥させ、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅ （１．６６ ｇ， ２．７７ ｍｍｏｌ）を得た。実施例４ Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＭｅ．ＨＣｌ（Ｄ−アラニンメチルエステル塩酸塩）（０．２５ ｇ， １．７９ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０．３９ ｇ， １．７９ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０２４ ｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（０．３１ ｇ, １．９７ ｍｍｏｌ）を加え、１６時間攪拌させた。酢酸エチル（１０ ｍｌ）を加え、塩化ナトリウムを加えた５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、水層に酢酸エチルを加えて抽出して、有機層を合わせて濃縮した。残渣にトリフルオロ酢酸（５ ｍｌ）を加え、２時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣油状物に酢酸エチル（１０ ｍｌ）を加え、ｐＨ５．５の２Ｍリン酸バッファーを加え、Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ５．５に調整して塩化ナトリウムを加えて分層させた。有機層に、Ｚ−（ｉＰｒ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．６１ ｇ， １．４３ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０２０ ｇ， ０．１４ ｍｍｏｌ）を添加して、ＥＤＣ（０．２５ ｇ， １．５７ ｍｍｏｌ）を氷冷下で加えて１６時間攪拌した。反応液を、塩化ナトリウムを加えた５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた有機層を濃縮して、Ｚ−（ｉＰｒ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＭｅ（０．７６ｇ， １．２５ｍｍｏｌ）を得た。 本発明の方法は、ペプチド医薬品などの工業的製造に好適に利用できる。 本出願は、日本で出願された特願２００７−１９３３３１を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。 本発明がその好ましい態様を参照して提示又は記載される一方、本明細書中において、添付の請求の範囲で包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態や詳細の様々な変更をなし得ることは当業者に理解されるであろう。本明細書中に示され又は参照されたすべての特許、特許公報及びその他の刊行物は、参照によりその全体が取り込まれる。 液相合成法によるペプチドの製造方法において、（Ｉ）Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチドを酸と反応させることにより脱保護した後、または（ＩＩ）Ｚ−ＮＨ基を含むペプチドを酸性条件下で接触還元に付すことにより脱保護した後に、反応混合物のｐＨを４〜７に調整する工程を含むことを特徴とする方法。 ｐＨを５〜６に調整する、請求項１に記載の方法。 ペプチドのＣ末端アミノ酸残基がプロリンもしくはシステイン、および／またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンである、請求項１または２に記載の方法。 ペプチドのＣ末端がメチルエステル又はエチルエステルで保護されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。（１）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸と、縮合剤の存在下縮合させる工程、および／または（２）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルと縮合させる工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 請求項５の（１）の縮合工程において、活性化剤をさらに存在させる、請求項５記載の方法。 請求項５記載の縮合工程の後、反応混合物を酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄する工程をさらに含む、請求項５または６記載の方法。 請求項５記載の縮合工程の後、反応混合物をクエンチ剤で処理する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。 クエンチ剤がＤＭＰＤＡである、請求項８記載の方法。 請求項１記載の工程で得られた中間体ペプチドを固体として単離せずに請求項５記載の工程に供することを含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。 ワンポット合成で行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。