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氏内 圭一 JP 2011110025 公開特許公報(A) 20110609 2009272061 20091130 抗酸菌の溶菌方法 東洋紡績株式会社 000003160 風早 信昭 100103816 浅野 典子 100120927 氏内 圭一 C12Q 1/68 20060101AFI20110513BHJP C12N 15/09 20060101ALI20110513BHJP JPC12Q1/68 AC12N15/00 AC12N15/00 A 4 ＯＬ 8 4B024 4B063 4B024AA13 4B024CA20 4B024HA12 4B024HA20 4B063QA18 4B063QA19 4B063QQ06 4B063QQ42 4B063QR08 4B063QR32 4B063QR42 4B063QR50 4B063QR62 4B063QS14 4B063QS25 本発明は、結核菌に代表される抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で安全かつ安価に溶菌する方法に関する。 結核は、日本でも復活の兆しを見せている細菌性疾患であり、その診断方法の改良は、極めて重要である。結核の診断方法としては、近年、数週間もの時間のかかる培養検査に代わって、短時間で高精度の結果が得られる遺伝子検査が行われるようになっている。 結核の遺伝子検査は、結核菌の遺伝子に特異的なプライマーを使用したＰＣＲにより、喀痰試料中の結核菌の存在を同定することによって行われる。遺伝子検査を行うには、前処理として、試料中の検査対象の菌細胞を溶菌（破壊）し、次いでその核酸を抽出することが必要である。 しかし、結核菌に代表される抗酸菌は、ミコール酸の脂質層を含む強固な細胞壁を持つため、大腸菌などの一般的な細菌と比較して溶菌が困難である。 抗酸菌の一般的な溶菌方法としては、特許文献１に記載のような超音波を使用した物理的細胞破壊方法が挙げられる。この方法は、抗酸菌を効率良く溶菌することができるが、超音波照射装置という高価な装置を必要とすると共に、超音波照射の際に試料が周囲に飛び散り、試料に含まれる菌により周囲環境が汚染される問題がある。また、超音波照射は、強度の制御が困難であり、菌細胞を破壊するのみならず、細胞中のゲノムＤＮＡまで切断してしまう場合もある。 一方、化学的細胞破壊による抗酸菌の溶菌方法としては、フェノールを溶菌剤として使用して菌細胞を破壊する方法が挙げられる。この方法も、抗酸菌を効率良く溶菌することができるが、操作が煩雑であり、専門的な知識を必要とするため、臨床の場にそぐわないという問題がある。また、この方法は、フェノールという毒物を使用するため、作業者の安全性に欠けるという問題もある。 また、特許文献２には、溶菌剤など溶菌のための薬剤を用いることなしに、６０〜１００℃に加熱することのみによる抗酸菌の溶菌方法が開示されている。この方法では、抗酸菌の溶菌が可能であるものの、その溶菌効率は低く、実用的とは言えない。また、実施例では９４℃程度の高温加熱が必要であるとされており、このような高温で加熱すると、試料溶液が強く蒸発し、蒸気に混入した菌により周囲環境が汚染される問題もある。 このように、従来公知の抗酸菌の溶菌方法は、費用がかかったり、操作が煩雑であったり、安全性に欠けたり、溶菌効率が低かったりという問題を有し、いずれも満足できるものではなかった。ＷＯ ２００７／０９４５０６特開平６−３１９５２７ 本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、強固な細胞壁のために溶菌しにくい抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で低コストかつ安全に溶菌することができる方法を提供することにある。 本発明者は、上記目的を達成するために、まず、抗酸菌の溶菌のための溶菌剤として、従来使用されていないカオトロピック塩の効果を検討してみた。カオトロピック塩は、通常の細胞の溶菌には効果があるが、強固な細胞壁を持つ抗酸菌に対してはほとんど効果がなかった。そこで、本発明者は、カオトロピック塩の細胞溶菌効果を増大させるために適切な処理についてさらに検討した結果、特定の温度まで加熱したカオトロピック塩の溶液を使用すると、強固な細胞壁を持つ抗酸菌であっても容易に溶菌されることを見出した。 本発明は、上述の知見に基づいてなされたものであり、具体的には、４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液によって抗酸菌を溶菌することを特徴とする抗酸菌の溶菌方法である。 本発明の好ましい態様によれば、溶液中のカオトロピック塩の濃度は２〜６Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）であり、カオトロピック塩の溶液のｐＨは４．５〜６．５であり、カオトロピック塩の溶液は０．１〜２．０Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度の酢酸塩をさらに含む。 本発明の方法は、抗酸菌の溶菌のために特定の温度に加熱されたカオトロピック塩の溶液を使用するので、従来溶菌が困難であった抗酸菌を効率良く溶菌することができる。また、本発明の方法は、特定の温度のカオトロピック塩の溶液で抗酸菌を処理するだけで行われるので、操作が簡便でコストがかからず、安全である。 以下、本発明の抗酸菌の溶菌方法を詳細に説明する。 本発明の方法は、特定の温度まで高められたカオトロピック塩の溶液で抗酸菌を溶菌することを特徴とするものであり、取扱いが安全で操作が簡便であることを特徴とする。 本発明の方法の溶菌対象となる抗酸菌としては、例えば、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）及びスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を挙げることができる。 本発明の方法で使用されるカオトロピック塩は、タンパク質などの分子構造を不安定化する性質を持つ化学物質であり、生化学の分野において核酸抽出の際に細胞を溶解させる溶菌剤として使用される物質である。カオトロピック塩としては、従来公知のいかなるものも使用することができ、例えば、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、アンモニウムイソチオシアネート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウムであることができる。これらの中でも、細胞溶解性と核酸回収効率の点からグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアン酸塩（チオシアン酸グアニジン）、グアニジン硫酸塩、イソチオシアン酸グアニジンが挙げられ、これらの中でも、溶菌効率の点から塩酸グアニジンまたはグアニジンチオシアン酸塩が好ましい。これらの塩は、単独でも、複数組合わせて用いてもよい。 カオトロピック塩は溶液状態で使用され、カオトロピック塩を水や緩衝液などの適当な溶媒に溶解することによって容易に溶液に調製することができる。 溶液中のカオトロピック塩の濃度は、２〜６Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）であることが好ましく、さらに好ましくは３〜５Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）である。溶液中のカオトロピック塩の濃度が上記下限未満では、抗酸菌細胞壁の溶解効率が低下するおそれがあり、また、上記上限を超えると、カオトロピック塩が析出するおそれがある。 カオトロピック塩の溶液のｐＨは、４．５〜６．５であることが好ましく、さらに好ましくは５．０〜６．０である。カオトロピック塩の溶液のｐＨが上記下限未満になるかまたは上記上限を超えると、後工程である核酸精製（分離抽出）時の核酸吸着効率が低下するおそれがある。 カオトロピック塩の溶液のｐＨを上述の範囲に維持するためには、溶液に適当な緩衝剤を添加することが好ましい。かかる緩衝剤としては、例えば、酢酸塩を挙げることができる。酢酸塩の中でも、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの一価の金属の酢酸塩が特に効果的である。これらの酢酸塩の溶液中の濃度は、０．１〜２．０Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）であることが緩衝効果の点で好ましい。 本発明の方法では、カオトロピック塩の溶液をそのまま常温で使用するのではなく、特定の温度に加熱して使用することが重要である。加熱温度は、４０〜９０℃であり、好ましくは５０〜７５℃である。加熱温度が上記下限未満では、カオトロピック塩の溶解効果が得られないおそれがあり、また、上記上限を超えると、液の蒸発が増加しカオトロピック塩の濃度変化が生じるおそれがある。 加熱方法としては、特に限定されないが、カオトロピック塩の溶液を適当なチューブに入れ、ヒートブロック、ウォーターバス、マイクロウェーブオーブン、エアーバス等の公知の加熱手段で加熱する方法が挙げられる。抗酸菌は、最初からカオトロピック塩の溶液に添加しておいてもよいし、カオトロピック塩の溶液が所定の温度に加熱されてから添加してもよい。遺伝子検査の前処理で使用する通常の液量では、カオトロピック塩の溶液は、ごく短時間で所定温度に加熱されるので、最初から抗酸菌をカオトロピック塩の溶液に添加しておく方が作業が簡略化できる。 抗酸菌の溶菌時間は、１〜１０分間であることが好ましく、さらに好ましくは３〜７ 分間である。抗酸菌の溶菌時間が上記下限未満では、カオトロピック塩の溶解効果が得られないおそれがあり、また、上記上限を超えると、カオトロピック塩中に存在するゲノムＤＮＡが分解するおそれがある。 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。実施例１（１）抗酸菌の準備 抗酸菌としては、ウシ型結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ株（以下、ＢＣＧ株と略す）を使用した。ＢＣＧ株を３％小川培地（日水製薬製）中で３５℃で２週間培養した後、抗酸菌培養用の液体培地であるＭｙｃｏＢｒｏｔｈ（極東製薬工業製）に接種し、３７℃で６日間さらに培養した。分散性の高い菌液を得るため、培養後の液体培地を孔径５μｍの親水性フィルターでろ過した後、濁度計でＯＤ６００を測定しながら、マクファーランド比濁法に従ってマクファーランド１の濃度に菌液を調整した。次に、液体培地中に既に遊離している核酸を除去するため、この菌液１．０ｍＬを１．５ｍＬのチューブに加え、遠心分離操作で菌体だけを沈殿させ、上清を取り除いて１．０ｍＬのリン酸緩衝液で菌体を再懸濁させた。（２）カオトロピック塩の溶液の調製 カオトロピック塩としてのグアニジンチオシアン酸及び緩衝剤としての酢酸カリウムを脱イオン水に溶解させ、緩衝剤を含有するカオトロピック塩の溶液を調製した。溶液中のグアニジンチオシアン酸の濃度は、５Ｍであり、酢酸カリウムの濃度は、０．８Ｍであり、溶液のｐＨは５．５であった。（３）抗酸菌の溶菌 （２）で調製したカオトロピック塩の溶液５００μＬに、（１）で準備したマクファーランド１の菌液をリン酸緩衝液で１０００倍に希釈したものを混合した。混合液を１．５ｍＬのスクリュー付蓋のあるチューブに入れ、ヒートブロック上で６０℃で５分間加熱し、抗酸菌を溶菌した。（４）核酸の分離抽出 次に、混合液を室温まで冷却し、溶菌により混合液中に溶出した抗酸菌の核酸を、モノリス構造体を使用して分離抽出した。具体的には、ジーエルサイエンス製のモノリスチップ「Ｍｏｎｏ Ｔｉｐ Ｃ１８」のチップ形状と同じ２５０μＬチップ内にモノリス構造体（細孔径３０μｍ、切断面積３．１４平方ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を溶着したものをテルモ製の１ｍＬシリンジに装着し、冷却後の混合液を１００μＬ／秒の速度で１０回吸引および吐出し、混合液中の抗酸菌の核酸をモノリスチップ中のモノリス構造体に吸着させた。混合液を完全に出し切った後に、洗浄液５００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、洗浄液を１００μＬ／秒の速度で３回吸引および吐出して洗浄した。この洗浄工程をもう一度繰り返した。最後に溶出液１００μＬの入ったチューブにモノリスチップを移動させ、溶出液を１００μＬ／秒の速度で５回吸引および吐出して、モノリスチップ中のモノリス構造体に吸着した抗酸菌の核酸を溶出した。溶出効率の低下を抑えるため、吸引および吐出の間は、チップ内のモノリス構造体に空気が接触しないように注意した。なお、洗浄液としては、７０％エタノール中の０．８Ｍ酢酸カリウム溶液を使用し、溶出液としては、１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を使用した。（５）リアルタイムＰＣＲによる、抗酸菌遺伝子の検出及び定量 次に、（４）で得た核酸溶出液を対象として、リアルタイムＰＣＲにより抗酸菌遺伝子の検出及び定量を行った。ＰＣＲの試薬組成、並びにＰＣＲ条件は、以下に示す通りであった。試薬組成： オリゴ１ ２５０ｎＭ、 オリゴ２ １５００ｎＭ、 オリゴ３（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識されている） ２５０ｎＭ、 ×１０緩衝液 １μＬ、 ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、 ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、 ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、 溶出液 １μＬ（ミリＱ水で全量を１０μＬに調整する）（オリゴ１〜オリゴ３の配列は、配列表の配列番号１〜３に示される通りである。）ＰＣＲ条件： 熱変性：９４℃・２分、９８℃・０秒、アニーリング：６０℃・５秒（蛍光検出）、５０サイクル 上記試薬組成は、ＢＣＧ株を特異的に検出できるプライマーとプローブの組み合わせである。陽性コントロールとして、ＢＣＧ株からフェノール・クロロホルム法で抽出したゲノムＤＮＡを１０ｍＭトリス緩衝液で１μＬ中に１０００コピー含むように希釈したものを使用した。リアルタイムＰＣＲは、増幅産物とプローブがハイブリダイゼーションするとプローブに標識された蛍光色素の蛍光が消光することに基づいてサンプル中の特定の核酸配列を検出するものである。核酸の増幅及び検出には、ロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは、５３０ｎｍを利用し、得られたリアルタイム検出データを利用して、アニーリング時のＱＰｒｏｂｅ消光率を算出した。さらに、消光率２％に達したサイクル数を求めて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ法と同様にして解析を行った。抗酸菌の核酸の回収効率は、加熱なしの時の検出を１とした相対値で算出した。結果を表１に示す。実施例２ （３）の抗酸菌の溶菌時の加熱温度を７０℃に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。実施例３ （３）の抗酸菌の溶菌時の加熱温度を８０℃に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。実施例４ （３）の抗酸菌の溶菌時の加熱温度を９０℃に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。実施例５ カオトロピック塩としてグアニジンチオシアン酸の代わりに塩酸グアニジンを使用した以外は、実施例２と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。実施例６ （３）の抗酸菌の溶菌時の処理時間を１０分に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。実施例７ （３）の抗酸菌の溶菌時の処理時間を２分に変更した以外は、実施例１と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。比較例１ （３）の抗酸菌の溶菌時に溶液の加熱を行わず、常温（２５℃）で処理した以外は、実施例２と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。比較例２ カオトロピック塩の溶液の代わりにミリＱ水を使用した。ミリＱ水中で抗酸菌を７０℃で５分間加熱した後、モノリス構造体による核酸の分離抽出の直前にグアニジンチオシアン酸を実施例２と同じ濃度になるように追加した。それ以外は、実施例２と同様にして、抗酸菌の核酸の回収効率を算出した。結果を表１に示す。 表１から、４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液で処理された実施例１〜７では、常温の溶液で処理された比較例１、及びカオトロピック塩の溶液を使用しなかった比較例２と比較して、核酸の回収効率が顕著に高いことが理解できる。従って、本発明によれば、特定の温度に加熱されたカオトロピック塩の溶液で処理することにより、抗酸菌を効率的に溶菌することができることが明らかである。 本発明の方法は、強固な細胞壁のために溶菌が困難であった抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で低コストかつ安全に溶菌することができるので、結核菌の遺伝子検査の前処理などに極めて有用である。 配列番号１は、実施例でオリゴ１として記載した設計されたポリヌクレオチドの配列である。 配列番号２は、実施例でオリゴ２として記載した設計されたポリヌクレオチドの配列である。 配列番号３は、実施例でオリゴ３として記載した設計されたポリヌクレオチドの配列である。 ４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液によって抗酸菌を溶菌することを特徴とする抗酸菌の溶菌方法。 溶液中のカオトロピック塩の濃度が２〜６Ｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。 カオトロピック塩の溶液のｐＨが４．５〜６．５であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 カオトロピック塩の溶液が０．１〜２．０Ｍの濃度の酢酸塩をさらに含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 【課題】 結核菌などの抗酸菌を効率良く、しかも簡便な操作で低コストかつ安全に溶菌することができる方法を提供する。【解決手段】 ４０〜９０℃の温度のカオトロピック塩の溶液によって抗酸菌を溶菌することを特徴とする抗酸菌の溶菌方法。好ましくは、溶液中のカオトロピック塩の濃度は２〜６Ｍであり、カオトロピック塩の溶液のｐＨは４．５〜６．５であり、カオトロピック塩の溶液は０．１〜２．０Ｍの濃度の酢酸塩をさらに含む。【選択図】 なし配列表

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