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市川 明 JP 5553280 特許公報(B2) 20140606 2009075447 20090326 メラノサイト腫瘍の検出方法 学校法人順天堂 502285457 特許業務法人アルガ特許事務所 110000084 有賀 三幸 100068700 高野 登志雄 100077562 中嶋 俊夫 100096736 村田 正樹 100117156 山本 博人 100111028 市川 明 20140716 C12Q 1/04 20060101AFI20140626BHJP C12Q 1/26 20060101ALI20140626BHJP JPC12Q1/04C12Q1/26 Ｃ１２Ｑ １／００−１／６８ ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＰｕｂＭｅｄ British Journal of Dermatology，２００４年，Vol.150，p.1081-1090 British Journal of Cancer，１９９８年，Vol.78, No.9，p.1156-1161 Histochemistry，１９７６年，Vol.49，p.81-93 Neuroscience，１９７６年，Vol.1，p.451-453 2 2010226972 20101014 11 20120322 福澤 洋光 本発明は、メラノサイト又はメラニン性腫瘍中のチロシナーゼ活性を迅速かつ高感度で測定する方法及びメラノサイト腫瘍の検出方法に関する。 悪性黒色腫に代表されるメラノサイトの腫瘍の治療方法としては、腫瘍の切除が最も多く行われている。そして、メラノサイトの腫瘍の診断は、組織学的検査、免疫組織学的検査、酵素組織学的検査（ＤＯＰＡオキシダーゼ）が広く採用されている。特に、メラノサイトの腫瘍においては、チロシナーゼ（３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンオキシダーゼ：ＤＯＰＡオキシダーゼ）活性の組織学的検出が有用である。当該ＤＯＰＡオキシダーゼの組織学的検出手段としては、Ｂｌｏｃｈらの方法（非特許文献１）、Ｌａｉｄｌａｗ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ法（非特許文献２）、Ｂｅｃｋｅｒ法（非特許文献３）、Ｒａｄａｅｌ法（非特許文献４）及びＩｉｇｉｍａ ａｎｄ Ｗａｔａｈａｂｅ法（非特許文献５）が知られている。Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｓｙｐｈ．１９１７；１２４：２２６−２５４Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１９３２；８：４９−４９８Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｓｙｐｈ．１９３５；３１：１９０−１９５Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍ．Ｓｙｐｈ．１９５３；６８：６６８−６７１Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．１９５６；２６：２３５−２３７ しかしながら、これら従来の方法においては、（１）アッセイ時間が長い、（２）特殊な設備や試薬を必要とする、（３）技術者の熟練が必要であり、（４）診断結果にバラツキがある等の問題があった。また、悪性腫瘍でなく、炎症細胞も偽陽性と判断されてしまうという問題もあった。 従って、迅速かつ簡便で、しかも正確にメラノサイトの悪性腫瘍だけを検出可能な組織学的手段が求められていた。 そこで本発明者は、メラノサイト組織検体にＤＯＰＡを作用させ、次いでグリオキシル酸を反応させると自家蛍光を発することに注目して、その蛍光強度を観察することにより、メラノサイト中のＤＯＰＡオキシダーゼ（チロシナーゼ）活性が選択的かつ短時間で測定できること、及び蛍光強度を正常メラノサイトの場合と対比すれば、悪性腫瘍が正確に、断端部まで明確に検出できることを見出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、被検細胞含有検体にＤＯＰＡを作用させ、次いでグリオキシル酸を反応させて蛍光強度を測定することを特徴とするメラノサイト腫瘍の検出方法を提供するものである。 また、本発明は、メラノサイト又はメラニン性腫瘍細胞含有検体にＤＯＰＡを作用させ、次いでグリオキシル酸を反応させて蛍光強度を測定することを特徴とする被検メラノサイト又はメラニン性腫瘍細胞のチロシナーゼ活性の測定方法を提供するものである。 本発明方法によれば、メラノサイトの悪性腫瘍が、特殊な設備や試薬を用いることなく、極めて短時間で、かつ簡便な操作によって、正確に検出できる。また、良性腫瘍及び炎症細胞との鑑別が正確にできるので、不必要な手術をする危険性を回避できる。ＤＯＰＡ−ＧＡ法におけるＤＯＰＡオキシダーゼ反応時間と、正常皮膚のメラノサイト（メラニン細胞）を用いたＤＯＰＡ−ＧＡ法とＬ−Ｂ法の比較を示す。（Ａ）ＤＯＰＡ−ＧＡ法におけるＤＯＰＡオキシダーゼ反応時間。（Ｂ）Ｌ−Ｂ法、ＤＯＰＡ−ＧＡ法のＤＯＰＡオキシダーゼ反応の至適反応時間。（Ｃ）自動酸化もしくはペルオキシダーゼによる非特異的ＤＯＰＡ反応陽性細胞。各症例におけるＤＯＰＡ−ＧＡ陽性細胞の特徴を示す。 悪性メラノーマのリンパ節転移細胞の場合を２−１及び２−２に示す。 悪性メラノーマの腫瘍を２−３及び２−４に示す。 真皮内母斑の場合を２−５及び２−６に示す。 色素異常症の場合を２−７及び２−８（２−７の拡大図）に示す。悪性メラノーマの辺縁部におけるＤＯＰＡ−ＧＡ法とＬ−Ｂ法の比較を示す。（Ａ）ＤＯＰＡ−ＧＡ法、Ｌ−Ｂ法でみた水平方向切断切片。（Ｂ）ＤＯＰＡ−ＧＡ法、Ｌ−Ｂ法でみた垂直方向切断切片。メラニン形成の生合成スキームを示す。 本発明の測定対象検体は、メラノサイト又はメラニン性腫瘍細胞を含有する組織である。例えば、メラノーマが疑われる皮膚組織、メラニン非産生メラノーマ組織、メラノーマ転移組織（リンパ節等）、メラニン生合性研究培養細胞株が用いられる。このような組織や細胞は、検査のために採取した組織や培養細胞株が用いられる。 組織検体は、例えば凍結組織切片とする。凍結組織切片の作製は、通常−２０℃以下で４〜６μｍの凍結切片を作製すればよく、クリオスタットを用いて行うのが簡便である。クリオスタットを用いれば、何ら熟練を必要とすることなく、４〜６μｍ幅の凍結切片が容易に得られる。 組織検体にＤＯＰＡを作用させる。具体的には、組織検体にＬ−ＤＯＰＡ溶液を添加すればよい。作用温度は細胞中の酵素が作用する温度、例えば３５〜４０℃、特に３７℃が好ましい。Ｌ−ＤＯＰＡ溶液としては、０．１重量％Ｌ−ＤＯＰＡリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）が好ましい。作用時間は、３〜８分間、特に５分間でよい。 組織にＤＯＰＡを作用させれば、細胞中のＤＯＰＡオキシダーゼの作用により、ＤＯＰＡはドーパキノンに変換される。また、細胞中のＤＯＰＡデカルボキシラーゼにより、ＤＯＰＡはドーパミンにも変換されると考えられる。 次に、組織検体に、グリオキシル酸を反応させる。具体的にはスクロース、リン酸水素カリウム及びグリオキシル酸の混合溶液を添加する。スクロース濃度は０．１〜０．５Ｍ、特に０．２Ｍが好ましく、リン酸水素カリウム濃度は０．１〜０．４Ｍ、特に０．２３６Ｍが好ましく、グリオキシル酸濃度は０．５〜２．０重量％、特に１．０重量％が好ましい。反応温度は、７０〜８５℃、特に８０℃で行い、反応時間は５分程度でよい。その後ミネラルオイルで封入した後、気泡を除くため８０℃で９０秒加温し、蛍光を蛍光顕微鏡で観察すればよい。 陽性細胞は、蛍光顕微鏡下で蛍光を肉眼観察すればよく、また画像解析装置により蛍光強度を定量してもよい。 メラノサイトのうち、悪性腫瘍は蛍光強度が強く従来法（ＤＯＰＡオキシダーゼ反応）に比較して明確に観察される。また、悪性腫瘍の蛍光強度は、良性腫瘍に比べても明瞭に強い蛍光強度を示した。また、従来法で観察される炎症細胞の偽陽性は、まったく観察されなかった。従って、本発明方法によれば、悪性腫瘍が正確かつ簡便に検出可能である。 また、本発明により観察される蛍光は、メラノサイトのチロシナーゼ活性を反映しており、本発明によりメラノサイトのチロシナーゼ活性が測定できる。このことは、従来からメラノーマは高チロシナーゼ活性であることが知られているが、本発明により組織を用いても証明される。 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。実施例１Ａ．材料と方法（１）患者と材料 順天堂大学医学部（日本、東京）にて、生検あるいは外科手術により９サンプルを得た。うち４サンプルが悪性メラノーマ（黒色腫）（リンパ節転移が１サンプル、他３サンプルが皮膚の原発性悪性メラノーマ）、５サンプルが良性腫瘍（真皮内母斑が１サンプル、青色母斑が２サンプル、慢性皮膚腫瘍が２サンプル）と診断された。各サンプルのうち半量を本研究に使用し、残りの半量を通常の病理検査にかけた。新生物部位と正常部位を同時に採取した。サンプルは、クリオスタットを使用した凍結切片作成のため−８０℃で保存した。本研究は、研究倫理委員会の承認を得て行った。（２）従来のＤＯＰＡオキシダーゼ反応 ＤＯＰＡ−ＧＡ法の比較対照として、Ｌａｉｄｌａｗ−Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ法（Ｌ−Ｂ法）を実施した（非特許文献４）。（３）ＤＯＰＡ−ＧＡ法（本発明方法） マウントした新鮮材料を、内在性チロシナーゼ及び小分子の拡散を防ぐため、液体窒素中で急速冷凍し、クリオスタットを用いて−２０〜−３０℃にて４〜６μｍ幅の切片とし、ガラススライドに載せて風乾した。各切片は、３７℃で０．１％Ｌ−ＤＯＰＡ溶液（１／１５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４）に浸した。ＤＯＰＡオキシダーゼ反応を５分間行った後、切片を滅菌水中で３回洗浄（各１分）し、ＤＯＰＡ反応を止めた。その後直ちに、室温にて各切片をＳＰＧ混合溶液に３回浸した（各１秒）。スライドを４５°に傾け、ヘアドライヤーの冷風で３〜５分乾燥させながら、過剰なＳＰＧ溶液を、吸着紙を使ってスライドから除いた。スライドを８０℃のホットプレート上に５分間載せた後、ミネラルオイルをサンプル上に載せ、さらにカバーグラスをかぶせた。カバーグラスをしたスライドを８０℃のホットプレート上に９０秒置き、空気の泡を除去した。最後に、組織蛍光を顕微鏡で観察した（フィルター励起光：４１０、蛍光：４８０、ＦＩＴＣの場合と同じ）。ＳＰＧ混合溶液：０．２Ｍスクロース、０．２３６Ｍリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１％グリオキシル酸一水和物（４）ＤＯＰＡ−ＧＡ法におけるＤＯＰＡ反応時間 正常皮膚を用い、ＤＯＰＡ−ＧＡ法におけるＤＯＰＡ反応の至適時間を決定する必要があった。ＤＯＰＡ反応時間を変化させ（０、１、５、１０、１５、３０分、３７℃）、ＳＰＧ法を実施し、蛍光が最も強くなるＤＯＰＡ酸化反応時間をＤＯＰＡ−ＧＡ法に採用した。Ｂ．結果（１）ＤＯＰＡ−ＧＡ法のためのＤＯＰＡオキシダーゼ反応時間 ＤＯＰＡ−ＧＡ法におけるメラノサイトの蛍光強度は、ＤＯＰＡ反応時間によって変化した（図１−Ａ）。正常メラノサイトにおける蛍光強度が最も高く、最もクリアな場合が、ＤＯＰＡ−ＧＡ法において、ベストなＤＯＰＡ反応時間であると決定された。反応時間は、０分（ネガティブコントロール、ＤＯＰＡ反応なし）から３０分までの範囲において試験され、反応時間３０分後、いかなる反応もメラノサイトにおいては検出することはできず、反応時間５分の場合が、ベストな時間であると判断した。さらに、反応時間１０分で、細胞質からの散乱蛍光が観測された（図１−Ａ）。正常皮膚において、ＤＯＰＡ−ＧＡで検出されたメラノサイトは、Ｌ−Ｂ法を使った、ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ 反応においてよりも、よりクリアに観測された（図１−Ｂ−１及びＢ−３）。メラノサイトの樹状突起に関しても、ＤＯＰＡ−ＧＡ法での全スライドにおいて、明確に観測された（図１−Ｂ−２及び４）。（２）他の酸化反応による非特異性ＤＯＰＡ陽性細胞 メラノサイト以外の炎症性細胞が図１−Ｃ−２に示されており、Ｌ−Ｂ法において、これらの細胞は、非特異的な偽陽性であることが示された（矢印部分）。しかしながら、偽陽性細胞はＤＯＰＡ−ＧＡ法では観測されなかった（図１−Ｃ−１）。（３）各ケースにおけるＤＯＰＡ−ＧＡ陽性細胞の特徴 全腫瘍メラノーマにおいて、蛍光強度は、極めて強く（図２−１：リンパ節への転移、及び、図２−３：原発性腫瘍）、多くの細胞に渡って（核を除く）観測された。悪性細胞は、Ｌ−Ｂ法よりもＤＯＰＡ−ＧＡ法によって、より明確に写し出された（図２−２、図２−４）。また、悪性メラノーマにおけるＤＯＰＡ−ＧＡ−陽性細胞の数は、Ｌ−Ｂ法による陽性細胞の数と比べて多かった（図２−３，２−４）。母斑細胞性母斑の場合において、豊富なメラニン色素を含むメラノサイトが、真皮中で観測されたが、ＤＯＰＡ−ＧＡ法による蛍光強度は、検出されなかった。表皮下では正常メラノサイトのみが検出可能であった。また、正常メラノサイトの数は、Ｌ−Ｂ法の場合と比べて、より明確に観測された。なお、過剰なメラニン色素のため、Ｌ−Ｂ法により、真皮中の陽性細胞を判断するのは困難だった（図２−５，６）。色素異常症は、全基底層における変性したメラノサイトの蛍光を示し（図２−７，２−８）、これらのメラノサイトは特有の形態的特徴を示した。これらの細胞は、図１−Ｂ−４で示されるように、正常メラノサイトと比べて、形成異常を示した。さらに、変性したメラノサイトは、Ｌ−Ｂ方法あるいは、ヘマトキシリン−エオジン染色法において、はっきりと観測されなかった。（４）悪性メラノーマにおける正常皮膚の切除マージン 真皮乳頭層の水平方向の薄片において、ＤＯＰＡ−ＧＡ陽性細胞の活性が、全真皮乳頭層において観測され、垂直方向の切片においても乳頭層に多くのメラノサイトが観察された。 ＤＯＰＡ−ＧＡ陽性メラノサイトは、全基底層において観測された。反対に、Ｌ−Ｂ法によって観測すると、正常皮膚のものと同様であった。このような結果は、３症例の悪性メラノーマのうち２症例において観測された。 Ｌ−Ｂ法もチロシナーゼ活性を反映するが、ＤＯＰＡ−ＧＡ法のほうがメラノサイト及びメラニン性腫瘍におけるチロシナーゼ活性の感度及び特異性は優れている。また、Ｌ−Ｂ法の場合、ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ反応は、自己酸化又は／及び内因性のペルオキシダーゼが原因で、非特異的な偽陽性反応になることが知られている［１０，１１］。他の従来のＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ反応においても、他の酸化反応と共に偽陽性反応が観察されていた。これらの従来法と比較すると、ＤＯＰＡ−ＧＡ法は、メラノサイトとメラニン性腫瘍のみを検出し、約３０分以内に診断をつけることができる。 ＤＯＰＡ−ＧＡ法は、ＧＡ法とＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ 反応を組み合わせたものである。ＤＯＰＡ酸化は、メラニン形成の初期反応であり、ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）は、メラニン形成にとって重要な酵素である。ＤＯＰＡ−ＧＡ法のメカニズムとして、メラノサイトがＤＯＰＡに晒されると、内因性のｄｏｐａデカルボキシラーゼ活性によって、ドーパミン及びノルエピネフリンがより多く産生され、これらのカテコラミンはグリオキシル酸で検出することができると考えられている。ＧＡ法では、ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ反応がない場合、メラノサイトは検出されない（ＤＯＰＡ−ＧＡ ネガティブコントロール）。このことは、ＧＡ法の場合、ＤＯＰＡが反応して５分以内に陽性分子が産生されることを示唆している。ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅの反応時間が長くても（３０分以上）、メラノサイトは検出されない。このことは、ＧＡ法の場合、ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅの反応進行に伴い標的分子が消滅することを示唆している。ＧＡ法の場合、ドーパクロム又はジヒドロキシインドールを含むＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ反応産生物は、非反応性分子であると思われる。我々は、ＤＯＰＡ−ＧＡ法で検出される蛍光産生物は、ＤＯＰＡ、ドーパキノン及びドーパミンのどれか又はこれらの全てあると推測している。なぜなら、これら３つの産生物の蛍光特性は、同じ波長にあるからである（励起：４１０、発光：４８０）。上記の理由により、ＤＯＰＡ−ＧＡ法で、メラノサイト及びメラニン性腫瘍内の分子を検出すると、これら３つの産生物のうち一つ又は全てを検出することができる。このことは、基質−酵素の生物学的関係性から、蛍光産生物が間接的にチロシナーゼ活性を反映することを示唆している。 ＤＯＰＡ−ＧＡ法において、メラニン色素産生物の量とその蛍光強度は、反比例の関係にある。メラニン色素産生物の量が多い細胞（例えば真皮内母斑）の蛍光強度は低下したが、チロシナーゼが高度に活性化された細胞では、正常のメラノサイトよりも蛍光強度が高かった（図２−１、及び５）。このことは、メラニン色素産生細胞がチロシナーゼを消費して、メラニン色素を産生することを示唆している。従って、ＤＯＰＡ−ＧＡ法における蛍光活性は、チロシナーゼの発現量又はチロシナーゼ活性を反映すると考えられる。 悪性メラノーマの場合、断端部の正常皮膚におけるＤＯＰＡ−ＧＡ法での陽性細胞のほうが、Ｌ−Ｂ法で検出される陽性細胞よりも有意に多かった。チロシナーゼ活性もまた、メラノーマの断端部において高いと判断された。この現象は過去に全く発表がなく、今回の研究によって観察可能になった。また、メラノサイトを形態学的に観察する際、メラノサイトが増えているのか樹状突起に変化しているのかは不明であった。悪性メラノーマの場合、チロシナーゼは、腫瘍細胞だけではなく、正常組織の広範囲にわたって活性化していると考えられる。 ＦＩＦ法は、アミン及び前駆体分子を検出するために用いられる。他のＦＩＦ法では、目的のアミンは水に可溶性であることが問題点であった。これを解決したのが、Ｆａｌｃｋ−Ｈｉｌｌａｒｐ法である。Ｆａｌｃｋ−Ｈｉｌｌａｒｐ法は感度及び特異性に優れており、カテコールアミン、セロトニン、及びこれらの前駆体を極めて高度な蛍光強度を実現することができ、神経芽細胞腫、カルチノイド及び悪性メラノーマのヒト細胞にも応用されてきた。しかし、この方法論的なアプローチは複雑で時間がかかった。一方、ＧＡ（法）を用いたｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ ａｎｄ Ｓｕｒｇｅｏｎ法（ＳＰＧ法）は、迅速で感度がよく、凍結物質中におけるカテコラミンの存在を実証するのに実用的である。我々は、ＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅ反応から得られるアミンを検出するのに、ＳＰＧ法を用いたＤＯＰＡ−ＧＡ法を開発した。ＤＯＰＡ−ＧＡ法は、メラノサイト及びメラニン性腫瘍におけるチロシナーゼ活性を検出することが可能で、迅速でかつ現行法より感度が優れている。 ＤＯＰＡ−ＧＡ法は、メラノサイト及びメラニン性腫瘍におけるチロシナーゼ（一般的にＤＯＰＡ ｏｘｉｄａｓｅとして知られている）活性を反映し、この新たな試みは、特異性及び感度の点からＬ−Ｂ法よりも有効である。さらに、メラノサイト及びメラニン性腫瘍に対する通常の病理検査やメラニン形成に関わる研究に有用である。 被検細胞含有検体に３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを作用させ、次いでグリオキシル酸を反応させて蛍光強度を測定することを特徴とするメラノサイト腫瘍の検出を補助する方法。 メラノサイト又はメラニン性腫瘍細胞含有検体に３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを作用させ、次いでグリオキシル酸を反応させて蛍光強度を測定することを特徴とする被検メラノサイト又はメラニン性腫瘍細胞のチロシナーゼ活性の測定方法。

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