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| タイトル： | 特許公報(B2)_アクリジニウムエステル化合物 |
| 出願番号： | 2009003977 |
| 年次： | 2014 |
| IPC分類： | C07D 401/06,G01N 33/533 |
特許情報キャッシュ
今井 一洋 一番ケ瀬 智子 高村 則夫 安井 英子 高舘 明 増田 寿伸 武藤 勝 JP 5435963 特許公報(B2) 20131220 2009003977 20090109 アクリジニウムエステル化合物 学校法人武蔵野大学 502054196 日本電子株式会社 000004271 三好 秀和 100083806 岩▲崎▼ 幸邦 100100712 川又 澄雄 100100929 伊藤 正和 100095500 高橋 俊一 100101247 高松 俊雄 100098327 今井 一洋 一番ケ瀬 智子 高村 則夫 安井 英子 高舘 明 増田 寿伸 武藤 勝 20140305 C07D 401/06 20060101AFI20140213BHJP G01N 33/533 20060101ALN20140213BHJP JPC07D401/06G01N33/533 Ｃ０７Ｄ，Ｇ０１Ｎ ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ） 特表２００５−５３６７４８（ＪＰ，Ａ） 4 2010159236 20100722 15 20110808 田村 聖子 本発明は、マレイミド構造をスペーサー分子でアクリジン環に結合した新規なアクリジニウムエステル誘導体に関し、このアクリジニウムエステル誘導体を化学発光分析における標識として利用した標識抗体試薬に関する。 臨床検査では微量タンパク質や薬物検査に、免疫反応を使用したイムノアッセイが普及している。測定法は、発光検出器を用いる化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光検出器を用いる蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、分光光度計を用いる酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテックス免疫測定法（ＬＡＴＡ）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ）、放射性同位元素を用いるラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）などがある。 イムノアッセイにおける高感度測定は、ＲＩＡ法に代わるＥＩＡ法や化学発光法などのＲＩ（放射性同位体）を使用しない非ＲＩＡ法の進展により、ＲＩ専用施設を持たない病院でも検査が可能となり、検査の病院内実施が増大し、癌マーカーやＣ型肝炎抗体価検査など多くの検査項目の診断薬が拡大してきた。なかでも化学発光物質を標識物質とする化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）が検出感度に優れ関連学会等での評価が高い。 化学発光物質として、ルミノール、過シュウ酸エステル、アクリジニウムエステル、アダマンチルエステルなどが知られている。化学発光法は、分光光度法や蛍光法に比べて、光源や励起光を必要とせず検出器がシンプルである。検出のＳ／Ｎ比が大きく、高感度な測定が可能である。化学発光物質の量子収率は、アダマンチルエステルのひとつであるＡＭＰＰＤが０．００１９、ルミノールが０．０１７、アクリジニウムエステルが０．１２といわれており、アクリジニウムエステルを使用すると高感度化が達成される。 高分子の酵素を抗体に標識する酵素免疫測定法にくらべ、アクリジニウムエステルのような低分子の化学発光物質を抗体に直接標識する化学発光免疫測定法の方が、薬物のような低分子からホルモンなどの高分子（タンパク質、核酸、抗体、細胞、ウイルス、ほか）まで測定対象が広がり、有利である。 アクリジン誘導体であるアクリジニウムエステルは、産業界で超微量分析に役立つ高感度な発光物質として多用されている。免疫分析の分野では高い発光性を持つことから化学発光標識物質として有用である。臨床検査では化学発光測定法ＣＬＩＡとして、腫瘍マーカ、甲状腺等のホルモン、感染症、アレルギー等の診断に利用されている。 このようなアクリジニウムエステルとしては、式（３）であらわされる化合物、や、この化合物のフェニル基に置換基を導入した化合物、あるいは窒素に結合しているメチル基に置換基を導入した化合物など種々のアクリジニウムエステル誘導体が知られているが、いずれも、アクリジニウム環の２位あるいは３位に置換基を有するものではない。国際公開２００４／０１８４１８号 しかしながら、従来のアクリジニウムエステルは、発光量が十分とはいえず、より高い発光量を有するものが要望されている。さらに、従来のアクリジニウムエステルでは標識と抗体などとの結合反応で抗体の生物活性に必要な部位のアミノ基まで標識し失活させることから、一定の結合モル比で結合させにくく、結合反応に再現性が保てないという問題を有していた。 本発明は発光量をアップさせ、且つ、結合反応で結合モル比が一定した標識抗体試薬を提供することを目的とする。 すなわち、免疫発光分析等に用いる化学発光標識法において、タンパク質、抗体等に高い特異性を保持しながら十分な結合力を持った化学発光標識化合物を作製し、その化学発光を用いて安定に精度よく目的物質を検出する手段を提供するものである。 本発明のアクリジニウムエステル誘導体は化学発光と蛍光発光機能をあわせ持つアクリジニウム骨格と、タンパク質中のチオール基と特異的に反応することを期したマレイミド構造とをトリメチレンスペーサーなどで結合した構造である。すなわち、本発明は、アクリジニウム核に、スペーサーを介してマレイミド構造が結合している構造であり、一般式（１）で表されるアクリジニウムエステル誘導体である。式中の、Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、Ｒ３は、炭素数２〜６のアルキレン基、Ｘは、対イオンであり、ｎは１〜５の整数である。 また、上記のスペーサーを介してマレイミド構造の結合は、すなわち、置換基、は、アクリジン環の２位または３位に結合していることが、そして、この繰り返し数ｎは、１であることが、好ましいものである。 また、本発明は、上記のアクリジニウムエステル誘導体を抗体などに結合することにより、標識された標識抗体試薬をも包含するものである。 本発明のアクリジニウムエステル誘導体は、発光量（信号量：Ｓ）が数倍アップするとともに、抗体フラグメントのＦａｂ’のみに標識することが可能となり、一般的に、抗体のブランク値（ノイズ：Ｎ）を低下させることができる。したがって、本発明のアクリジニウムエステル誘導体により標識された標識抗体試薬は、Ｓ／Ｎ比の向上、測定感度の向上という優れた効果を奏し、また、標識抗体試薬を作製する際に、本発明のアクリジニウムエステル誘導体は標識抗体の反応結合率が均一であり、製造が容易となるという効果も有するものである。図１は、本発明の化合物１の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す図である。図２は、本発明の化合物１の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３は、本発明の化合物１のＩＲスペクトルを示す図である。図４は、本発明の化合物１のＭａｓｓスペクトルを示す図である。図５は、本発明の標識抗体試薬を用いて測定した結果を示すグラフである。 先に、発明者らは、従来アクリジニウムエステルのアクリジニウム骨格上のＣ２位およびＣ３位の少なくともいずれかに電子供与性官能基の−ＯＣＨ３を付けることにより、アクリジニウムエステルの擬似塩基の生成を抑制して発光強度がアップすることを確認している（約１．９倍）。今回、この知見に基づいて、マレイミド構造をトリメチレンなどのスペーサーで結合したアクリジニウムエステルを合成し、このアクリジニウムエステルを標識物質として、抗体などに結合した新規な標識試薬を開発した。 本発明のアクリジニウムエステル誘導体は、一般式（１）で示されるものである。 式中のＲ１としては、炭素数１〜６の直鎖状あるいは分岐状のアルキル基であり、好ましくは、炭素数１〜３のアルキル基であり、特に、メチル基、エチル基が原料入手の容易さという点で好ましい。 Ｒ２としては、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基であり、置換基としては、メチル基のようなアルキル基、メトキシ基のようなアルコキシ基が好ましく、具体的には、フェニル基、トリル基、キシリル基、メトキシフェニル基、ナフチル基、などが挙げられ、フェニル基が合成の容易さという点で好ましい。 Ｒ３としては、炭素数２〜６の直鎖状あるいは分岐状のアルキレン基であり、好ましくは、炭素数２〜４のアルキレン基であり、特に、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が水溶性を高めるという点から好ましく、また、繰り返し数ｎは、１〜５の整数であり、好ましくは１〜３が、特に１が、良好な結晶を与えるという点で好ましい。 なお、この置換基、は、アクリジン環の２位または３位に結合していることが好ましく、特に２位であることが、発光強度の向上という点で好ましい。 また、Ｘ−は、対イオンを示し、例えば、Ｉ−、ＦＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−などがあり、ＦＳＯ３−が良好な結晶を与え、その結晶が水溶性である点で好ましい。 本発明のアクリジニウムエステル誘導体は、マレイミド基を有するアクリジン系のエステル類を合成した後、アクリジンの窒素をアルキル化（４級化）することにより得られる。このようなアクリジニウムエステル誘導体として、例えば、式（２）で示される化合物（２−（３−（２，５−ジオキソ−２Ｈ−ピロール−１（５Ｈ）−イル）プロポキシ）−１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウム スルホフルオリデート）を例として、具体的な合成法の一例を示すと、以下の合成スキームが例示される。 また、この合成スキームからもわかるように、例えば、化合物２を合成する際のスペーサーとなる化合物を、化合物６を合成する際のエステル化される化合物を、そして、窒素をアルキル化して化合物１を合成する際のアルキル化剤を、変更することにより、本発明の一般式（１）で示されるアクリジニウムエステル誘導体を得ることができる。 また、アクリジニウム環の３位に置換基を有する誘導体は、例えば、下記の化合物２’を原料として、同様に合成することができる。 このようにして合成された、アクリジニウムエステル誘導体は、従来のものに比べ、発光量が大きく化学発光分析の有効な標識物質となる。次に、このアクリジニウムエステル誘導体を抗体などに結合して作製される、アクリジニウムエステル誘導体により標識された標識抗体試薬について説明する。 本発明のアクリジニウムエステル誘導体は、マレイミド基を介して、タンパク質中のチオール基（メルカプト基）と反応することによりタンパク質に結合することができる。そのため、従来のアクリジニウムエステル誘導体のようにアミノ基を介して結合するものの欠点であった、標識と抗体との結合反応に際して、抗体の生物活性に必要な部位（抗原認識部）にあるアミノ基まで反応してしまい、特異性の低下や失活させること、また、一般に抗体中にはアミノ基が多数存在するために、一定の結合モル比で特異的にアミノ基と結合させることができず、再現性が保てないという問題を回避できる。 本発明の標識抗体試薬に用いる抗体としては、メルカプト基を有するものであり、このような抗体としては、抗体を還元して得られる、Ｈ鎖とＬ鎖の二量体であり補体結合部位等が残っているいわゆる還元型抗体、あるいは、抗体をペプシンで消化し、次いで、温和な条件下で還元剤で処理して得られる、いわゆるＦａｂ’フラグメントを用いることが好ましい。 本発明のアクリジニウムエステル誘導体による抗体の標識、すなわちアクリジニウムエステル誘導体と抗体との結合は、通常のアミノ基を介する結合方法とほぼ同様に行うことができるが、本発明がメルカプト基と反応させることを考慮すると、特に、以下のような条件下で、反応させることが好ましい。 反応は、アクリジニウムエステル誘導体が不安定となるアルカリ性溶液を避け、ｐＨ５〜７、好ましくはｐＨ６〜６．５の水溶液中で、温度１〜３７℃、好ましくは４〜１０℃で、３０分から４８時間、好ましくは３０分から２０時間程度で行い、次いで、得られたアクリジニウムエステル誘導体で標識された抗体を、ゲルろ過クロマトグラフィーなどで未反応物質を除去して標識抗体試薬を得る。 このようにして調製された標識抗体試薬は、アクリジニウムエステル誘導体と抗体を一定の結合モル比で結合させることができ、反応に関与するメルカプト基も制限されることから、再現性のある標識抗体試薬が得られる。 本発明の標識抗体試薬は、抗体の抗原に対する特異性を考慮して、抗体を選択することにより、化学発光を利用して、腫瘍マーカーやＣ型肝炎抗体価検査など種々の臨床検査に使用することができる。 次に実施例により、本発明のアクリジニウムエステル誘導体および標識抗体試薬を詳細に説明する。 １．アクリジニウムエステル誘導体の合成 まず、前記した合成スキームに従い、式（２）で示される化合物１を合成した、合成スキームに示される各化合物の合成について、以下に、順を追って説明する。 （１）化合物３の合成 化合物２（３．６８ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、氷冷撹拌下にジイソプロピルエチルアミン（４．６０ｍｌ、２６．４ｍｍｏｌ）とクロロメチルメチルエーテル（４．６０ｍｌ、１５．８ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、冷却バスをはずして室温下に３０分間撹拌し、さらに１時間加熱還流した。反応溶液を室温まで冷却してから減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製して化合物３を得た（３．３０ｇ、１０．２ｍｍｏｌ、７７％）。 １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ ７．５４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、６．８０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．６２（ｓ，２Ｈ）、４．０４（ｔ，Ｊ＝ ６．０ Ｈｚ，２Ｈ）、３．７０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．３４（ｓ，３Ｈ）、２．０６（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）； ＥＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１５ＩＯ３ ３２２．０、ｆｏｕｎｄ ３２２．０。 （２）化合物４の合成 イサチン（１．００ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を窒素気流下ジメチルホルムアミド（３５ｍｌ）に溶解し、水素化ナトリウム（〜７０％、０．２８ｇ、８．２０ｍｍｏｌ）を加えて室温下に３０分間撹拌した。ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解した化合物３（３．３０ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を加えてさらに１６０℃で１４時間撹拌した。反応溶液を室温まで冷却してからクロロホルム（８０ｍｌ）で希釈し、セライトろ過した。ろ液を減圧下に濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１３０ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製して化合物４を得た（２．１ｇ、６．１ｍｍｏｌ、９０％）。 １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ ７．６８（ｄｄ，Ｊ＝７．２，０．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．５２（ｄｔ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．３１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．１５（ｄｔ，Ｊ＝７．２，０．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．０６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）、６．８３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、４．１３（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．７４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．３７（ｓ，３Ｈ）、２．１１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）； ＥＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ１９ＮＯ５ ３４１．４、ｆｏｕｎｄ ３４１．１。 （３）化合物５の合成 封管中に入れた化合物４（０．７４ｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を１０％水酸化カリウム水溶液（７．５ｍｌ）とともに１６０℃で４時間加熱撹拌した。反応溶液を室温まで冷やした後に氷冷し、濃塩酸を用いてｐＨ２まで酸性化した。生じた黄色析出物を吸引ろ過により集めて水洗、乾燥し、化合物５を得た（０．６９ｇ、２．０２ｍｍｏｌ、９３％）。 ＥＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ１９ＮＯ５ ３４１．１、ｆｏｕｎｄ ３４１．２。 （４）化合物６の合成 化合物５（０．６９ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）をピリジン（１５ｍｌ）に溶解し、氷冷撹拌下トシルクロリド（０．７７ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、フェノールのピリジン溶液（１．０Ｍ、４．０ｍｌ）を加え、室温にて２４時間撹拌した。反応溶液を減圧下に濃縮し、トルエン共沸した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル２５ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）で精製して化合物６を得た（黄色結晶、ｍｐ１１４−１１５℃：０．７３ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、８７％）。 １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ ８．２６（ｍ，１Ｈ）、８．１９（ｍ，２Ｈ）、７．７６（ｍ，１Ｈ）、７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．５３（ｍ，３Ｈ）、７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．３７（ｍ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，２Ｈ）、４．２５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．７７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．３４（ｓ，３Ｈ）、２．１７（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ １６６．２４、１５７．７２、１５０．４５、１４６．８０、１４６．０２、１３２．７４、１３１．６１、１３０．０６、１２９．８５、１２９．０９、１２７．５５、１２６．５８、１２５．９７、１２４．３２、１２３．７２、１２２．７８、１２１．３９、１００．６０、９６．４３、６５．０２、６３．８８、５５．１５、２９．３５； ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）２８８８、１７５１、１６２３、１４５７、１２１８、１１６８； Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｄ： Ｃ ７１．９３、Ｈ ５．５５、Ｎ ３．３６、ｆｏｕｎｄ： Ｃ ７１．９６、Ｈ ５．５８、Ｎ ３．３９。 （５）化合物７の合成 窒素気流下に化合物６（１．２５ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解し、エタンチオール（０．８９ｍｌ、１２．０ｍｍｏｌ）を加えて−１２℃で撹拌した。三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（４．１３ｍｌ、１５．０ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下し、冷却浴をはずして室温にて３０分間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍｌ）で中和、洗浄した。水層はさらに酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出した。全ての有機層をあわせて飽和食塩水（１００ｍｌ）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥してから減圧下に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル１００ｇ、クロロホルム／酢酸エチル＝４／１）で精製して化合物７を得た（黄色結晶、ｍｐ１６７−１６８℃：１．１１ｇ、２．９８ｍｍｏｌ、９９％）。 １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ ８．２７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．１９（ｍ，２Ｈ）、７．７８（ｍ，１Ｈ）、７．６４（ｍ，１Ｈ）、７．５０−７．３６（ｍ，７Ｈ）、４．２９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．９３（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．１５（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）； ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）３３０５、２９５０、１７４３、１４６１、１１７６； ＥＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ１９ＮＯ４ ３７３．１、ｆｏｕｎｄ ３７３．３； Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｄ： Ｃ ７１．６７、Ｈ ４．４６、Ｎ ６．１９、ｆｏｕｎｄ： Ｃ ７１．３９、Ｈ ４．３６、Ｎ ６．１２。 （６）化合物８の合成 化合物７（９３．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（７ｍｌ）に溶解し、トリフェニルホスフィン（１３１．１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）とマレイミド（１４５．６ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を加えて窒素気流下に−２３℃で冷却撹拌した。アゾジカルボン酸ジエチル（４０％トルエン溶液、０．２２７ｍｌ、０．５０ｍｍｏｌ）を５分間で滴下し、２０分間同温度で撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１ｍｌ）を加えてから室温に昇温させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７ｍｌ）をさらに加えて酢酸エチル（１５ｍｌ）で３回抽出した。全ての有機層をあわせて飽和食塩水（１０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥してから減圧下に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル３０ｇ、ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製して化合物８を得た（黄色結晶、ｍｐ１６５−１６６℃：８２．０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、７２％）。 １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ ８．２７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．２０（ｍ，２Ｈ）、７．７９（ｍ，１Ｈ）、７．６６（ｍ，１Ｈ）、７．６０−７．３２（ｍ，７Ｈ）、６．７１（ｓ，２Ｈ）、４．１６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．８２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、２．２１（ｑｕｉｎ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）； ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１） １７５１、１７０８、１４５０、１４０７、１２１８、１１７２； ＥＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ２０Ｎ２Ｏ５ ４５２．１， ｆｏｕｎｄ ４５２．２； Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｄ： Ｃ ７３．９８、Ｈ ５．１３、Ｎ ３．７５、ｆｏｕｎｄ： Ｃ ７３．７１、Ｈ ５．０２、Ｎ ３．６８。 （７）化合物１の合成 化合物８（１．６５ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３６ｍｌ）に溶解し、窒素気流中室温撹拌下にフルオロスルホン酸メチル（１．７６ｍｌ、２１．９ｍｍｏｌ）を加えて、さらに室温にて２４時間撹拌した。無水エーテル（１００ｍｌ）を加えて８０分間撹拌し、析出した結晶を吸引ろ過して無水エーテルで洗浄後、乾燥した。得られた結晶を水−アセトン−ジエチルエーテルから再結晶し、化合物１（黄色結晶、ｍｐ１５０℃〜ｄｅｃ．：１．５０ｇ、２．５２ｍｍｏｌ、６９％）を得た。 １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ ８．８９（ｄｄ，Ｊ＝１０．０、３．６Ｈｚ、２Ｈ）、８．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．４５（ｍ，Ｈ）、８．１３（ｍ，２Ｈ）、７．６７（ｍ、４Ｈ）、７．４７（ｍ，２Ｈ）、７．０２（ｓ，２Ｈ）、４．９３（ｂｒｓ，３Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．６８（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．１１（ｔ，Ｊ＝６．０ Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ ＭＨｚ）δ １７１．２５、１６３．７０、１５７．９０、１４９．５４、１４３．３９、１４０．０４、１３９．０５、１３７．５，１３４．６５、１３３．２８、１３０．３２、１２９．９８、１２７．５４、１２６．８２、１２４．０９、１２２．８２、１２２．１３、１２１．８６、１１９．９６、１０２．５８、６６．９８、３４．４７、３０．７４、２７．５３； ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１）１７５２、１７０６、１６２７、１２８４、１２０３； ＥＳＩ−ＭＳ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ２３Ｎ２Ｏ５ ４６７．１、ｆｏｕｎｄ ４６７．２； Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｄ： Ｃ ５９．４９、Ｈ ４．４０、Ｎ ４．７０、Ｆ ３．１９、Ｓ ５．３８、ｆｏｕｎｄ： Ｃ ５９．４２、Ｈ ４．４５、Ｎ ４．４８、 Ｆ ３．０２、 Ｓ ５．２２。 また、得られた化合物１のＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ）、ＩＲおよびＭａｓｓのスペクトルを図１〜４に示した。 ２．発光カウント値（発光量）の評価 次に、得られた化合物１（式（２））と、従来骨格のアクリジニウムエステル（式（３））との発光強度を比較測定した。 それぞれの化合物をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶解後、ＲＯ・イオン交換水で希釈し、１０−１０〜１０−１２ｍｏｌ／ｌの溶液を調製した。次いでこの溶液を用いて発光カウントを測定し、それぞれの濃度の測定結果から一次式を設定し、１．０×１０−１０ｍｏｌ／ｌにおける発光カウントを計算により算出した。測定には日本電子社製フォトンカウンティング法発光検出装置を用い、測定容器にサンプルを２０μｌ分注し、発光補助試薬ポンプで、下記組成の発光補助試薬Ａ液２００μｌと発光補助試薬Ｂ液２５０μｌとを注入し発光を開始させ、２秒間の積算発光カウント値（以下、発光量）を発光検出器で計測した。なお、使用した発光補助試薬の組成は次のとおりである。結果を、表１に示した。 発光補助試薬Ａ液：０．２０ｍｏｌ／ｌ過酸化水素、０．１ｍｏｌ／ｌ 硝酸 発光補助試薬Ｂ液：０．６３ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム 表１によれば、本発明のアクリジニウムエステル誘導体は、従来の化合物に対して、約２．２倍の発光量を示し、発光量が向上されていることがわかる。 次に、上記の化合物１を用いて抗体を標識して得た標識抗体試薬を調製し、その性能を評価した。具体的には、化合物１を用いて、アクリジニウム標識抗ＣＥＡ抗体（標識抗体試薬）を作製し、日本電子社製の免疫測定装置で、既に測定し評価済みの臨床診断項目の１つである市販の腫瘍マーカＣＥＡ測定キットを用い、作製した標識抗体試薬の反応性を確認した。なお、市販の腫瘍マーカＣＥＡ測定キットを用いた測定装置の評価では良好な再現性と直線性が確認されており、今回の評価はその測定系を用いて市販のキット内の標識試薬を本発明の新たな標識抗体試薬に置きかえてＣＥＡの希釈系列を測定して、診断領域で必要な１００ｎｇ／ｍｌ付近までの直線性を確認したものである。 ３．標識抗体試薬の作製 抗ヒトＣＥＡマウスモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＣＥＡ Ｍｕｓｅ ＩｇＧ ＭｏＡｂ、ＩＢＬ社製）４ｍｇをｐＨ３．５の０．１Ｍ クエン酸緩衝液で一晩透析した後、ブタ胃液由来精製ペプシンを０．１６ｍｇ加え、３７℃で２時間インキュベートしてマウスＩｇＧのＦｃ部分を消化させた。この消化溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０とＡｃＡ−４４カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いるゲルろ過により分画し、Ｆ（ａｂ’）２が含まれる分画を回収して、限外ろ過で濃縮した。濃縮の際、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ６．０（以下、ｐＨ６．０緩衝液）でバッファー置換して０．５ｍｌ中にＦ（ａｂ’）２ ０．８５ｍｇを得た。 次いで、Ｆａｂ’化をするために、この溶液に２−メルカプトエチルアミン０．６３ｍｇを添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。その後、ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）と、溶離液としてｐＨ６．０緩衝液を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、ｐＨ６．０緩衝液０．６５ｍｌ中に０．５４ｍｇのＦａｂ’を得た。 ＳＨ基定量するために、得られたＦａｂ’溶液の一部を分取し、５ｍＭ ４，４’−ジチオジピリジンを加えて１０分間反応させた後、４−メルカプトピリジンの吸収波長３２４ｎｍで吸光度を測ることで、Ｆａｂ’内に存在するメルカプト基を測定した。その結果Ｆａｂ’１分子にメルカプト基が１つ存在することを確認した。 次に化合物１の１．７３ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．２８ｍｌに溶解し、これをｐＨ６．０緩衝液で１００倍に希釈して化合物１希釈液を得た。 続いてＦａｂ’０．３１ｍｇを含むｐＨ６．０緩衝液０．３１ｍｌ中に上記化合物１希釈液を０．２１ｍｌ添加し、化合物１をＦａｂ’に標識した。すなわち、Ｆａｂ’と化合物１のモル比が１：３となるように加え、４℃で２０時間、温和にインキュベートした。 インキュベート後、反応液をゲルろ過クロマトグラフィーにより過剰の化合物１を除去し、ｐＨ６．０緩衝液１．６ｍｌ中に標識抗体（化合物１標識抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’）０．１９ｍｇを含む標識抗体液を得た。 この標識抗体液１０μｌを０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ７の０．０１Ｍ 燐酸緩衝液（以下、ＰＢＳ）の２．９９ｍｌで希釈して標識抗体試薬を得た。 なお、標識抗体試薬の作製において、Ｆａｂ’フラグメントのメルカプト基と化合物１のマレイミド基との特異的反応により、抗体に対する標識物質の結合率を均一とすることができ、再現性が良く、結合特異性に優れた標識抗体試薬の製造が容易に行えるようになった。 ４．標識抗体試薬のＣＥＡに対する希釈直線性の測定 上記の標識抗体試薬を用いて、腫瘍マーカのＣＥＡに対する標識抗体試薬の反応性を評価した。測定は、日本電子社製の免疫測定装置で行い、サンプルにＣＥＡ濃度９０ｎｇ／ｍｌの１／６、２／６、４／６、６／６希釈系列を用いて、ＣＥＡ希釈系列に対する発光量を求めた。サンプル２０μｌ、固相化抗体試薬（市販の腫瘍マーカＣＥＡ測定キット）１００μｌ、作製した標識抗体試薬２０μｌをテストチューブに分注し、３７℃で１５分間インキュベートする。その後、結合しなかった遊離物質を洗浄・除去して、発光補助試薬Ａ液２００μｌと発光補助試薬Ｂ液２５０μｌを注入し発光を開始させ、２秒間の発光量を発光検出器で計測した。 各ＣＥＡ濃度と発光量の結果を表２に示した。また、ＣＥＡに対する希釈直線性を図５に示した。 表２および図５によると、本発明の標識抗体試薬は、一般的に診断領域で必要とされるＣＥＡ濃度９０ｎｇ／ｍｌ付近までの直線性を示し、診断に有用であることがわかった。 一般式（１）で表されるアクリジニウムエステル化合物。［式中、Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基、Ｒ３は、炭素数２〜６のアルキレン基、Ｘは、対イオンであり、ｎは１〜５の整数である］ 置換基、が、アクリジン環の２位または３位に結合している、請求項１に記載のアクリジニウムエステル化合物。 ｎが１である請求項１または請求項２に記載のアクリジニウムエステル化合物。 請求項１〜３のいずれかに記載のアクリジニウムエステル化合物により標識された標識抗体試薬。