生命科学関連特許情報
| タイトル： | 特許公報(B2)_クルミとピーカンナッツの分別検出方法 |
| 出願番号： | 2008556158 |
| 年次： | 2013 |
| IPC分類： | C12Q 1/68,C12N 15/09 |
特許情報キャッシュ
矢野 竹男 酒井 裕美子 内田 浩二 中尾 義喜 石畑 公江 仲野 茂 山田 敏広 JP 5208772 特許公報(B2) 20130301 2008556158 20080130 クルミとピーカンナッツの分別検出方法 オリエンタル酵母工業株式会社 000103840 日清食品ホールディングス株式会社 000226976 松本 久紀 100097825 矢野 竹男 酒井 裕美子 内田 浩二 中尾 義喜 石畑 公江 仲野 茂 山田 敏広 JP 2007022175 20070131 20130612 C12Q 1/68 20060101AFI20130527BHJP C12N 15/09 20060101ALI20130527BHJP JPC12Q1/68 AC12N15/00 A Ｃ１２Ｑ １／６８ Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０ ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ） ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩ） 特開２００６−３３３７２９（ＪＰ，Ａ） Eur.Food Res.Technol.,Vol.223(2006)p.373-377 American Journal of Botany, 2000, 87(6), p.872-882 3 JP2008051454 20080130 WO2008093753 20080807 9 20101209 三原 健治 本発明は、クルミとピーカンナッツの分別検出方法に関するものであり、更に詳細には、遺伝子を利用して簡便且つ正確に両者を分別、検出できる新規にして有用な方法である。 クルミ（ｗａｌｎｕｔ）とピーカンナッツ（ｐｅｃａｎｎｕｔ：ペカンナッツともいう）は、いずれも食用クルミ科ナッツであって食用に供されるものである。そして、クルミに関しては、日本においてもクルミアレルゲンに対する患者数が増加していることから、日本商品標準分類（総務庁）での「クルミ」はアレルギー表示推奨品目に指定され、その検出方法の開発が急がれている。 一方、ピーカンナッツは、同じ食用クルミ科ナッツでありながら、日本商品標準分類では、クルミには分類されていない。日本商品標準分類 クルミ： 穀果類→その他穀果類→くるみ ピーカンナッツ：穀果類→その他穀果類→他に分類されない穀果類 このように両者はその分類が相違しているため、両者を分別することが必要となる。また、アレルゲン性については、両者は共通しているにもかかわらず、表示についてはクルミが推奨されているにすぎないが、アレルギーが発症したとき、アレルゲンがクルミなのかピーカンナッツであるのか特定する必要が出てきた。 そこで、最近開発されたＥＬＩＳＡによるクルミアレルゲン検出系を適用したものの、クルミとピーカンナッツの両アレルゲンを検知してしまい、両者を分別、検出することはできなかった。このように、免疫化学的手法では、クルミのみを特異的に検出することは非常に困難であることが示された。たしかに、クルミアレルギー患者にとっては、食品中のクルミアレルゲンの検出方法としては、その方法は非常に有益である。しかし、日本では、食品表示の観点から、そしてまた、近年のピーカンナッツの輸入量の増加に伴い、クルミとピーカンナッツの分別方法の必要性は更に高まっている。 最近、ヨーロッパの研究チームによって、ＰＣＲによるクルミの特異的検出方法が報告された（非特許文献１）。しかし、その方法はキャピラリータイプのリアルタイムＰＣＲであり、日本の食品分析で行われている標準方法であるブロックタイプＰＣＲではない。日本におけるＰＣＲによる食品分析は、特定の遺伝子を標的にしたブロックタイプのＰＣＲが主流であり、この方法を利用して、コムギ、ソバ、ラッカセイ、ダイズ、キウイの検出方法が既に確立されている（非特許文献２）。 食物アレルギーを引き起こす可能性のある食用植物については、本発明者らも、該植物を特異的に検出できるプライマーを、それらのクロロプラストのｍａｔＫ（ｍａｔｕｒａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ）遺伝子をもとに新たに設計し、これらのプライマーを用いてＰＣＲ法によって試料中のクルミの検出に成功した（特許文献１）。 本発明者らが開発した上記方法は、ブナ目クルミ科クルミ属のクルミＤＮＡの他、同属のオニグルミＤＮＡ、ペルシャグルミＤＮＡ、及び同科プロテカリア属のサワグルミＤＮＡを検出できる点で卓越している。しかしながら、近縁種である同目同科ペカン属のヒッコリーＤＮＡ、同目カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツＤＮＡ、同目ブナ科クリ属のクリＤＮＡや、他の植物を含むその他の生物種ＤＮＡは検出しないことが強く示唆されている。 そして、上記した先願発明においても、食用クルミと近縁種であるブナ目クルミ科ペカン属の食用ピーカンナッツとを分別、検出することについては、何も記載されていない。両者の正確、簡便分別、検出に成功したのは本発明が最先である。 植物分類は、次のとおりである。 食用クルミ： Ｆａｇａｌｅｓ（ブナ目）；Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ（クルミ科）；Ｊｕｇｌａｎｓ（クルミ） ピーカン：Ｆａｇａｌｅｓ（ブナ目）；Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ(クルミ科)；Ｃａｒｙａ（ペカン） ヘーゼル：Ｆａｇａｌｅｓ(ブナ目)；Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ（カバノキ科）；Ｃｏｒｙｌｕｓ（ハシバミ） 標的遺伝子（ｍａｔＫ）情報は、次のとおりである。なお、カッコ内はＧｅｎｅ Ｂａｎｋ のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒを示す。 クルミ ：Ｊｕｇｌａｎｓｘ ｎｉｇｒａ（ＡＦ１１８０３６）、Ｊｕｇｌａｎｓ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ＡＦＩ１８０２７） ピーカン ：Ｃａｒｙａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ（ＡＦＩ１８０３９） ヘーゼル ：Ｃｏｒｙｌｕｓ ｕｂｅｌｌｕｎａ（ＡＹ３７３４４５） 食用ピーカン ：Ｃａｒｙａ ｉｌｌｉｎｏｅｎｓｉｓ遺伝子情報未登録Ｅｕｒ． Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ２２３， ３７３−３７７（２００６）Ｊ． Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍ．， ３０， ２１５−２３３（２００６）特開２００６−３３３７２９ 本発明は、クルミとピーカンナッツを正確、簡便に分別、検出する方法を新たに開発する目的でなされたものである。 上記目的を達成するため、本発明者らは、本発明者らに係る上記先願発明について、再度検討を行った。すなわち、先願発明においては、ｍａｔＫ遺伝子に着目し、クルミ科ナッツの特異的検出のためのＰＣＲ用プライマーをデザインした（配列番号２、３）。このプライマーセット（図２）の特異性を確認した。その結果、このプライマーセットを使用したＰＣＲで、クルミ科ナッツを特異的に検出できること、すなわち、クルミもピーカンナッツもともに検出することができた（図３）。更に、クルミとピーカンナッツの精製ＤＮＡで該プライマーでのＰＣＲの検出限界を確認したところ、両者の検出感度は同程度であることが確認され（３５サイクルで０．１ｐｇ（１０ｐｐｍ相当）以下）、結局、上記先願発明方法ではクルミとピーカンナッツを分別することは不可能であることが判った。 しかしながら、現在の日本商品標準分類では、ピーカンナッツはクルミに分類されておらず、したがって、ピーカンナッツとクルミの分別検出方法の確立が必要である。そこで本発明者らは、各方面から検討の結果、再度、先願発明に係るｍａｔＫ遺伝子に着目した。 ブナ目クルミ科ペカン属としては、Ｃａｒｙａ ｉｌｌｉｎｏｅｎｓｉｓ、Ｃａｒｙａ ｍｙｒｉｓｔｉｃａｃｆｒｍｉｓ、Ｃａｒｙａ ｐａｌｌｉｄａ、Ｃａｒｙａ ｔｅｘａｎａ、Ｃａｒｙａ ｏｖａｔａ、Ｃａｒｙａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａが知られているが、該発明の標的遺伝子であるｍａｔＫの配列が既知のものはＣａｒｙａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａのみである。食用ナッツとしては利用されている種類はＣａｒｙａ ｉｌｌｍｏｅｎｓｉｓ（ｍａｔＫ 未知）であり、その他は木材として利用されている種類である。 このように食用ピーカンナッツであるカルヤ・イリノエンシス（（Ｃａｒｙａ ｉｌｌｉｎｏｅｎｓｉｓ）ではｍａｔＫ遺伝子の配列が未知である。そこで、本発明者らはピーカンナッツのｍａｔＫ遺伝子の解析を行い、その遺伝子配列を同定した。その塩基配列を配列番号１（図１）に示す。本配列と木材用ペカン（Ｃ．トメントーサ：ヒッコリー）のｍａｔＫ遺伝子配列と比較したところ、相違することが明らかとなり、また、クルミｍａｔＫ遺伝子とは１塩基の違いがあることも明らかとなり、ピーカンナッツのｍａｔＫ遺伝子は、従来未知の新規配列であることが確認された。 本発明者らは、クルミとピーカンナッツのＰＣＲで増幅される遺伝子領域でのわずか１塩基の相違（５’側から１５番目の塩基：クルミがシトシン（Ｃ）であるのに対してピーカンナッツではアデニン（Ａ）に置換している）にあえて着目し、このわずか１塩基の違いによる両者の分別という技術課題を新たに設定した。 そこで、本発明者らは、同定した配列情報を基に、クルミとピーカンナッツの分別の可能性を検討するため、新たに同定した食用ペカン（Ｐｅｃａｎ ｎｕｔ）のｍａｔＫ遺伝子と既知のクルミ（Ｗａｌｎｕｔ）ｍａｔＫ遺伝子及び木材用ペカン（Ｈｉｃｋｏｒｙ）のｍａｔＫ遺伝子配列を比較検討した（図１）。 その結果、上記わずか１塩基の置換によって、ピーカンナッツではクルミ遺伝子配列中に存在する制限酵素ＢｆａＩの部位が消失していることを発見した。また、木材用ペカン品種では、制限酵素ＢｆａＩの部位の他、クルミとピーカンナッツ共通に存在する制限酵素ＡｃｌＩの部位も消失していることを発見した。以上の発見を基に、制限酵素を利用して、クルミとピーカンナッツの分別の可否を検討し、可能であることを証明した。 すなわち、制限酵素ＢｆａＩとＡｃｌＩを利用することで、クルミとピーカンナッツの分別検出ができるとの観点にたち、本発明者らは、このことを検証するため、クルミＤＮＡから増幅させた増幅産物とピーカンナッツから増幅させた増幅産物とを用いて制限酵素による切断を行った。その結果、クルミとピーカンナッツのＰＣＲで増幅される遺伝子領域にはＡｃｌＩ部位が共通して存在していること、クルミのＰＣＲで増幅される遺伝子領域にはＢｆａＩの制限酵素部位が存在するが、ピーカンナッツのＰＣＲで増幅される遺伝子領域ではＢｆａＩの制限酵素部位が消失していること、を確認した（図４）。 すなわち、アガロースゲル電気泳動図からも明らかなように、ＢｆａＩ処理した後、ＢｆａＩサイトを有するクルミにおいては、切断されてクルミ特異断片（４０ｂｐ、８０ｂｐ）の２本のバンドが認められるのに対して、該サイトを有していないピーカンナッツでＢｆａＩ処理によっても切断されることなく１２０ｂｐのバンドが１本認められるだけであることが確認された。 このことは、ピーカンナッツとクルミとが、ｍａｔＫ遺伝子のわずか１塩基の相違によって分別できること、しかもその配列を直接比較しなくても、それぞれのＰＣＲ産物を制限酵素ＢｆａＩ処理し、処理物の電気泳動パターンを比較するだけで簡単且つ正確に分別できることを明示するものであり、本発明は、これらの有用新知見に基づき更に研究の結果、遂に完成されたものである。 近年、日本において、クルミアレルゲンに対する患者数の増加および食用クルミ科ナッツであるペカンナッツの輸入量の増加に伴い、クルミとナッツの分別方法の開発が急がれていた。我々は遺伝子配列の明らかな、クロロプラストｍａｔＫ遺伝子に着目し、クルミ科ナッツの特異的検出のためのＰＣＲ法を開発し、さらに、クルミとピーカンナッツの分別のため、ピーカンナッツｍａｔＫの配列を明らかにし、制限酵素を用いた、クルミとピーカンナッツの分別法を確立した。 本発明を実施するには、クルミ科ｍａｔＫ遺伝子において配列番号１（図１、その中段（Ｐｅｃａｎ ｎｕｔ）にその配列を示す）の塩基配列で５’側から１５番目の１塩基を検討すればよく、具体的には各試料からｍａｔＫ遺伝子を分離して１５番目の塩基がＡであるかＣであるかをその配列から直接確認してもよく、あるいはＳＮＰｓ解析技術、たとえばＳＭＡＰ法（理研）を利用してこれを実施することも可能である。 また、本発明は、上記のようにｍａｔＫ遺伝子の配列自体を直接検討することなく、ＰＣＲ法によって簡便に且つ迅速に、しかもそれでいて正確に両者を分別、検出することができる。 プライマーとしては、配列番号２の塩基配列で示されるＤＮＡをセンスプライマー、配列番号３の塩基配列で示されるＤＮＡをアンチセンスプライマーとして用いる（図２）。これらのプライマーは、先願発明においてクルミ用に本発明者らが開発したものであるが、ピーカンナッツにも利用できる点で特徴的である。 これらのＤＮＡをプライマーとして用い、試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは常法によればよく、例えば、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標）ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。増幅反応条件は以下のとおりである。：９５℃、１０分間のプレインキュベーション；９５℃で０．５分間保持、６４℃で０．５分間アニーリング、７２℃で０．５分間エクステンション、７２℃で７分間の最終エクステンションからなる増幅サイクルを３５回実施する。 このようにして得たＰＣＲ増幅産物については、その塩基配列を確認し、既述したｍａｔＫ遺伝子の場合と同様に特定１塩基を検討することによって両者の分別検出が可能となる。また、ＰＣＲ産物の配列を検討するまでもなく、制限酵素ＢｆａＩで処理した後、ＰＣＲ断片を電気泳動で検討することによっても、両者の分別検出が迅速且つ正確に行われる。 以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。（実施例１） （１）配列番号２（図２上段）、配列番号３（図２下段）の塩基配列でそれぞれ示されるＤＮＡからなるプライマーを用い、各試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、常法によって行い、例えば既述した条件で行うことができる。 ＰＣＲ反応終了後、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ増幅産物を分離し、分離後のゲルをエチジウムブロマイドで染色後、ＵＶ照射下において増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとして１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）を使用した。これらのＰＣＲの結果を図３に記載した。その結果、ピーカンナッツ（レーン７）及びクルミ（レーン８）のいずれも同一パターンを示し、単なる電気泳動では両者は分別できないことが確認された。 （２）そこで、ＰＣＲ産物の配列を確認することとした。配列確認方法は、次のとおりである。ピーカンナッツ（Ｃａｒｙａ ｉｌｌｉｎｏｅｎｓｉｓ）のｍａｔＫ遺伝子配列は未知であるので、スタンダードＰＣＲクローニング技術によってその配列を同定した。 ピーカンナッツ（Ｃａｒｙａ ｉｌｌｉｎｏｅｎｓｉｓ）のｍａｔＫ遺伝子配列は未知であるため、ＰＣＲ産物の塩基配列を確認することとした。塩基配列の確認方法は常法のＴＡクローニング技術（Ｍａｒｃｈｕｋ，Ｄ，Ｄｒｕｍｍ，Ｍ，Ｓａｕｌｉｎｏ，Ａ．， ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ，Ｓ，Ｎｕｃｌｗｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９ １１５４，１９９１）によってその塩基配列を決定した。 具体的には、公知であるクルミｍａｔＫ塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃ＡＦ１１８０２７）に照らして、クルミプライマーの外側の領域でプライマーセット（センスプライマー：クルミＡＦ１１８０２７の３７８から４０２番目、すなわち、ＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＡＴＣＣＴ、アンチセンスプライマー：クルミＡＦ１１８０２７の１２９５から１３１９番目、すなわち、ＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＡＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡ）を設計した。そのプライマーセットを用いてピーカンナッツＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物のクローニングはＴＡクローニング用キットＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社登録商標）を用いて行った。キットに添付されているクローニング用ベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）にＰＣＲ産物を組み込み、当該クローニング用ベクターで宿主大腸菌（ＪＭ１０９）を常法に従い形質転換を行った。 当該ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が組込まれているため、アンピシリンを含むＬＢプレートで培養することで当該ベクターが導入された宿主のみを選択できる。得られたコロニーから任意に１０個を選択し、ベクターにＰＣＲ産物遺伝子が組込まれているか否かをプライマーセットを用いたコロニーＰＣＲ法で確認した。選択した全てのコロニーでＰＣＲ産物遺伝子が組込まれていたことが確認できた。 さらに、それら１０個のコロニーから任意に３個を選択し、塩基配列を確認するためＰＣＲ産物の組込まれたベクタープラスミドを精製し、当該クローニングベクターの塩基配列確認用に既に設計されているプライマー（Ｍ１３ Ｆｏｗａｒｄ（−２０）ＰｒｉｍｅｒおよびＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）を用い常法に従い塩基配列の決定を行った。確認した３クローン全てが同一の塩基配列であった。 決定したピーカンナッツｍａｔＫ遺伝子のクルミプライマーで増幅される領域の塩基配列を図１に示す。また、食用を目的として市販されているピーカンナッツ２品目、アメリカアリゾナ州産ピーカンナッツ（プロフーズ社）およびアメリカ／オーストラリア産ウェスタンシュラ種（キッチンガーデン お菓子の材料ネットスト アパテリス）からＤＮＡを抽出し、同様の方法にて塩基配列を確認したところ、２品目とも図１に示したピーカンナッツの塩基配列と一致していた。図中、Ｗａｌｎｕｔはクルミ、Ｐｅｃａｎ ｎｕｔはピーカンナッツ、Ｈｉｃｋｏｒｙはヒッコリーを示す。ピーカンナッツの配列は、従来未知の新規配列であって、その塩基配列を配列番号１に示した。 これらの配列比較から、クルミとピーカンナッツでは１５番目の塩基が１つだけ相違しているのはわかるが、わずか１塩基の違いで両者を分別検出できるとは予測できなかった。しかし、後記するように制限酵素処理によって１塩基の違いで両者が分別検出可能であることが確認された。わずか１塩基の違いで両者の分別が可能となることはまさに画期的なことであって極めて特徴的であり、高い特許性を有するものである。 したがって、両者を分別するためには、ｍａｔＫ遺伝子の配列を比較して、１５番目の塩基がＡかＣかによって両者を分別することができるし、また、ＳＭＡＰ法（理研）等によることもできる。しかしながら、本発明者らは更に簡便な方法を開発した。 （３）ＰＣＲ断片の制限酵素処理によるクルミとピーカンナッツの分別を行った。 すなわち、試料として１、３、５、７はクルミＰＣＲ断片（５０ｎｇ／ｍｌ）、２、４、６、８はピーカンナッツＰＣＲ断片（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。反応組成は、ＤＮＡ量 ２μＬ、酵素量 １μＬ（ＡｃｌＩ：３０００Ｕ／ｍｌ、ＢｆａＩ： ５０００Ｕ／ｍｌ）、全量を２０μＬとし、３７℃で３．５時間インキュベートした。制限酵素処理物は、２．５％アガロースゲルで電気泳動した（３μＬ）。 電気泳動図を図４に示す。図面の結果から明らかなように、ピーカンナッツ（レーン６）とクルミ（レーン５、７）とは一見しても明らかなようにパターンが相違しており、レーン５、７においてはＢｆａＩによって切断された２つのクルミ特異断片のパターンが示された。 この結果は、予想される断片長、すなわち、切断なしの場合は、両者とも１２０ｂｐ、ＡｃｌＩで切断した場合は、両者とも５９ｂｐ、６１ｂｐ、ＢｆａＩの場合は、クルミが４０ｂｐ、８０ｂｐであるのに対してピーカンナッツが１２０ｂｐ、ＡｃｌＩ＋ＢｆａＩの場合は、クルミが１９ｂｐ、４０ｂｐ、６１ｂｐであるのに対してピーカンナッツが５９ｂｐ、６１ｂｐであるので、予想される断片長とよく一致するものである。 したがって、ＰＣＲ産物のＢｆａＩ処理物の電気泳動処理によって、ピーカンナッツとクルミとを簡便、迅速、且つ正確に分別、検出することができるのである。クルミ科ｍａｔＫ遺伝子配列比較を示す。図中、中段（Ｐｅｃａｎ ｎｕｔ）に配列番号１の配列を示す。プライマーを示す。上段がセンスプライマー（配列番号２）、下段がアンチセンスプライマー（配列番号３）を示す。ナッツ類のＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。図中、上段が植物標準プライマーの結果（コントロールに相当する）、下段がクルミ用プライマーの結果を示す。なお、ＣＰ０３−５’、ＣＰ０３−３’は、植物ＤＮＡ検出用プライマーを指し、前者（Ｆ−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は、ＣＧＧＡＣＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＴ、後者（Ｒ−ｐｒｉｍｅｒ）の配列は、ＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＴＧＡである。これらのプライマーに関する配列及びＰＣＲ条件は、平成１８年６月２２日付けの厚生労働省医薬品食品局からの通知「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（食安発第０６２２００３号）に記載されている。ＰＣＲ断片の制限酵素処理による分別を示す電気泳動パターンの図面代用写真である。 図中、Ｗａｌｎｕｔはクルミ、Ｐｅｃａｎ ｎｕｔはピーカンナッツを示す。 クルミ科ｍａｔＫ遺伝子の特異的検出のためのＰＣＲ用プライマーを用い、試料のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物配列中の配列表の配列番号１の塩基配列で１５番目の塩基がアデニン（Ａ）の場合はピーカンナッツと判定し、同じくシトシン（Ｃ）の場合はクルミと判定すること、を特徴とするクルミとピーカンナッツの分別検出方法。 配列表の配列番号２、３の塩基配列で示されるＤＮＡをそれぞれプライマーとして用いること、を特徴とする請求項１に記載の方法。 請求項１又は２に記載のＰＣＲ産物を制限酵素ＢｆａＩで処理した後、電気泳動し、その電気泳動パターンの違いによりクルミとピーカンナッツを分別検出すること、を特徴とするクルミとピーカンナッツの分別検出方法。配列表